我们开发了一种技术，可在自由活动的大鼠中同步记录对伤害性激光刺激产生的皮层脑电图和局部场电位。该技术有助于建立介观和宏观水平上皮层电活动信号之间的直接关联，从而促进对大脑中伤害性信息处理机制的研究。
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摘要
摘要
由选择性激活伤害性游离神经末梢的激光热脉冲所诱发的皮层电反应，在众多动物和人类研究中被广泛用于探究伤害性信息的皮层处理过程。这些激光诱发电位（LEPs）包含多个与激光刺激起始时间锁定的短暂反应。然而，由于缺乏一种能够同时记录大脑皮层表面和皮层下神经活动的取样技术，LEPs反应的功能特性在很大程度上仍不清楚。即，皮层脑电图 [ECoG] 和头皮脑电图 [scalp EEG]）以及脑内即，局部场电位 [LFP]）。为解决这一问题，本文介绍了一种使用自由活动大鼠的动物实验方案。该方案包含三个主要步骤：（1）动物准备与手术操作，（2）在伤害性激光刺激下同步记录ECoG与LFP，以及（3）数据分析与特征提取。具体而言，在3D打印保护壳的辅助下，植入大鼠颅骨的ECoG和LFP电极被牢固地固定在一起。在数据采集过程中，当动物处于自发静止状态时，激光脉冲通过记录箱底部的缝隙作用于大鼠前爪。同时播放持续的白噪声，以避免激光产生的超声激活听觉系统。因此，仅选择性地记录到伤害性反应。采用标准分析流程（例如，带通滤波、片段提取和基线校正）以提取与刺激相关的脑反应，我们获得了高信噪比的激光诱发电位（LEPs），并实现了从ECoG和LFP电极同步记录。该方法使得ECoG与LFP活动的同步记录成为可能，为介观与宏观尺度的皮层电活动信号之间建立了桥梁，从而有助于研究大脑对伤害性信息的处理过程。
引言
脑电图（EEG）是一种记录由大脑中数千个神经元同步活动所产生的电位和脑部振荡活动的技术。该技术广泛应用于许多基础研究和临床实践中1,2。例如，对强烈激光热脉冲产生的脑电反应（i.e.，LEP）被广泛用于研究伤害性感觉输入的外周和中枢处理过程3,4,5。在人类中，LEP主要包含三个明显的偏转成分：早期成分（N1），具有躯体定位组织特征，可能反映初级躯体感觉皮层（S1）的活动6；以及晚期成分（N2和P2），呈中枢分布，更可能反映次级躯体感觉皮层、岛叶和前扣带皮层的活动 7,8。在先前的研究中9,10，我们已证明，通过ECoG（一种颅内EEG）从直接放置于暴露脑表面的电极记录的大鼠LEP，同样包含三个明显的偏转成分（i.e.，具有躯体定位组织特征的N1和呈中枢分布的N2与P2）。大鼠LEP成分的极性、顺序和拓扑分布与人类LEP相似11。然而，由于头皮EEG和硬膜下ECoG记录的空间分辨率有限12，以及EEG源分析技术本身存在不准确性13，神经活动对LEP各成分的具体贡献仍存在较大争议。例如，尚不清楚初级躯体感觉皮层（S1）是否以及在多大程度上参与了激光刺激诱发的皮层反应早期成分（N1）6。
与宏观层面的记录技术不同，借助立体定位仪和微型驱动装置的颅内微丝电极阵列记录技术14,15能够测量特定脑区的神经活动（例如，局部场电位，LFPs）。局部场电位主要反映局部神经元群体的抑制性或兴奋性突触后电位的总和16。由于LFP所采样的神经活动反映的是记录电极周围数百微米范围内的神经元活动过程，因此该记录技术被广泛用于研究介观尺度下的脑信息处理。然而，该技术仅关注脑活动的精确局部变化，无法回答多个脑区信号如何整合的问题（例如，激光诱发电位成分如何在多个脑区进行整合）。
值得注意的是，对自由活动的大鼠同时记录皮层脑电图（ECoG）和皮层局部场电位（LFP），有助于在宏观和介观水平上研究皮层信息处理机制。此外，该方法为探究预定义脑区神经活动在多大程度上贡献于诱发电位（LEPs）提供了极佳的机会。事实上，已有若干先前研究评估了锋电位、皮层LFP与ECoG信号之间的相干性17,18，并证明靠近EEG电极的LFP19,20参与了刺激相关脑反应的形成。然而，现有技术通常仅用于记录麻醉动物的脑反应，原因是缺乏保护性外壳以防止电极因碰撞而受损。换言之，目前仍缺乏一种能够在自由活动的大鼠中连接介观（皮层LFP）与宏观（EEG和ECoG）水平皮层电活动信号的技术。
