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方法文章

利用高内涵成像技术定量测定贴壁细胞中的靶点结合

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DOI：

10.3791/58670

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2018年11月29日

 ,  , 
1Chemical Biology Consortium Sweden, Science for Life Laboratory, Karolinska Institutet, Solna, 2Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, Solna, 3Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm

本文内容

摘要

药物靶点结合程度的测定对于有效的药物开发和化学探针验证至关重要。本文详细介绍了一种利用高内涵成像技术测定药物-靶点结合程度的实验方案，该方法基于细胞热偏移分析（CETSA），并适配于微孔板平台。

摘要

定量分析小分子与其靶标蛋白之间的相互作用对于药物开发、靶点验证以及化学探针验证至关重要。在不修饰靶标蛋白或小分子的前提下测量该现象的方法具有重要价值，尽管在技术上具有挑战性。细胞热迁移分析（CETSA）是一种用于监测活细胞中靶标结合情况的技术。本文中，我们描述了一种对原始CETSA方案的改进方法，可在保持单细胞水平亚细胞定位的同时实现高通量检测。我们认为，该方案显著推动了CETSA技术在化合物-靶标相互作用深入表征中的应用，尤其适用于异质性细胞群体的研究。

引言

在开发新药或化学探针时，必须将观察到的药理学效应或功能读数与活细胞中靶点占有率或靶点结合的测量结果相关联1,2,3。这些数据对于确认小分子是否确实到达其预期靶点，以及验证蛋白质靶点选择背后的生物学假设均至关重要4,5。此外，在药物开发过程中，会使用复杂性逐步增加的模型系统，在临床试验前筛选并验证候选化合物。为了确认生物学效应在这些临床前系统之间的可转化性，贯穿整个开发过程追踪药物-靶点结合及其相关生物学变化的方法至关重要。

对于未修饰的小分子和蛋白质，传统上在活细胞中监测药物-靶点结合一直具有挑战性，尤其是在具有空间分辨率的单细胞水平上6,7。近年来出现了一种可在活细胞中观察未修饰药物与蛋白质相互作用的方法——细胞热迁移分析（cellular thermal shift assay, CETSA），该方法通过定量配体诱导的天然蛋白质在热刺激下的稳定性变化来实现检测8,9,10。具体而言，是在施加热刺激后，定量检测仍保持可溶性的目标蛋白含量。在CETSA最初报道中，采用的是蛋白质印迹法（western blot）进行检测。为了支持大规模化合物库的筛选及苗头化合物的分级，研究人员已开发出多种均相、基于微孔板的检测方法，以提高CETSA实验的通量10,11。然而，这些方法的一个局限在于目前最适用于细胞悬液中的化合物处理，且检测过程需要裂解细胞，从而导致空间信息的丢失。CETSA在实验上可有两种应用形式：一种是测定小分子在单一浓度下引起的蛋白质热聚集温度（Tagg）的变化；另一种是测定在单一温度下使蛋白质稳定的配体浓度。后者被称为等温剂量反应指纹图谱（isothermal dose response fingerprints, ITDRF），以强调这些测量结果对特定实验条件的依赖性。

本实验方案旨在通过高内涵显微镜结合免疫荧光（IF）抗体检测，在贴壁细胞中利用CETSA方法测定靶点结合情况12该方法在原有CETSA平台基础上进行拓展，可实现对靶标结合的单细胞定量分析，同时保留亚细胞定位信息。值得注意的是，与以往多数研究不同，本方案在热挑战前不对活体贴壁细胞进行表面解离或洗涤，而是在活细胞状态下直接进行化合物处理，从而维持了我们旨在测量的既定结合平衡。13目前，该方法已在多种细胞系中针对一个靶标蛋白p38α（MAPK14）完成验证。我们希望通过分享此实验流程，该技术能够广泛应用于整个变性蛋白质组的研究。预计本方案可适用于药物研发的各个阶段，从筛选、苗头化合物分类到靶标结合的监测均可进行相应调整与应用 体内.

