利用高含量成像对增强细胞中的目标参与进行量化

摘要

药物靶向接触的测量是有效药物开发和化学探针验证的核心。在这里, 我们详细介绍了一种在细胞热转移分析 (cetsa) 的微板兼容适应中使用高含量成像测量药物靶点接触的协议。

摘要

量化小分子与其预期蛋白质靶标的相互作用对于药物开发、目标验证和化学探针验证至关重要。在不改变蛋白质靶点或小分子的情况下测量这种现象的方法特别有价值, 尽管在技术上具有挑战性。细胞热转移分析 (cetsa) 是监测活细胞中目标参与的一种技术。在这里, 我们描述了对原始 cetsa 协议的改编, 该协议允许进行高吞吐量测量, 同时在单个单元级别保持亚细胞定位。我们相信该协议为 cetsa 在复杂目标相互作用的深入表征方面的应用提供了重要的进展, 特别是在细胞的异质种群中。

引言

在开发新药或化学探针时, 必须将观察到的药理作用或功能读数^{与目标占位率}或参与活细胞 1,^2,3的测量结合起来。这些数据是必要的, 既可以确保小分子实际上达到其预期目标, 也可以验证蛋白质靶标选择^4,5背后的生物学假设。此外, 在药物开发过程中, 在临床试验之前, 使用日益复杂的模型系统来选择和证实铅化合物。为了确认生物学在这些临床前系统中的翻译, 在整个开发过程中追踪药物靶手和伴随的生物学的方法至关重要。

药物靶向参与传统上是一个具有挑战性的小分子和蛋白质的活细胞监测的难题, 特别是在具有空间分辨率^6,7的单细胞水平^.最近观察未修饰药物与活细胞中蛋白质相互作用的方法之一是细胞热转移试验 (cetsa), 在该方法中, 配体诱导的本地蛋白质在应对热挑战时的稳定性^被量化^{8, 9,10}。这是通过量化剩余的可溶性蛋白质后暴露在热挑战。在 ctsa 的首次公开中, 使用了西方印迹进行检测。为了能够进行筛选活动和对较大的化合物集合进行分类, 为提高 cetsa 实验的吞吐量所做的努力导致了几个均匀的、基于微板的检测^10、11的开发。然而, 这些方法的一个局限性是, 它们目前最适合在细胞悬浮液中进行复合治疗, 检测需要细胞裂解, 导致空间信息丢失。ctsa 可以在实验中应用, 既可以作为在单个分子浓度下的热聚集温度 (t_agg) 的配体诱导转移, 也可以应用于在单一温度下稳定蛋白质所需的配体浓度。后者被称为等温剂量响应指纹 (itdrf), 以表示这些测量的依赖性于特定的实验条件。

该方案的目的是利用 cetsa 在粘附细胞中的靶点接触进行免疫荧光 (if) 抗体^检测,并进行高含量显微镜12。此过程扩展了原始的 cetsa 平台, 允许对目标参与进行单细胞量化, 并对亚细胞定位进行保护。值得注意的是, 与以往许多报告不同的是, 在这一过程中, 复合治疗是在活体粘附细胞中进行的, 在热挑战之前没有表面分离或清洗, 从而保持了我们旨在测量¹³的既定结合平衡。目前, 该方法已被验证为一个目标蛋白 p38α (mapk14) 在几个细胞系, 我们希望通过分享这个程序的技术可以广泛地应用于整个融化蛋白质组。我们预计, 该协议可以在整个药物开发过程中进行调整, 从筛选、打击试验到监测体内的目标参与。