为解决这一问题，我们开发了一种技术，可同时记录自由活动大鼠多个脑区的皮层脑电图（ECoG）和皮层局部场电位（LFP）。该技术有助于建立介观与宏观水平上皮层电活动信号之间的直接关联，从而促进对脑内伤害性信息处理机制的研究。
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方案
实验采用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（体重400 - 450 g）。所有手术和实验操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》。相关操作已获中国科学院心理研究所研究伦理委员会批准。
1. 电极植入
- 在手术前，将大鼠置于含5%异氟烷和1 L/min气流的麻醉舱中进行麻醉。
- 使用立体定位仪固定大鼠头部，将其鼻部置于麻醉面罩中。给予异氟烷麻醉 通过 使用浓度为2%、气流速率为0.5 L/min的麻醉面罩，以维持手术期间的麻醉深度。注意，当大鼠对足趾夹捏无反应时，即达到手术耐受状态。
- 涂抹眼药膏以防止角膜干燥。
- 使用标准剃刀剃除大鼠头皮顶部的毛发。
- 使用医用碘伏消毒液对头皮进行消毒，然后用75%酒精脱碘。
- 在头皮注射利多卡因（2%）以实现局部镇痛。腹腔注射阿托品（0.2 mL）以抑制呼吸道过度分泌。
- 使用手术刀在头皮正中做一条长约2 - 3厘米的切口。沿中线切开并去除部分头皮，暴露颅骨。必要时使用电凝器止血。
- 根据预设的立体定位坐标（基于前囟位置）标记ECoG电极的位置，以及参考电极和接地电极在中线上的位置（分别位于后囟后方2 mm和4 mm处）。
- 在标记位置使用电动颅骨钻在颅骨上钻孔（直径：0.5 mm），用于放置ECoG螺钉，注意勿损伤硬脑膜。
- 将一根不锈钢螺钉（外径：0.6 mm）连接至带绝缘涂层的铜导线，并旋入孔中约1 mm深度，注意不要穿透下方的硬脑膜。这些螺钉在实验中用作皮层脑电图（ECoG）、参考电极和接地电极。
- 将保护性基座放置于颅骨上，使用牙科丙烯酸树脂通过基座旁的螺钉将其固定在颅骨上。用医用棉保护预定用于深度导线植入的区域，防止被覆盖，后续可将棉取出。
注意：防护外壳是一种定制设计的3D打印聚乳酸产品，由三部分组成：底座、侧壁和顶盖。侧壁覆盖有铜锥，以构成法拉第笼。 - 根据预设的立体定位坐标标记深度导线电极的位置。
- 在标记的埋线位置周围颅骨上钻小孔（直径：0.2 mm），小心移除骨瓣以暴露硬脑膜。频繁使用生理盐水冲洗颅骨开窗区域。 图1 描述植入深度导线电极前的准备工作。
- 用针抬起并剪开硬脑膜，注意不要损伤软脑膜、血管及新皮层表面。
- 将深度丝状电极降至新皮层表面，然后缓慢插入脑组织至目标深度。在下插电极过程中需频繁暂停，以观察皮层的回弹情况。本研究中，电极尖端位于皮层表面下0.5 mm处。
- 用石蜡和石蜡油的混合物封闭颅骨开孔，以确保深度导线电极可在后续实验操作中移动。
- 使用牙科丙烯酸树脂将电极装置固定在颅骨上。
- 将连接至ECoG螺钉的每根铜线焊接到连接模块上对应的通道。使用黏土覆盖焊接点，以避免不同通道之间发生潜在接触。
- 将防护壳体壁与底座组装，并将参比电极和接地电极焊接至相应的通道。
- 使用胶带将盖子固定到保护壳上，以避免污染。
- 手术后立即向大鼠腹腔注射青霉素（60,000 U）以预防术后感染。
- 术后将大鼠单只饲养于温湿度可控的笼具中，保持12小时昼夜循环，并提供食物和水 随意摄取 在LEP实验前至少一周。
注意：为同时记录ECoG和皮层LFP活动，本实验使用了一种装置，该装置由两种电极与一个连接器模块相连组成，连接器模块上装有多个附着于钨丝阵列的微型驱动器。通过将钨丝压入电极接口板（EIB）上的小金属孔，并利用金针实现钨丝与连接器模块的电极接口板（EIB）之间的连接。EIB上的两个金属孔焊接有包覆铜线，每根铜线的裸露端分别与连接至ECoG螺钉的对应铜线焊接。该装置的制备细节已在其他文献中描述21.
