本文展示了从正常、炎症及恶性小鼠皮肤中 体内 定量白细胞迁移出的实验方法。我们对两种模型进行了直接比较：经皮 FITC 应用与 原位 光转化技术。此外，我们还展示了光转化技术在追踪白细胞从皮肤肿瘤迁移出过程中的应用价值。
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本文内容
摘要
摘要
白细胞从外周组织迁移至引流淋巴结不仅对免疫监视和免疫应答的启动至关重要，而且有助于外周组织免疫反应的消退。尽管已有多种方法用于量化白细胞从非淋巴器官的外周组织中的迁移，但调控其依赖于微环境的迁移过程的细胞与分子机制仍不甚清楚。本文描述了 原位 用于定量分析白细胞从小鼠皮肤和肿瘤中移出的光转化技术。光转化可直接标记存在于皮肤组织中的白细胞。尽管皮肤暴露于紫光会引发局部炎症反应，表现为白细胞浸润和血管通透性增加，但在与经皮施用荧光示踪剂的直接比较中，光转化技术特异性地标记了迁移性树突状细胞群体，同时实现了对髓系和淋巴系细胞从皮肤微环境及肿瘤中移出的定量分析。白细胞移出机制是我们理解肿瘤内白细胞复杂性所缺失的重要环节，因此，本文所述工具的应用将为肿瘤免疫微环境在稳态条件下及对治疗响应时的动态变化提供独特的见解。
引言
外周组织的免疫应答不仅由白细胞募集至炎症部位所决定，还受到调控其后续滞留机制的影响。因此，保护性免疫取决于一系列累积的细胞与分子机制，这些机制共同决定白细胞是进入外周组织、在组织内停留，还是通过淋巴管迁移出组织。值得注意的是，白细胞经淋巴管离开组织的倾向（称为外迁）与其特化功能密切相关。树突状细胞（DC）在成熟信号刺激下获得迁移能力，从而将抗原转运至引流淋巴结（dLN）并进行呈递，这一过程对适应性免疫的启动至关重要。1清除型髓系细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）通过吞噬作用清除凋亡碎片。在细菌感染期间，中性粒细胞从组织迁移至深部淋巴结（dLNs），最终发生凋亡。2 在DSS诱导的结肠炎模型中，数据支持巨噬细胞外排对于缓解局部炎症是必要的这一假设3然而，中性粒细胞和巨噬细胞的迁移是否发生在所有炎症环境中尚不清楚。关于T淋巴细胞从稳态下迁移的证据4,5,6,7，感染的8，以及发炎的4,9
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方案
所有动物实验方案均已获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会的批准 & 科学大学
1. 小鼠耳廓炎症诱导与FITC涂抹
- 在超净工作台中，使用气化异氟烷对C57Bl/6小鼠进行麻醉（诱导麻醉时异氟烷浓度为3-5%，维持麻醉时为1-3%；氧气流速为0.5-1.0 L/min）。通过监测足底反射消失、无自主运动及呼吸频率降低来确认麻醉效果。
- 将小鼠耳朵平铺，耳腹面朝上。用移液器将20 µL溶于丙酮:邻苯二甲酸二丁酯（DBP）（1:1）的5% FITC溶液滴加至耳廓腹面。静置数秒使耳朵自然干燥。
- 应用FITC后24小时，通过二氧化碳暴露处死小鼠，随后行颈椎脱位确认死亡。使用剪刀将耳廓从头部剪下并收集至PBS中。用镊子分离周围组织，将颈部引流淋巴结（cervical dLNs）和腹股沟非引流淋巴结（inguinal non-draining LNs）收集至PBS中。腹股沟非引流淋巴结将作为检测FITC+/Kaede red+白细胞的阴性对照。按照机构规定处理动物尸体。
注意：光转化后最佳分析时间取决于细胞类型及其已知的迁移行为。例如，树突状细胞在DBP处理后6小时即可在引流淋巴结中被检测到。
2. 小鼠耳廓炎症诱导与光转化
- 在超净工作台中，通过腹腔注射80 ....