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方案

1. 细胞接种

注意：有关工作流程的总体概述，请参见图1。材料与试剂的详细列表见材料表。

  1. 在接种细胞之前，使用标准钻头在黑色384孔成像分析板的框架上钻孔，以避免在后续加热步骤中板下 trapped 气泡。为防止此过程中塑料颗粒进入孔内并维持无菌条件，钻孔前应在超净工作台中用自粘性铝箔密封板子或加盖保护。通常在板的每一短边各钻3个直径为3.5 mm的孔即可满足要求。
  2. 使用70%乙醇清洁超净工作台。按照标准无菌细胞培养技术，从细胞培养瓶或培养皿中移除培养基。用5–10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后向培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶。将培养瓶置于37 °C孵育，直至A-431细胞脱落。使用血细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数。用培养基制备浓度为50,000个细胞/mL的细胞悬液。
  3. 根据实验规模，使用多通道移液器或批量试剂分配器，向分析板的每个孔中加入40 µL细胞悬液（最终每孔细胞密度为2,000个细胞）。轻轻左右晃动板子，使细胞均匀分布在孔底。
  4. 为减少边缘效应，将分析板置于超净工作台内室温下静置20分钟，使细胞沉降至孔底。随后将板放入带有湿润纸巾的塑料容器中，以维持湿润环境。使用前用70%乙醇擦拭塑料容器。
  5. 将装有分析板的容器置于常规加湿培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育2–3天。通过光学显微镜目视观察，监测细胞融合度至50–75%。

2. 化合物处理

  1. 实验当天，使用洗板机吸出每孔中的培养基。将板放入洗板机中，并选择吸液程序。若无洗板机，可将板快速翻转并用手腕扭转，在废液盘或水槽上方倾倒去除液体。彻底去除液体对实验效果至关重要。残留的多余液体需用纸巾轻压吸除。
  2. 根据实验规模，使用自动分液系统或多通道移液器，向各孔中加入30 µL用细胞培养基稀释至适当浓度的化合物。确保在每块检测板的若干孔中加入阴性对照（DMSO）和阳性对照（已知配体）。由于本实验为热迁移实验，为观察到蛋白稳定性变化，化合物浓度必须超过其解离常数。因此，化合物浓度的粗略参考范围为IC50的50–100倍，有关化合物浓度的更详细说明见讨论部分。
    注意：实验前应预先测试细胞系对DMSO的耐受性。
  3. 用透气性板封膜密封加有化合物的检测板，于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育30分钟。

3. 热应激挑战

  1. 首先，将水浴锅设定至所需温度。注意，检测板孔内最终达到的温度可能与水浴锅内的最终温度不同。使用空白板和热电偶温度计预先检测该温差。水浴锅通常需要 30 分钟才能稳定在目标温度。
  2. 为验证在加热步骤中检测板孔内是否达到目标温度，准备一个未密封的空白板，其中所含培养基体积与检测板相同。
  3. 从培养箱中取出检测板。移除透气密封膜，并使用紧密粘附的铝箔将含有药物处理细胞的检测板重新密封，以确保在后续水浴加热过程中无水分渗入孔内。确保板框上的通气孔可被触及。
  4. 将检测板和空白板放入水浴锅中，使板底部倾斜朝向水面，以迫使板下方残留的空气排出。
  5. 使用热电偶温度计监测新空白板孔内的温度。
  6. 将检测板在水浴锅中加热 3 分钟。随后立即将检测板和空白板转移至另一盛有室温水的水浴锅中，冷却 5 分钟。此时检测板已准备好进行后续处理。

4. 固定

  1. 使用多通道移液器或批量试剂分配器，将 10 µL 16% (w/v) 多聚甲醛（PFA）直接加入检测板中。室温孵育 20 分钟。
    注意：某些固定剂被归类为致癌物，应遵守机构安全规定。
  2. 吸除 PFA 溶液，并使用洗板机用 300 µL PBS 洗涤细胞。将板放入洗板机中，并选择吸液程序。
    注意：本步骤已针对洗板机的溢流洗涤程序进行优化，该程序在加入液体的同时进行移除。若无洗板机或类似设备，可改用手工洗涤。
  3. 手工洗涤步骤： 将板快速翻转并在废液盘或水槽上方用手腕扭转以去除孔中液体。彻底去除液体对良好实验结果至关重要。使用多通道移液器加入 80 µL PBS，然后如上所述再次翻转板子，重复洗涤两次。最后一次洗涤后，将板轻轻在干净的纸巾上拍干，以去除残留液体。