2. 数据采集
- 在实验前至少连续三天每天对大鼠进行一次抚摸，以确保大鼠熟悉实验操作人员22.
- 将大鼠置于行为实验箱中至少1小时，以确保其适应记录环境。
注意：该实验箱为一个边长30 cm的塑料立方体，箱底由铁丝网制成，网孔间距约为8 mm。 - 轻柔地将记录头级与电极模块连接，以避免惊吓大鼠并损坏电极模块。
- 设置激光发生器，连接光纤，并根据设备操作手册调整激光光斑尺寸。将触发发生器的数字输出连接至记录板的数字输入端口。
注意：操作时需避免过度弯曲光纤，以防光纤折断。记录前应确保记录软件能够显示并记录触发信号。本方案中，采用波长为1.34 μm的红外掺钕钇铝石榴石（Nd:YAP）激光器产生热辐射刺激。通过聚焦透镜将激光光斑直径设定为约5 mm。使用氦氖（He-Ne）激光指示刺激区域，具体位置根据实验目的确定。激光脉冲的刺激能量根据实验设计设定，脉冲持续时间为4 ms。 - 将摄像机置于实验箱的角落下方，以持续记录大鼠足爪受到伤害性激光刺激时的伤害性行为。调整摄像机的位置和方向，确保在整个实验过程中完全记录伤害性行为。
注意：强烈推荐使用高速电荷耦合器件（CCD）相机，因其可将操作信号传递至记录系统主板，从而精确记录伤害性行为的起始时间和持续时间。每次激光刺激后，实验人员根据先前定义的基于动物运动的标准评估伤害性行为。23,24，如下：无活动（评分为 0），头部转动（包括摇头或抬头；评分为 1），退缩反应（即，一种突然的、短暂的肢体抽动；评分为2分），撤退（ withdrawal）即，激光刺激后爪子回缩（评分为3）；舔舐和全身运动（评分为4）。 - 持续提供白噪声（50 dB SPL） 通过 位于腔室顶部的扬声器。
注意：如先前研究所示10,25激光刺激作用于皮肤时会产生超声波，这些超声波可被大鼠听觉系统检测到。因此，实验全程播放持续的白噪声，以避免听觉系统对激光产生的超声波发生反应。该操作可实现对与伤害性感受系统激活相关的脑反应进行选择性记录。 - 根据设备操作手册，使用记录系统采集来自皮层脑电图（ECoG）和深部导线电极的电生理数据。
注意：相机的操作信号与激光脉冲的触发信号均以相同的采样率（20,000 Hz）与电生理数据同步采集（所有数据均通过该采样率进行放大和数字化），以确保所有数据在时间上保持同步。 - 通过实验箱底部的缝隙，将激光脉冲传递至大鼠前爪的足底。
注意：根据实验人员的观察，仅当大鼠自发静止超过 2 s 时才给予激光刺激，以尽量减少运动相关伪迹对信号的干扰。为避免伤害性感受器疲劳或致敏，每次刺激后需手动更换激光束的照射位点，且刺激间间隔从不短于 40 s。每只大鼠可进行多次 ECoG 和 LFP 信号记录。每次记录前，需将大鼠置于实验箱中适应 1 h。所有记录结束后，对大鼠实施深度麻醉，经心脏灌注冰预冷的磷酸盐缓冲盐水，随后灌注 4% 多聚甲醛。取出脑组织并切片，以确定电极位置。
3. 数据分析
- 使用1至30 Hz的带通滤波器对连续数据进行滤波。
- 采用3秒的分析时间窗对数据进行分段，时间窗从激光刺激开始前1秒延伸至刺激开始后2秒。通过减去刺激前时间段内的平均幅值进行基线校正。
- 手动剔除受明显伪迹污染的片段。
- 计算每个实验条件下与激光刺激起始时间锁定的平均激光诱发电位（LEP）波形。
- 计算从皮层脑电图（ECoG）和深部导线电极记录的LEP波形的小波变换相干性（WTC）。
注意：WTC是一种用于分析成对电极信号在时间和频率上相干性的技术。该方法可针对任意时频点计算两个信号之间的相干性，其优势在于能够生成整个时频谱的相干性值。该方法学的详细内容已在其他文献中描述26。
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结果
在代表性实验中，记录了五只大鼠的电生理数据。对每只大鼠的右前爪施加激光刺激，共进行20次。 >40 s 的刺激间隔。采用 ECoG 螺钉和深部导线记录激光诱发电脑反应，深部导线植入双侧初级躯体感觉皮层（S1）和初级运动皮层（M1）。
如图1所示，根据立体定位坐标，在以下位置植入了两个颅外皮层电极（ECoG，以黑色标记）和深部导丝电极（以彩色标记，每个区域植入五根导丝，共四个区域）（坐标以Bregma为参考，单位为mm；X轴和Y轴的正值分别表示右侧和前侧位置）：左侧ECoG，X = -1.5，Y = 1.75；右侧ECoG，X = 1.5，Y = 1.75；左侧S1，X = -4，Y = 0.5；右侧S1，X = 4，Y = 0.5；左侧M1，X = -3，Y = 3；右侧M1，X = 3，Y = 3。
