在自由运动大鼠的反应中, 皮质局部电位和电皮质图谱的同时记录

Summary

我们开发了一种技术, 同时记录电皮质成像和局部场电位, 以响应来自自由移动的大鼠的诱发电位激光刺激。这项技术有助于在介观和宏观层面建立电皮质信号的直接关系, 这有利于大脑中的噪声信息处理的研究。

Abstract

选择性激活无噪声神经末梢的激光热脉冲引起的电皮质反应, 在许多动物和人类研究中被广泛用于研究诱发电位信息的皮质处理。这些激光唤起的脑电位 (lep) 由几个瞬态反应组成, 这些响应是随着激光刺激的发生而被时间锁定的。然而, lep 响应的功能特性在很大程度上仍然是未知的, 因为缺乏一种采样技术, 可以同时记录皮层表面的神经活动 (即电皮质图 [ecog] 和头皮脑电图 [头皮脑电图]) 和大脑内部 (即, 局部场电位 [lfp])。为了解决这个问题, 我们在这里提出了一个使用自由移动的老鼠的动物协议。该协议由三个主要程序组成: (1) 动物准备和手术程序; (2) 同时记录 ecog 和 lfp 对诱发电位激光刺激的反应; (3) 数据分析和特征提取。具体而言, 在3d 打印保护壳的帮助下, 将植入大鼠头骨上的 ecog 和 lfp 电极牢固地固定在一起。在数据收集过程中, 当动物处于自发静止时, 在老鼠的前爪上通过腔底的缝隙传递激光脉冲。持续的白噪声被播放, 以避免激活听觉系统的激光产生的超声波。因此, 只有有选择地记录的是噪声反应。使用标准的分析程序 (例如带通滤波、划时代提取和基线校正) 提取刺激相关的大脑反应, 我们得到的结果表明, 具有高信噪比的 lep 是同时记录从 ecog 和 lfp 电极。这种方法使同时记录 ecog 和 lfp 活动成为可能, 从而在介观和宏观层面提供了一座电皮质信号的桥梁, 从而促进了对噪声信息处理的调查。在大脑中。

Introduction

脑电图是一种记录大脑中数千个神经元同步活动所产生的电势和振荡大脑活动的技术。它被广泛用于许多基础研究和临床应用^1,2。例如, 脑电图对强烈激光热脉冲 (即lep) 的反应被广泛用于研究诱发感觉输入^{3,4, 5的}外围和中央处理。在人类中, lep 主要由三个不同的偏转组成: 早期成分 (n1) 是体细胞组织的, 可能反映初级体感感皮层 (s1)⁶的活动, 以及中心的晚期成分 (n2 和 p2)分布, 更有可能反映二次体感皮层, 脑岛, 和前扣带^{回皮层的活动 7,8}。在以前^{的研究 9,}10, 我们证明, 使用 ecog (一种颅内脑电图) 从直接放置在大脑暴露表面的电极中取样的大鼠 lep 也由三个不同的偏转 (即, 由睡眠动力学组织的 n1 和集中分布的 n2 和 p2)。大鼠 lep 成分的极性、顺序和地形类似于人类 lep11.然而, 由于头皮脑电图和硬膜下脑电图记录^的空间分辨率有限, 13 的脑电图源分析技术^不准确, 神经活动对 lep 成分的详细贡献是很多争论。例如, 目前尚不清楚 s1 是否以及在多大程度上有助于激光刺激引起的皮质反应 (n1) 的早期部分.

与宏观层面的记录技术不同, 使用微线阵列在立体定向装置和微驱动器^{14、15 的}辅助下进行直接颅内记录, 可以测量神经活动 (例如, lfp)) 的特定区域。lfp 主要反映局部神经元群16的抑制或兴奋突触后电位的总和.由于 lfp 采样神经活动反映了记录电极周围数百微米内发生的神经元过程, 这种记录技术被广泛用于研究大脑中的介观水平的信息处理。然而, 它只关注大脑活动的精确局部变化, 无法回答来自多个区域的信号如何整合的问题 (例如, lep 组件如何在多个大脑区域集成)。

