小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

摘要

本文介绍了一种高效染色质免疫沉淀（ChIP）后接高通量DNA测序（ChIP-seq）的实验方案，适用于从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）样本。该方案可用于全基因组范围内组蛋白修饰的定位分析，以及非组蛋白目标蛋白的全基因组定位研究。 体内.

摘要

大多数细胞过程通过特定基因程序的转录调控进行调节。这种调控由多种转录因子（TFs）和辅因子共同作用实现，这些因子通过改变染色质结构来介导转录的激活或抑制。via染色质免疫沉淀（ChIP）是一种有用的分子生物学方法，可用于绘制组蛋白修饰图谱以及分析转录因子/辅因子在DNA上的结合情况，从而提供不同生物学过程中细胞核内动态变化的快照。

为了研究脂肪组织中的转录调控，需采用源自 体外 永生化或原代细胞系的细胞培养常被用于ChIP实验，因其起始材料丰富且生物学变异性较低。然而，这些模型仅能反映活体生物中实际染色质状态的有限片段。因此，迫切需要优化针对来自动物模型脂肪组织样本的ChIP实验方案。

本文介绍了一种从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）中高效进行组蛋白修饰和非组蛋白的ChIP-seq实验方案。该方案针对BAT这一在形态和生理上均与其他脂肪组织不同的特殊组织，优化了全基因组范围内目标蛋白及表观遗传标记定位的研究。

引言

白色脂肪组织（WAT）主要负责能量储存，而棕色脂肪组织（BAT）则能够通过线粒体解偶联将碳水化合物和脂质转化为热能，从而以热量形式耗散能量via mitochondrial uncoupling¹。由于这一特殊功能，BAT在生理条件下以及应对寒冷刺激时对维持体温至关重要。尽管BAT分化过程及产热应激期间的基因表达变化已在体内和体外得到广泛研究，但这些变化背后的分子机制主要是在永生化细胞系和原代前脂肪细胞中被解析的，仅有少数研究在体内条件下开展^2,3,4,5。

通过染色质结构的协调变化，可实现对特定基因表达程序的转录调控 通过 多种转录因子及共调节因子的作用。染色质免疫沉淀（ChIP）是一种有价值的分子生物学方法，用于研究这些因子在DNA上的招募情况以及染色质结构中相关变化的图谱分析。ChIP实验成功的关键因素包括：优化不同样本间的交联条件和染色质剪切的一致性、提供充足的起始材料，以及最重要的一点——抗体的质量。当从完整组织进行ChIP实验时，还需考虑样本的异质性，并优化实验流程以提高细胞核分离的效率；由于脂肪组织富含脂质，该步骤尤为敏感。事....

方案

本方案中的动物操作步骤已获得波士顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 第1天：用于染色质免疫沉淀（ChIP）的棕色脂肪组织解剖与制备

1. 使用二氧化碳（CO₂）安乐死小鼠₂）室，并立即进行解剖。切口前用70%乙醇喷洒小鼠毛发。将小鼠背部朝上放置，沿颈部切开皮肤。在肩部之间的皮下直接定位棕色脂肪组织（BAT），该组织位于肩胛间区（interscapular），呈两个叶状、蝴蝶形结构，表面有一层薄薄的白色脂肪，需仔细去除⁷).
   注意： 对于一只3月龄、饲喂常规饲料的C57BL/6J小鼠（此年龄段小鼠体重范围为27至30 g），每侧棕色脂肪组织（BAT）叶长约1 cm。无论雄性还是雌性小鼠，BAT库的总重量均约为0.15 g。
2. 每次使用1个BAT垫进行3次ChIP实验。可同时处理多个BAT垫，直至超声步骤。
3. 在室温下，将每块棕色脂肪组织（BAT）样本置于含有1%甲醛的10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，以150 rpm转速旋转交联15分钟。
4. 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，终体积由2.5 M储备液提供，室温下150 rpm旋转孵育5分钟，以终止交联反应。
5. 将BAT垫转移至500 µL低渗裂解缓冲液（10 mM HEPES, 1.5 mM MgC....

结果

图1：通过qPCR进行的ChIP验证。 代表性GPS2靶基因的ChIP-qPCR分析 NDUFV1 （左）和 TOMM20 （右）WT 和 GPS2-AKO 小鼠 BAT 中 H3K9 甲基化水平及 GPS2 与 Pol2 结合情况的相对变化。柱状图表示 3 次重复实验的样本均值，*p < 0.05 和 **p < 0.01，经Student's t检验计算得出。该图修改自Cardamone 等².

讨论

此处描述的实验方案是从鼠类组织（特别是优化用于棕色脂肪组织）进行染色质免疫沉淀（ChIP）的一种有效工具。从组织样本中进行ChIP时面临的主要挑战之一是在样品制备过程中回收足够数量的细胞。使用组织匀浆机搅拌器结合不锈钢珠对棕色脂肪组织（BAT）进行剪切，相较于传统的玻璃匀浆器，可显著减少因组织未充分破碎而导致的细胞损失。此外，直接在低渗缓冲液中对组织进行匀浆有助于脂质的释放，从而可更方便地将脂质与细胞核分离并去除。 通过 高速离心

适当的超声处理对于进行一致且可重复的染色质免疫沉淀（ChIP）实验也至关重要。使用水浴式超声仪可同时处理多个样品，从而提高染色质剪切的可重复性，并降低样品间交叉污染的风险。此外，采用温度控制的超声系统可减少样品过热，应避免过热以防止样品降解以及抗体对表位识别能力的丧失（详见材料表）。

另一个具有挑战性的步骤是免疫沉淀复合物的回收。此步骤通常优先使用磁珠，因为与磁力架配合使用时，磁珠能够实现更快且更有效的洗涤。然而，与Protein A琼脂糖相比，磁.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bullet Blender 组织匀浆器	Next Advence	BBX24
直径 3.2 mm 的不锈钢珠	Next Advence	SSB32
Bioruptor 超声破碎仪	Diagenode
1.5 mL TPX 塑料微量离心管	Diagenode	C30010010-5
Complete-蛋白酶抑制剂	Roche	11836145001
Protein A 琼脂糖悬液	Invitrogen	101041
GPS2 抗体	本实验室制备		兔多克隆抗体，Ct 抗体（Cardamone 等，Mol Cell 2018）
Pol2 抗体	Diagenode	C15100055
h3K9me3 抗体	Millipore	05-1242
Fast Syber Green 预混液	Applied Biosystems	4385612
ViiA7	Applied Biosystems
TruSeq ChIP 文库构建试剂盒	Illumina	IP-202-1012
HiSeq 2000	Illumina