方案

1. 细胞的播种

请注意:有关工作流的一般概述, 请参见图 1。材料和试剂的详细清单可在材料表中找到。

1. 在播种细胞之前, 在黑色384孔成像检测板的框架内安装带有标准钻头的钻孔, 以避免气泡在加热步骤后被困在板下。为了避免塑料颗粒进入井在这一步骤中, 并保持无菌条件, 密封板与粘合剂铝箔或覆盖板之前, 在一个组织培养罩钻孔。通常情况下, 3 孔的直径为3.5 毫米的每一侧的板 (短边缘) 足够。
2. 用70% 乙醇清洗, 制备层流工作台。遵循标准的无菌组织培养技术, 从细胞瓶或盘子中去除培养基。用5-10 毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗细胞, 然后在烧瓶中加入2毫升胰蛋白酶。在37°c 下培育烧瓶, 直到 a-431 细胞分离。使用血细胞计或细胞计数器对细胞进行计数。在培养基中制备 50, 000 细胞悬浮液。
3. 根据实验的规模, 使用散装试剂分配器或多通道管道, 将40μl 细胞悬浮液 (给出每口 2, 000 细胞的最终细胞密度) 分配到检测板的每一口井中。简单地将板从一侧移动到另一侧, 将细胞均匀地分散在板的底部。
4. 为了最大限度地减少板缘效应, 让细胞在层流罩后部的室温下在检测板底部沉淀20分钟。然后, 将盘子放在塑料容器中, 用潮湿的纸巾, 以确保潮湿的气氛。使用前, 请用70% 乙醇擦拭塑料容器。
5. 在37°c 条件下用检测板孵育箱体 2-3天, 在传统的加湿孵化器中孵育 5% co 2。通过光学显微镜的目视检查, 监测细胞的融合程度, 直至50-75。

2. 复合处理

1. 在实验当天, 使用板式垫圈从每口井中吸气介质。将板材放在板垫圈上, 然后选择吸气程序。如果没有板式垫圈, 则可以通过将盘子倒置, 用快速的手扭动在废纸盘或水槽上, 来去除液体。完全去除液体是良好的性能所必需的。然后用纸巾擦拭, 去除多余的液体。
2. 根据实验的规模, 使用自动点胶或多通道移液器, 在细胞培养培养基中加入30微米稀释的化合物。确保在每个检测板上的几口井中添加负 (dmso) 和阳性 (已知配体) 控制。由于这是一种热转移试验, 因此为了观察蛋白质的稳定, 化合物浓度必须超过离解常数。因此, 化合物浓度的粗略指南是 ic₅₀的50-100 倍, 但在讨论部分中找到了关于化合物浓度的更详细的说明。
   注: 应在实验前测试细胞系的 dmso 耐受性。
3. 用透气板密封密封复合处理的检测板, 在37°c 和 5% co 2 中加湿孵化器中孵育 30分钟。

3. 热挑战

1. 首先, 将水浴设置为所需的温度。请注意, 检测板井内达到的最终温度可能与水浴中的最终温度不同。用假板和热电偶温度计事先调查偏移情况。在所需的温度下, 洗澡水通常需要30分钟才能稳定。
2. 为了验证在加热步骤中检测板的井中是否达到了所需的温度, 请制备一个未密封的假板, 其中含有与检测板相同体积的介质。
3. 从孵化器中取出检测板。取下透气的密封件, 用紧密的粘合铝箔重新密封含有复合处理过的细胞的检测板, 以确保在随后的水浴加热过程中不会有水泄漏到水井中。确保板架上的钻孔是可访问的。
4. 将检测板和假板放置在水浴中 , 板底部向水面倾斜 , 以迫使剩余的空气从板出。
5. 使用热电偶温度计监测新假板井内的温度。
6. 在水浴中加热检测板3分钟。立即将检测结果和假板转移到另一个水浴中, 用室温水冷却5分钟。检测板现在已准备好进行进一步加工。

4. 固定

1. 使用散装试剂分配器或多通道移液器将 10μl 16% (w/v) 的甲醛 (pfa) 直接分配到检测板。在室温下孵化20分钟。
   注: 有些固定方法被归类为致癌物质, 应遵守机构安全条例。
2. 使用平板垫圈, 使用 300μl pbs 对细胞进行吸气和清洗。将板材放在板垫圈上, 然后选择吸气程序。
   注: 此过程已使用板式垫圈上的溢出协议进行了优化, 在该协议中, 液体同时被分配和取出。如果没有板式垫圈或类似的程序, 也可以手动完成清洗步骤。
3. 手动清洗程序:用快速的手在废纸盘或水槽上扭动盘子, 将液体从井中取出。完全去除液体是良好的性能所必需的。加入80μl 的 pbs 与多通道移液器, 并再次反转板, 如上所述, 重复清洗过程两次。最后清洗后, 将盘子涂在干净的纸巾上, 去除多余的液体。