值得注意的是, 同时记录自由移动大鼠的 ecog 和皮质 lfp, 可以促进宏观和中观层面的皮质信息处理调查。此外, 这种方法提供了一个极好的机会, 以调查预定义的大脑区域的神经活动在多大程度上对 lep 的贡献。事实上, 以前的几项研究已经评估了尖峰、皮质 lfp 和 ecog 信号¹⁷、¹⁸之间的一致性, 并证明了与 eeg 电极相邻的 lfp¹⁹、²⁰对与刺激相关的大脑反应的形成。然而, 现有的技术通常用于记录麻醉动物的大脑反应, 因为缺乏保护壳, 以防止电极被碰撞损坏。换句话说, 在自由运动的大鼠中, 仍然缺乏在介观 (皮质 lfp) 和宏观 (eeg 和 ecog) 水平上建立电皮质信号桥梁的技术。

为了解决这个问题, 我们开发了一种技术, 可以同时记录自由移动的老鼠大脑多个区域的 ecog 和皮质 lfp。这项技术有助于在介观和宏观层面建立电皮质信号的直接关系, 从而促进大脑中噪声信息处理的研究。

Protocol

实验中使用了成年雄性 sprague-dawley 大鼠 (重400-450 克)。所有手术和实验程序都遵循了《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》。这些程序得到了中国科学院心理学研究所研究伦理委员会的批准。

1. 电极植入术

1. 手术前将大鼠置入具有5% 异氟醚和 1 lmmin 气流率的腔内。
2. 使用立体定向装置, 将老鼠的头部固定在麻醉面罩中。通过麻醉面膜以2% 的浓度管理异氟醚, 气流速率为 0.5 lmmin, 以保持手术过程中的麻醉深度。请注意, 当大鼠对脚趾捏反应不佳时, 手术耐受性就会得到实现。
3. 将眼药膏涂在眼睛上, 避免角膜干燥。
4. 用标准的剃须刀刮掉大鼠头皮的顶部。
5. 使用医用碘消毒液和75% 的酒精对头皮进行消毒, 以去除碘。
6. 注射利多卡因 (2%) 到头皮局部镇痛。服用阿托品 (0.2 ml i. p.) 抑制呼吸分泌过多。
7. 用手术刀在头皮上做一个大约2-3 厘米的中线切口。沿着中线切割和切除部分头皮, 并暴露头盖骨。必要时, 使用电凝器止血。
8. 根据预定义的立体定向坐标 (根据 bregma 的位置放置) 标记 ecog 电极的位置, 以及参考电极和接地电极在中线上的位置 (分别放置在 lambda 上2毫米和4毫米)。
9. ecog 螺钉的钻孔 (直径: 0.5 毫米), 在标记的地点的头骨上使用电动颅骨钻头, 而不会破坏硬脑膜。
10. 驱动不锈钢螺丝 (外径: 0.6 毫米), 连接到绝缘涂层铜线, 进入孔约1毫米深度, 而不穿透下角的硬脑膜。在实验过程中, 这些螺丝起到 ecog、参考和接地电极的作用。
11. 在头盖骨上放置一个保护壳。使用牙科丙烯酸将底座与相邻的螺钉固定在头盖骨上。使用医疗棉, 可以删除后, 以保护地区, 打算用于深度电线植入被覆盖。
    注: 保护壳是定制设计的3d 打印聚乳酸产品, 由三个部分组成: 底座、墙体和瓶盖。墙上覆盖着铜锥形, 作为法拉第笼建造。
12. 根据预定义的立体定向坐标标记深度导线电极的位置。
13. 在头骨上钻小孔 (直径: 0.2 毫米), 在标记的部位进行线注入, 并小心地取出骨瓣, 露出硬脑膜。经常用生理盐水清洗开颅手术。图 1描述了深度导线电极植入前的设置。
14. 使用针头, 在不损坏皮膜、血管和新皮层表面的情况下, 抬起和切割硬脑膜。
15. 将深度导线电极降低到新皮层表面, 然后慢慢穿透大脑到目标深度。经常停止向下移动电极的皮质弹性。在本研究中, 金属丝尖端在皮质表面下的深度为0.5 毫米。
16. 用蜡和石蜡油的混合物密封开颅手术, 以确保深度焊丝电极可以移动, 以便随后进行实验操作。
17. 将使用牙科丙烯酸的电极装置固定在头骨上。
18. 将连接到 ecog 螺钉的每个铜线焊接到连接器模块上的相应通道。用粘土覆盖焊接点, 以避免不同通道之间的潜在接触。
19. 将保护壳壁组装到基座上, 将参考电极和接地电极焊接到相应的通道上。
20. 使用胶带将瓶盖固定在保护壳上, 以避免污染。
21. 手术后立即向大鼠注射青霉素 (60, 000 u, ip), 以防止术后感染。
22. 将大鼠单家在温控和湿度控制的笼子里, 并在手术后的12小时夜间循环中饲养, 在 lep 实验之前至少一周内, 用食物和水保持在盖子周期中。
    注: 为了同时记录 ecog 和皮质 lfp 活动, 这里使用了一种设备, 该设备使用两种类型的电极连接到连接器模块, 其中包含多个微驱动器连接到钨丝阵列。金销用于将钨丝连接到连接器模块的电极接口板 (eib), 方法是将金属丝压入 eib 上的小金属孔。eib 上的两个金属孔用涂层铜线焊接, 每个铜线的开口端都用相应的铜线连接到 ecog 螺钉进行焊接。其他地方已经描述了制造的细节。

