本文介绍了一种详细的实验方案，阐述了一种用于聚丙烯酰胺凝胶中总蛋白检测的新型荧光染色技术。该方案采用一种对银离子特异的荧光增强探针，可检测 Ag+-蛋白质复合物，克服了传统显色银染法的某些局限性。
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本文内容
摘要
摘要
银染是一种比色技术，广泛用于在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后可视化聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质条带。传统的银染方法存在一些缺点，例如背景染色高、蛋白质回收率低、重复性差、定量线性动态范围窄，以及与质谱（MS）联用时兼容性有限。现在，通过使用荧光银离子（Ag+）探针TPE-4TA，我们开发了一种用于聚丙烯酰胺凝胶中总蛋白质可视化的荧光银染方法。该新染色法避免了传统银染中繁琐的银还原步骤。此外，该荧光银染在蛋白质检测中表现出良好的重复性、高灵敏度和线性定量能力，是一种实用且有效的蛋白质凝胶染色方法。
引言
在凝胶电泳后，已有多种染色方法用于蛋白质的可视化，例如使用考马斯亮蓝等比色染料、银染、荧光或放射性标记1,2,3,4。银染法被认为是检测蛋白质最灵敏的技术之一，且所需试剂简单且成本低廉。银染法主要分为两大类：氨银染色法和硝酸银染色法5,6。在碱性氨银法中，氨和氢氧化钠形成银-二胺复合物，随后在显影过程中使用酸性甲醛溶液将其还原为金属银。该方法对碱性蛋白质染色效果良好，但对酸性和中性蛋白质的染色效果较差，且仅适用于经典的甘氨酸和牛磺酸电泳系统。相比之下，硝酸银染色法利用银离子对蛋白质（主要是侧链上的巯基和羧基）的高生物亲和力，通常对酸性蛋白质的染色更为高效7。在银离子与蛋白质结合后，使用显影液（通常由含甲醛和硫代硫酸钠的金属碳酸盐溶液组成）将银离子还原为金属银颗粒，从而形成由棕色至深色的沉淀，使蛋白质条带得以显现。
尽管银染技术自20世纪70年代问世以来，因其通用性和高灵敏度而广为人知8，但该方法常被认为操作困难。银染法包含时间受限的步骤，且重现性较低。由于银染的颜色通常不均匀，且依赖于难以控制的还原步骤，因此银染并非定量方法，故不推荐用于凝胶比较研究和蛋白质定量分析9。在灵敏度方面经过优化的方法可能使用醛类试剂，这也有助于实现更均匀的染色效果10。然而，由于醛类会引起蛋白质交联，可能会影响后续分析。快速染色方案大多通过合并或缩短步骤来节省时间，但会牺牲染色的重现性和均匀性5。因此，在蛋白质凝胶染色中存在多种银染变体，每种方法均针对特定需求进行了优化，例如操作简便性、灵敏度或下游分析所需的肽段回收率。这些特性之间可能存在相互影响，因此在一个实验方案中同时满足所有要求往往较为困难。
在本研究中，我们介绍了一种用于聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质检测的新型荧光银染方法。该方法采用一种针对银离子的荧光探针TPE-4TA（图1），以实现对银浸渍蛋白质的可视化11。TPE-4TA基于聚集诱导发光（AIE）原理设计，在水溶液中溶解时无荧光，但在银离子存在下表现出强烈荧光。通过以荧光显色步骤替代传统银染中的显色显影过程，该荧光银染法能够实现对总蛋白的稳定染色，并显著降低背景信号。
此外，荧光银染法在蛋白质定量方面表现出良好的动态线性范围，可与广泛使用的 SYPRO Ruby 染色法相媲美，而这是传统银染法所无法实现的。该凝胶可在许多生物实验室常用的凝胶成像系统上，利用紫外灯（激发波长：302/365 nm 通道；发射波长：~490 - 530 nm）进行成像。
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方案
1. 凝胶的制备
注意：本演示遵循标准方案，在 SDS-PAGE12 后尽快进行凝胶染色。简而言之，以下步骤描述了样品制备及凝胶电泳过程。
- 使用小型凝胶电泳槽，以 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液填充，采用 4% - 12% Bis-Tris 蛋白凝胶（1 mm，15 孔）进行 SDS-PAGE。
- 用去离子水、十二烷基硫酸锂（LDS）缓冲液和样品还原剂的混合液稀释样品。
- 第一孔加入两倍浓度的原液（10 µL），随后依次加入正常浓度原液（5 µL）以及原液的系列两倍稀释液（共 13 个稀释度，从 2x 到 8192x）。
- 以恒定电压 200 V 电泳 30 分钟。
2. 凝胶的固定
- 电泳结束后，将凝胶浸入含有 40% 乙醇/10% 乙酸的 100 mL 溶液中，在室温下以 50 rpm 的速度于摇床中孵育 2 次（每次 30 分钟），或在 4 °C 下过夜。
- 在洁净容器中用超纯水清洗凝胶，每次 10 分钟，共清洗 3 次。此洗涤步骤至关重要。若固定液中的乙酸未被充分去除，则在荧光显影步骤中，过量的 TPE-4TA 会被酸激活，导致凝胶中出现强烈的背景荧光。
3. 硝酸银溶液的配制3 凝胶的溶液处理与银染
- 配制用于浸渍的 0.0001% AgNO3 溶液时，首先将 0.01 g AgNO3 溶解于 10 mL 超纯水中，制备 0.1% AgNO3 储备液。随后，取 100 µL 0.1% AgNO3 储备液加入 100 mL 超纯水中，配制成工作液。
注意：AgNO3 溶液在使用前应避光保存。 - 将凝胶置于密封玻璃容器中，加入 100 mL 银工作液，在 50 rpm 条件下于轨道摇床上浸渍 1 小时。银浸渍过程必须在通风橱内进行，并用铝箔包裹以避光，此步骤至关重要。
- 在洁净容器中用超纯水（约 100 mL）清洗凝胶，每次 60 秒，共清洗 2 次。
4. 凝胶的荧光显色
- 配制染料储备液（0.1 mM）：将 3.0 mg 的 TPE-4TA 染料加入 50 mL 超纯水中。超声处理数分钟，并加入少量氢氧化钠溶液（例如 1 M）以促进染料溶解。