5. 透化

  1. 使用多通道移液器向孔中加入 20 µL 0.1% (v/v) NP-40，并在室温下孵育 10 分钟。按照上述步骤（步骤 4.2）相同的方法洗涤细胞。
  2. 或者，在适当情况下，可采用抗原修复方案，例如：
    1. 使用多通道移液器向孔中加入 20 µL 1% SDS，在室温下孵育 5 分钟，然后按照上述步骤（步骤 4.2）相同的方法进行洗涤。
    2. 加入 80 μL pH 7.2 的 10 mM 甘氨酸，室温孵育 10 分钟。使用板式洗涤仪进行吸液：将板放入板式洗涤仪中，并选择吸液程序。若无板式洗涤仪，请参见 2.1 和 4.2 中的说明。

6. 封闭

  1. 使用多通道移液器或批量试剂分配器，向各孔中加入15 µL含1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液。用铝箔板封膜后，于室温孵育1小时，或于4 °C过夜孵育。

7. 一抗

  1. 使用洗板机通过将板放入洗板机并选择吸液程序来吸除封闭液。如果无洗板机，请参见 2.1 和 4.2 中的说明。
  2. 使用多通道移液器将适量稀释于含 1% (w/v) BSA 的 PBS 中的一抗 10 µL 加入孔中。将板在室温下孵育 1 小时，或在 4 °C 下用铝箔密封膜密封后过夜孵育。

8. 二抗

  1. 吸去一抗溶液，并按照上述步骤（4.2）相同的方法洗涤各孔。
  2. 加入10 µL用含1% (w/v) BSA的PBS适当稀释的Alexa 488二抗。室温孵育1小时。用自粘性铝箔封板，避光保存。
    注意：此步骤及后续所有步骤均需避光。

9. 细胞核染色与细胞掩模

  1. 使用多通道移液器将10 µL用PBS稀释至0.05 mg/mL的核染料加入孔中。室温下额外孵育10分钟。
  2. 吸除二抗和Hoechst溶液，并按照上述相同程序（步骤4.2）洗涤各孔。
  3. 使用多通道移液器将10 µL用PBS稀释至200 ng/mL的细胞膜染料加入孔中。室温下孵育30分钟。
  4. 吸除细胞膜染料溶液，并按照上述相同程序（步骤4.2）洗涤各孔。
  5. 使用板式洗板机、大量试剂分配器或多通道移液器向所有孔中加入60 µL PBS，并用粘性铝箔密封板孔。

10. 图像采集与分析

  1. 使用高内涵成像仪，通过三个荧光通道采集图像：DAPI（387/447）、GFP（472/520）和TexasRed（562/624）。每个孔使用10倍物镜采集4幅图像。采用自动激光对焦，并在采集过程中应用2倍 binning。将图像连同元数据一起存储为16位灰度TIFF文件。
  2. 使用可用软件分析图像。利用基于DAPI（细胞核）和TexasRed（细胞质）的Cell Scoring算法识别细胞边界。
  3. 提取所有采集波长下的平均荧光强度，用于后续数据分析。
  4. 计算Z因子，以确保该检测方法的稳健性。
  5. 使用以下公式计算稳定化百分比：% 稳定化 = 100 × (1 - (待测孔强度 - 阴性对照孔平均强度) / (阳性对照孔平均强度 - 阴性对照孔平均强度))。其中，阴性对照为DMSO，阳性对照为参考物质。由于不同化合物之间的最大稳定化水平可能存在差异，且在ITDRF曲线上可能超过阳性对照，因此有时会使用各化合物自身的最大和最小稳定化强度值，替代对照孔的强度值进行计算。

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结果

本方案概述了 图1 描述了在贴壁细胞上进行CETSA检测的基本操作流程，通过高内涵成像检测残留的可溶性蛋白。通过调整化合物或试剂的孔板布局，该流程可轻松适用于检测方法开发的各个阶段。14我们将在下文详细说明几种预期使用场景下的预期结果。

抗体鉴定与检测方法开发。获得成功结果的前提是鉴定出一种能够特异性识别目标蛋白天然构象的一抗或其他合适的亲和试剂，该试剂需能在第3步热处理过程中形成的聚集和沉淀蛋白存在的情况下，仍选择性地结合目标蛋白的天然形式。为建立本文所述的CETSA成像检测方法，我们筛选了一组针对p38α的9种抗体，在52°C条件下评估其在阳性和阴性对照之间的信号窗口。随后对表现最佳的抗体进行滴定，并确定了如图2 A,B所示的实验条...