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结果
我们首先尝试重复文献中报道的光转化实验结果，以评估其效率并确定小鼠皮肤中伴随的炎症反应。耳廓暴露于100 mW的紫光（405 nm）照射3分钟，操作方法如前所述。33耳部皮肤或颈部引流淋巴结在暴露后立即制备的单细胞悬液显示，所有CD45细胞中转化效率达到78%+ 皮肤中存在白细胞，但在dLNs中未观察到转化细胞（图1A）。为了评估与光转化相关的炎症反应，我们对浸润的 CD45 细胞数量进行了定量分析+ 转化后0小时和24小时耳部白细胞图1B以及通过 Mile's 测定法测量的血管通透性的急性变化42 (图1C）。简而言之， 200 µL 0.5%伊文思蓝在光转化后2小时经血管内注射。注射后30分钟取耳组织，用甲酰胺提取伊文思蓝24小时 55°C （在 610.......
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讨论
尽管白细胞从外周非淋巴组织中的逸出对于免疫应答的启动与消退至关重要，但调控该逸出过程的分子机制仍不甚清楚。这一知识空白在很大程度上源于可用于定量分析的工具尚不完善。 体内在此，我们描述了使用光转换小鼠（Kaede-Tg）来定量内源性白细胞从皮肤和肿瘤中的迁移，并在炎症与感染模型中将其与FITC染料标记法进行直接的头对头比较。我们证明，尽管两种模型均可追踪内源性树突状细胞（DC）群体，但FITC的自由引流及其被非吞噬细胞摄取效率低下，限制了FITC染料在分析髓系和淋巴系细胞从外周非淋巴组织（包括肿瘤）迁移中的广泛应用。此外，我们提供了数据表明，细胞从肿瘤中的迁移是选择性的而非随机的，从而证实了Torcellan等人所提出的发现。 等39进一步研究白细胞从肿瘤中迁移的机制，可能为肿瘤相关炎症和免疫提供新的见解。
我们首先评估了在文献报道的实验条件下，光转化在小鼠皮肤中的效率及其对局部炎症的影响。以100 mW功率的紫光照射耳部3分钟，可实现耳部皮肤内CD45+细胞的有效光转化（转化.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 Marcus Bosenberg 博士提供了 YUMM 1.1 和 YUMM 1.7 小鼠黑色素瘤细胞系，以及 Deborah J. Fowell 博士提供了 B6.Cg-Tg(CAG-tdKaede)15Utr 小鼠，该小鼠系根据日本文部科学省国家生物资源项目（MEXT NBRP）与理化学研究所生物资源研究中心（RIKEN BRC）协议获得。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶D | Roche | 11088866001 | |
| 脱氧核糖核酸酶（DNase） | Roche | 4536282001 | |
| 带光纤和准直器的Silver-LED-405B光源 | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| 异硫氰酸荧光素同分异构体I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| 邻苯二甲酸二丁酯 | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| 丙酮 | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29号针头注射器 | Exel International | 26029 | |
| 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 μm细胞筛 | VWR | 732-2758 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | L34966 | |
| 纯化抗小鼠CD16/CD32抗体 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605标记CD11c（克隆N418） | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5标记MHCII（克隆M5/114.15.2） | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421标记CD3e（克隆145-2C11） | Biolegend | 100341 | |
| APC标记CD8a（克隆53-6.7） | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7标记CD45（克隆30-F11） | Biolegend | 103116 | |
| BV650标记CD19（克隆6D5） | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5标记Ly6C（克隆HK1.4） | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647标记F4/80（克隆BM8） | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7标记Ly6G（克隆1A8） | Biolegend | 127623 | |
| BV711标记CD11b（克隆M1/70） | Biolegend | 101241 | |
| BV605标记CD45（克隆30-F11） | Biolegend | 103155 | |
| BV711标记CD4（克隆RM4-5） | BD Biosciences | 563726 | |
| 牛血清白蛋白（V组分） | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| 抗大鼠和抗仓鼠Igk/阴性对照补偿微粒组 | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10软件 | FlowJo |
参考文献
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in l....
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