2. 数据收集

1. 在实验前连续三天或三天以上, 每天至少给老鼠下一次, 以确保老鼠熟悉实验者²²。
2. 实验前将大鼠放置在行为室至少 1小时, 以确保大鼠适应记录环境。
   注: 该室是一个塑料立方体, 侧面长度为30厘米。所述腔的底部由一个铁格栅制成, 其间隙约为8毫米。
3. 将记录头与电极模块轻轻连接, 以避免吓到大鼠并损坏电极模块。
4. 设置激光发生器, 连接光纤, 并根据设备操作手册调整激光的光斑尺寸。将触发发生器中的数字输出连接到录制板的数字输入端口。
   注: 注意不要过度卷曲光纤, 以避免断开光纤。在录制之前, 请确保触发信号由录制软件显示和记录。在该协议中, 辐射热刺激是由波长为1.34μm 的红外铝钙钛 (nd:yap) 激光产生的。激光光斑尺寸的直径设置为大约5毫米, 通过聚焦透镜。he-ne 激光指向受激区域, 该区域是根据实验目标定义的。并根据实验设计确定了激光脉冲的刺激能量。激光脉冲持续时间为4毫秒。
5. 将摄像机设置在实验室的角落下, 以连续记录大鼠的感知行为, 当它的爪子受到感觉激光刺激。调整相机的位置和方向, 确保在整个实验过程中完全记录出诱发电位的行为。
   注: 强烈建议使用高速电荷耦合器件 (ccd) 摄像机, 因为它可以将操作信号传送到记录系统的主板, 以准确记录事件行为的起始时间和持续时间。每次激光刺激后, 实验者都会根据先前定义的标准, 根据动物运动^23,24, 对感觉行为进行评估, 具体如下: 无运动 (分数 = 0)、转向 (包括晃动或晃动)抬起头; 抬起头。分数 = 1), 退缩 (即, 一个小的突然身体抽搐运动; 得分 = 2), 退出 (即, 爪子从激光刺激; 得分 = 3), 舔和全身运动 (得分 = 4)。
6. 通过机箱顶部的扬声器提供持续的白色噪声 (50 db spl)。
   注: 如先前^{的研究 10,25}所示, 在皮肤上提供的激光刺激会产生可被大鼠听觉系统检测到的超声波。因此, 在整个实验过程中, 持续的白噪声会被播放, 以避免在激光产生的超声波作用下激活听觉系统。这个程序允许选择性地记录大脑的反应与激活的诱发电位系统。
7. 根据设备操作手册, 使用记录系统, 从 ecog 和深度导线电极中收集电生理数据。
   注: 摄像机的操作信号和激光脉冲的触发信号以相同的采样率与电生理数据同时采样 (所有数据都使用 20, 000 赫兹的采样率进行放大和数字化), 从而确保所有数据都是时间同步的。
8. 通过腔底的缝隙将激光脉冲传递到老鼠前爪的足底。
   注: 根据实验者的观察, 只有当大鼠自发静止超过2秒时, 才会发出激光刺激, 以最大限度地减少与运动相关的伪影的信号污染。为了避免照射器疲劳或敏化, 每次刺激后, 激光束的目标都会手动偏移, 两次刺激间隔永远不会短于 40秒, 每个大鼠的 ecog 和 lfp 信号可以记录几次。老鼠需要在每次记录前1小时被放入实验室。在所有的记录过程中, 大鼠被深入麻醉和灌注与冰凉的磷酸盐缓冲盐水其次是4% 的甲醛。大脑被从头骨中取出, 并被切割, 以确定电极的位置。