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讨论
在本研究中，我们描述了一种技术，可同时记录自由活动大鼠在伤害性激光刺激下诱发的皮层脑电图（ECoG）和皮层局部场电位（LFP）反应。结果表明，在激光刺激开始后，可在ECoG和LFP信号中清晰检测到激光诱发电位（LEP）反应。同时记录ECoG和皮层LFP信号将有助于科学家研究二者之间的关系，从而更深入地理解神经元活动对LEP成分的贡献。
应注意到所提出技术中的五个关键步骤。第一，在使用牙科丙烯酸树脂将保护壳基座固定于颅骨表面之前，必须确保颅骨表面清洁且干燥。此步骤可确保保护壳基座稳定固定。第二，由于ECoG螺钉的直径略大于钻孔直径，初始旋入螺钉时会扩大孔径以形成螺纹。在本研究中，用于钨丝的孔与用于ECoG螺钉的孔之间的距离非常小（例如，小于0.3 mm）。如果在旋入ECoG螺钉和插入深度导线之前就完成所有钻孔，则ECoG螺钉周围的颅骨会变得脆弱，无法承受螺钉旋入过程中扩孔所产生的机械负荷。因此，必须先将ECoG螺钉旋入孔中以形成螺纹，然后再为插入钨丝进行钻孔。如果已插入的ECoG螺钉妨碍了钨丝钻孔时的视野，建议在完成方案的步骤1.14之后将其旋出，待钻孔完成后再重新...
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致谢
本工作得到中国科学院心理研究所心理健康重点实验室的支持， 中国国家自然科学基金（31671141 和 31822025），13th 中国科学院信息化专项五年规划（XXH13506）及中国科学院心理研究所科研基金项目（Y6CX021008）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 雄性 Sprague-Dawley 大鼠 | Vital River | ||
| 异氟烷 | RWD Life Science | ||
| 小型动物异氟烷麻醉系统 | RWD Life Science | 包含大鼠用麻醉面罩 | |
| 立体定位仪 | RWD Life Science | ||
| 集成 ECoG 与 LFP 电极的装置 | 该装置为自制，将 ECoG 电极和深部导线电极组装至一个连接器模块 | ||
| 3D 打印保护壳 | 壳体材质为聚乳酸，为自制结构，包含三个部分：底座、侧壁和顶盖。侧壁覆盖铜制锥形层，构成法拉第笼 | ||
| 钨丝（直径：50 mm） | California Fine Wires Company | 用于皮层 LFP 记录的电极 | |
| 不锈钢螺钉 （直径：0.6 mm） | 用于 ECoG 记录的电极 | ||
| 电动颅骨钻 | RWD Life Science | ||
| 钻头（直径：0.5 mm） | RWD Life Science | 用于钻制 ECoG 螺钉的孔洞 | |
| 钻头（直径：0.2 mm） | RWD Life Science | 用于钻制深部导线的孔洞 | |
| 牙科丙烯酸粉末 | SNC dental | ||
| 牙科丙烯酸液体 | SNC dental | ||
| 石蜡 | Fisher Scientific | 该混合物用于封闭开颅部位，以确保后续微丝电极阵列的移动 | |
| 矿物油 | Fisher Scientific | ||
| 电凝器 | Bovie medical Corporation | ||
| RHD2132 放大器板 | Intan Technologies | 32 通道前置放大器 | |
| RHD2000 系统 | Intan Technologies | 数据采集系统 | |
| 红外钕掺杂钇铝钙钛矿（Nd:YAP）激光发生器 | Electronical Engineering | ||
| Matlab R2016b | The MathWorks |
参考文献
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