5. 渗透性

1. 在多通道移液的井中加入 20μl 0.1% 的 np-40, 并在室温下孵育10分钟。使用上述相同的步骤清洗细胞 (步骤 4.2)。
2. 或者, 在适当的情况下, 应用抗原检索协议,例如:
   1. 在多通道管道的井中加入20μl 的 1% sds。在室温下孵化 5分钟, 并按照上述相同程序清洗 (步骤 4.2)。
   2. 在 ph 值7.2 下加入80μl 的 10 mm 甘氨酸, 在室温下孵育10分钟。通过放置在板垫圈上并选择吸气协议, 使用板式垫圈对甘氨酸溶液进行吸气。如果没有板式垫圈, 请参见2.1 和4.2 中的注释。

6. 阻塞

1. 在 pbs 中使用散装试剂分配器或多通道移液器在井中加入15μl 的 1% (w/v) 牛血清白蛋白 (bsa)。在室温下将板材加氢 1小时, 或在4°c 下用铝箔板密封进行隔夜。

7. 原发抗体

1. 通过放置在板垫圈上并选择吸气协议, 使用板式垫圈对堵塞溶液进行吸气。如果没有板式垫圈, 请参见2.1 和4.2 中的注释。
2. 在 pbs 中的 1% (w/v) 中, 在使用多通道管道的井中加入10μl 的原代抗体, 并相应地稀释 bsa。在室温下将板材加氢 1小时, 或在4°c 下用铝箔板密封进行隔夜。

8. 继发性抗体

1. 吸收主要抗体溶液, 并按照上述相同的程序清洗水井 (步骤 4.2)。
2. 在 pbs 中添加10μl 的亚历克莎488二级抗体, 并在 1% (w/v) bsa 中相应稀释。在室温下孵化1小时。用粘合剂铝箔密封板, 以防止光线照射。
   注: 在此步骤和后续步骤中保护板材不受光线照射。

9. 核染色和电池面膜

1. 在 pbs 中稀释至 0.05 mgml 的核染料中加入 10μl, 并使用多通道管道将其添加到井中。在室温下额外孵化10分钟。
2. 吸收二级抗体和 hoechst 溶液, 并使用上述相同的程序清洗水井 (步骤 4.2)。
3. 使用多通道管将在 pbs 中稀释至 200 ngml 的细胞掩模加入10μl。在室温下孵化30分钟。
4. 使用上述相同的步骤 (步骤 4.2), 对细胞面膜溶液进行吸气和清洗。
5. 使用板材垫圈、散装试剂分配器或多通道移液装置向所有油井分配 60μl pbs, 并用粘合剂铝箔密封板材。

10. 图像采集与分析

1. 使用3个荧光通道在高含量成像仪上捕获图像: dapi (387/447)、gfp (472/520) 和 texasred (562/624)。使用10倍目标, 每口井获取4张图片。使用自动激光自动对焦, 并在采集过程中应用分翼2。将图像存储为 16位, 灰色缩放文件以及元数据。
2. 使用可用的软件分析图像。使用带有 dapi (细胞核) 和 texasred (细胞质) 的细胞评分算法识别细胞边界。
3. 提取所有获得波长的平均强度, 以便进一步进行数据分析。
4. 计算 z 因子, 以确保检测的稳定性。
5. 使用以下公式计算% 稳定: 100 * (1-(井强度-平均井强度负控制)/(平均强度正控制平均强度负控制))。负控制是 dmso, 正控制是参考物质。由于化合物之间的最大稳定性可能不同, 实际上大于 itdrf 曲线的正控制, 因此有时使用每个化合物的最大和最小稳定强度来代替控制井的强度值.