3. 数据分析

1. 使用1到 30 hz 之间的带通滤波器筛选连续数据。
2. 使用3秒的分析窗口对数据进行时代化, 从激光刺激开始后的1秒延长到2秒。基线校正是通过减去预调色间隔内的平均振幅来执行的。
3. 手动拒绝被严重文物污染的时代。
4. 计算每个实验条件下的时间锁定到激光刺激开始的平均 lep 波形。
5. 计算由 ecog 和深度导线电极记录的 lep 波形的小波变换相干 (wtc)。
   注: wtc 是一种技术, 执行之间的时间和频率的电极对之间的一致性。两个信号之间的 wtc 可以为任何时频点计算, 其优点是为整个时间频谱生成相干值。关于该方法的细节已在其他地方说明26。

Results

在有代表性的实验中, 记录了5只大鼠的电生理数据。激光刺激被传递到每只老鼠的右前爪 20次, 有 gt;40 的刺激间隔。激光诱发电位的大脑反应被记录使用 ecog 螺钉和深度导线, 深度导线被植入双侧原生体感皮质 (s1) 和原发运动皮质 (m1)。

如图 1所示, 两个 ecog (以黑色标记) 和深度导线电极 (以颜色标记, 四个区域各有5条线) 根据立体导震坐标放置在以下位置 (参照 bregma 表示)。毫米;正 x 和 y 轴值分别表示右和前置位置): 左 ecog 中, x =-1.5 和 y = 1.75;在正确的 ecog, x = 1.5 和 y = 1.75;在左 s1, x =-4 和 y = 0.5;在正确的 s1, x = 4 和 y = 0.5;在左边 m1, x =-3 和 y = 3;在正确的 m1, x = 3 和 y = 3。

Discussion

在本研究中, 我们描述了一种技术, 同时记录 ecog 和皮质 lfp 反应引起的噪声激光刺激从自由移动的大鼠。结果表明, 在 ecog 和 lfp 信号中, 激光刺激发生后, lep 响应可以清晰检测到。同时记录 ecog 和皮质 lfp 信号将使科学家能够研究它们之间的关系, 以便更好地了解神经元活动对 lep 组件的贡献。

应注意拟议技术中的五个关键步骤。首先, 重要的是要确保颅骨的表面是干净和干燥的, 然后再固定在它的保护壳的基础上, 使用牙科丙烯酸。此步骤使保护壳底座能够稳定地固定。其次, 由于 ecog 螺丝的直径比孔的直径稍大, 最初的螺钉驱动会扩大孔, 形成螺丝钉。在本研究中, 钨线的孔与 ecog 螺钉的孔之间的距离非常小 (例如, 小于 0.3 mm)。如果所有孔都是在 ecog 螺杆驱动和深度导线插入之前钻孔的, 则 ecog 孔周围的头骨将是脆弱的, 并且在螺钉驱动过程中不会承受孔增大的机械载荷。因此, 在进行钨丝插入的孔钻之前, 需要将 ecog 螺钉驱动到孔中, 形成螺纹。如果插入的 ecog 螺钉在钻钨线的孔时阻碍视图, 建议在协议步...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
雄性 Sprague-Drawley 大鼠	Vital River
异氟醚	RWD 生命科学
小动物异氟醚麻醉系统	RWD 生命科学		包括大鼠麻醉防毒面具
立体定位仪	RWD 生命科学
具有 ECoG 和 LFP 组合电极			的装置该装置是自制的，它将 ECoG 和深度线电极组装到一个连接器模块
3D 打印的保护壳			上，外壳的质地是聚乳酸的，外壳是自制的，包含底座、墙壁和帽子三部分。墙壁上覆盖着铜锥，构成法拉第笼
钨丝（直径：50毫米）	加利福尼亚细线公司		用于皮质LFP记录的电极
不锈钢螺丝 （直径：0.6 mm）			用于 ECoG 记录
的电极 电动颅钻	RWD 生命科学
钻头（直径：0.5 mm）	RWD Life Science		该钻头用于钻 ECoG 螺钉的孔
钻头（直径：0.2毫米）	RWD Life Science		该钻头用于钻深线的孔
牙科芳基粉末	SNC 牙科
牙科芳基液体	SNC 牙科
石蜡	Fisher Scientific		该混合物用于密封开颅手术，以确保微线阵列的后续运动
矿物油	Fisher Scientific
电凝器	Bovie medical Corporation
RHD2132放大器板	Intan Technologies		A 32 通道前级
RHD2000 系统	Intan Technologies		数据采集系统
红外钕钇铝钙钛矿 （Nd：YAP） 激光发生器	电子工程
Matlab R2016b	The MathWorks