- 在 365 nm 紫外灯下检测溶液的荧光，以确认染料分子是否完全溶解。仅当溶液荧光极弱或无荧光发射时，表明染料已完全溶解。
注意：TPE-4TA 染料的合成方法参照 Xie et al.10 近期报道的实验方案。TPE-4TA 溶液非常稳定，避光保存可维持数月。 - 配制 100 mL 荧光显色液（10 µM）：取 10 mL TPE-4TA 储备液加入 90 mL 超纯水中。使用 pH 计检测溶液 pH，并用氢氧化钠溶液（1 µM）调节 pH 至 7–9。
- 将凝胶转移至洁净且可密封的容器中，加入 100 mL 荧光显色液，确保凝胶完全浸没于溶液中。密封容器，避光，在室温下以 50 rpm 转速于摇床中振荡过夜。或者，也可通过将 AIE 显色液预热至 80 °C 进行染色，随后在室温下静置，将孵育时间缩短至约 ~2 h。
5. 脱色与成像
- 将凝胶转移至一个洁净的容器中，加入100 mL 10%乙醇溶液，脱色30分钟。
注意：可单独使用水洗涤凝胶，但使用10%乙醇溶液脱色更为高效，可将脱色过程从数小时缩短至30分钟。 - 用超纯水冲洗凝胶5分钟。
- 使用凝胶成像系统，在365 nm或302 nm波长通道下对凝胶进行成像。
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结果
经荧光银染染色的蛋白质条带在365 nm紫外灯下显示出强烈的绿色荧光。自上而下共14条蛋白质条带（10 - 200 kDa）均清晰可见，与SYPRO Ruby染料染色的14条红色条带对应良好（图2）10。
关于蛋白质的定量检测，采用凝胶成像系统通过自动化程序对凝胶进行成像，并使用商业软件对图像进行分析和比较。该荧光银染方法表现出较高的分辨率。对于某些蛋白条带，荧光银染的灵敏度也略优于荧光SYPRO Ruby染色。特别是，荧光银染在约10至40 kDa的蛋白条带检测中性能更佳，表明该新方法在检测低分子量蛋白质方面尤为有效。数据还表明，荧光银染在较宽的蛋白质定量范围内，对全部14种蛋白质均表现出良好且一致的线性关系（图3）11。
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讨论
本文介绍一种用于聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质检测的新型荧光银染方法。该方法结合了传统的银染技术与荧光染色技术，利用银离子对蛋白质的选择性结合特性（类似于其他银染方法），并采用一种高灵敏度的荧光银探针TPE-4TA来使结合银离子的蛋白质发光。由于荧光探针TPE-4TA可在纳摩尔浓度范围内灵敏地响应银离子11，因此无需传统银染中必需的还原显色步骤即可实现高灵敏度检测，从而显著降低实验间差异。同时，该方法避免了使用甲醛和戊二醛等强刺激性化学试剂，这些试剂常会干扰质谱分析中的肽段鉴定。此外，由于TPE-4TA具有聚集诱导发光（AIE）特性，且无自猝灭问题，染料在蛋白条带处密集积累后可随染料分子数量协同发光。这使得蛋白质检测具有更宽的线性动态范围（LDR），并与SYPRO Ruby染色相比呈现更明亮的染色效果。
与传统的银染方法相比，这种新型染色技术所需的硝酸银用量显著减少——具体而言，仅需0.0001%，而常规硝酸银染色方案中报道的用量为0.1%<...
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披露
已就这种荧光银染技术提交了专利申请。
致谢
作者感谢瑞典卡罗林斯卡研究所明慧楼再生医学中心的Patrick Chan提供的技术支持。S. X. 感谢瑞典研究理事会（资助编号：2017-06344）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
LDS 样品缓冲液（4X） | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | 试剂 |
4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm，15 孔 | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | 预制胶 |
| 样品还原剂（10×） | 赛默飞世尔科技 | NP0004 | 试剂 |
| MES SDS电泳运行缓冲液（20X） | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | 试剂 |
| 小型凝胶电泳槽 | 赛默飞世尔科技 | A25977 | 设备 |
| 300 W 电源（230 VAC） | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | 设备 |
| 未染色蛋白质标准品 | 赛默飞世尔科技 | 26614 | 样品 |
| 硝酸银 | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | 试剂 |
| 乙醇 | Bragg 等人 | 42520J | 试剂 |
| 乙酸 | J.T. Baker | 103201A | 试剂 |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | 提供 18.2 MΩ厘米水柱 |
| 凝胶成像系统（c600 型号） | Azure Biosystems | - | 仪器设备 |
参考文献
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
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- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
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重印与许可