结果

图 1中概述的协议描述了通过高含量成像检测剩余可溶性蛋白质, 在粘附细胞上运行 cetsa 检测的基本工作流程。通过修改化合物或试剂的板材布局, 可以很容易地适应分析开发的所有阶段.我们详细介绍了以下几个预期用例的预期结果。

抗体鉴定和检测开发。成功结果的先决条件是鉴定一种初级抗体或其他合适的亲和力试剂, 在高温过程中形成的聚集和沉淀的蛋白质存在的情况下, 选择性地识别蛋白质的原生形式步骤3中的挑战。为了建立这里描述的 cedsa 成像检测, 我们筛选了一个由9个抗体组成的面板, 针对52°C 的 p38α, 用于正负对照之间的信号窗口。然后, 我们滴定了最佳抗体, 并确定了图 2 a, b 中显示的条件与代表性免疫荧光图像的 p38α...

讨论

如结果部分所述, 该过程有几个关键步骤。首先, 确定高质量的亲和力试剂是很重要的。我们建议为每个所需的目标筛选一个小型抗体库。在选择了初级抗体后, 如果合适的情况下, 验证蛋白质靶点的一些不同结合位点的系统也很重要。非常鼓励通过省略热挑战来反筛选干扰检测信号的化合物, 如图2所示。当观察到配体存在的减少信号时, 可以测试步骤5.2 中描述的抗原检索协议。板材加热不均匀会导致观测数据的波动和板对板的变化。由于板材在瞬态热挑战期间部分被淹没在水浴中 (步骤 3.4), 板材的外井不仅暴露在井底的热水中, 而且还通过外壁暴露在热水中。这可能会导致较高的温度在相同的淹没时间在相同的淹没时间在板的外井和随后的板边缘效应。因此, 建议避免板的外井。如果在加热步骤中气泡被困在板下, 防止热水与井底充分接触, 也可以看到类似的影响。考虑到加热成像板的挑战, 专门为暴露于高温而制作的器件和板可以帮助推进这种方法。我们探讨了几种细胞系的使用, 并在粘附细胞类型的热挑战之后发现了表面附着的变异性。在我们的实验室进行的初步实验表明, 使用涂层或细胞外基质, 如 synthemax ii-sc 或 ce...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	苜蓿	09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher	Scientific	12604013	，用于分离细胞和传代培养
16% 多聚甲醛 （PFA）ThermoFisher	Scientific	28908	固定山
羊抗兔 IgG （H+L），Alexa Fluor 488 偶联抗体	ThermoFisher Scientific	A11008	二抗
HCS CellMask Red 染色	ThermoFisher Scientific	H32712	细胞质染色
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	用于透化
Hoechst 染色剂 33342	Sigma-Aldrich	B2261	核染色
Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基 （DMEM） - 高葡萄糖	Sigma-Aldrich	6429	细胞培养基成分
热灭活胎牛血清 （FBS）	Sigma-Aldrich	F9665	细胞培养基成分
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333	细胞培养基成分
康宁，用于共	Sigma-Aldrich	CLS3345
兔抗 p38 抗体 [E229]	Abcam	ab170099	一抗， LOT：GR305364-16
Falcon， 黑色 384 孔透明底部成像板	VWR	736-2044	成像板
Greiner， 384 孔低容量聚丙烯板	VWR	784201
粘性铝箔	VWR	30127790
可剥离铝密封	Agilent	24210-001	用于 PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α 抑制剂
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α 抑制剂
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α 抑制剂
SB203580	Tocris	1202	p38α 抑制剂
AMG 548	Tocris	3920	p38α 抑制剂
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α 抑制剂
L-Skepinone	CBCS 化合物集合		p38α 抑制剂
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A7030	封闭剂
SDS（十二烷基硫酸钠）	BDH	44244	用于抗原修复
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898	用于抗原修复
A-431 细胞	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		用于制备复合板
板密封剂	Agilent		PlateLoc
散装试剂分液器	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
自动液体处理	Agilent		Bravo 液体处理平台;用于复合板制备
洗板	Tecan		Hydrospeed
水浴	Julabo	TW12
热电偶	VWR		热电偶可追溯实验室温度计
高内涵成像仪	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS 宽场高内涵分析系统