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讨论

如结果部分所述，该实验流程包含若干关键步骤。首先，选择高质量的亲和试剂至关重要。我们建议针对每个目标靶点筛选一个小型抗体文库。在选定一种初级抗体后，若条件允许，还应针对该靶蛋白的多个不同结合位点对系统进行验证。同时，应进行反向筛选，以识别可能干扰检测信号的化合物，如文中所示。 图2C 建议省略热挑战步骤。当观察到配体存在时信号降低的情况，可尝试采用步骤5.2中所述的抗原修复方案。培养板受热不均可能导致实验数据出现波动以及板间差异。由于在瞬态热挑战过程中（步骤3.4）培养板部分浸入水浴，板的外周孔不仅底部接触热水，其侧壁也会暴露于热水中，这可能导致在相同浸没时间内，外周孔的温度高于内孔，从而引发边缘效应。因此，建议避免使用培养板的外周孔。若加热过程中有气泡滞留在板底部，阻碍了热水与孔底的充分接触，也可能产生类似问题。鉴于成像板加热过程中存在的技术难题，使用专为耐热设计的设备和耗材可能有助于推动该方法的发展。我们测试了多种细胞系，发现贴壁型细胞在热挑战后表面附着能力存在差异。本实验室的初步实验表明，使用涂层或细胞外基质（如Synthemax II-SC或Cell-Tak）可减少细胞...

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披露

作者无任何披露事项需要报告。

致谢

作者感谢瑞典生命科学实验室（Science for Life Laboratory）和卡罗林斯卡学院（Karolinska Institutet）提供的基础设施支持。作者还感谢Michaela Vallin、Magdalena Otrocka和Thomas Lundbäck提供的意见和讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液（PBS）Medicago09-9400-100
TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013用于细胞解离和传代培养
16% 多聚甲醛（PFA）ThermoFisher Scientific28908固定剂
山羊抗兔 IgG（H+L），Alexa Fluor 488 标记抗体ThermoFisher ScientificA11008二抗
HCS CellMask Red 染料ThermoFisher ScientificH32712细胞质染色
NP-40Sigma-Aldrich56741用于透化处理
Hoechst 33342 染料Sigma-AldrichB2261细胞核染色
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）- 高糖Sigma-Aldrich6429细胞培养基组分
热灭活胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF9665细胞培养基组分
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333细胞培养基组分
Corning 可透气板封膜Sigma-AldrichCLS3345用于化合物孵育步骤
兔抗 p38 抗体 [E229]Abcamab170099一抗，批号：GR305364-16
Falcon 黑色 384 孔透明底成像板VWR736-2044成像板
Greiner 384 孔低体积聚丙烯板VWR784201
压敏铝箔VWR30127790
可剥离铝密封膜Agilent24210-001用于 PlateLoc
LY2228820SelleckchemS1494p38α 抑制剂
PH797804SelleckchemPH797804p38α 抑制剂
BIRB796SelleckchemS1574p38α 抑制剂
SB203580Tocris1202p38α 抑制剂
AMG 548Tocris3920p38α 抑制剂
RWJ 67657Tocris2999p38α 抑制剂
L-SkepinoneCBCS 化合物库p38α 抑制剂
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA7030封闭剂
SDS（十二烷基硫酸钠）BDH44244用于抗原修复
甘氨酸Sigma-AldrichG8898用于抗原修复
A-431 细胞ATCCATC-CRL-1555
Echo 550Labcyte用于化合物板的制备
板封仪AgilentPlateLoc
大量试剂分配器Thermo Scientific5840300Multidrop Combi
自动化液体处理系统AgilentBravo 液体处理平台；用于化合物板的制备
洗板机TecanHydrospeed
水浴锅JulaboTW12
热电偶VWR可追溯实验室温度计（热电偶）
高内涵成像仪Molecular DevicesImageXpress Micro XLS 宽场高内涵分析系统

参考文献

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