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方法文章

量化白细胞通过小鼠皮肤和肿瘤淋巴管的迁移

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DOI：

10.3791/58704

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2019年1月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

本文内容

摘要

本文展示了从正常、炎症及恶性小鼠皮肤中 体内 定量白细胞迁移出的实验方法。我们对两种模型进行了直接比较：经皮 FITC 应用与 原位 光转化技术。此外，我们还展示了光转化技术在追踪白细胞从皮肤肿瘤迁移出过程中的应用价值。

摘要

白细胞从外周组织迁移至引流淋巴结不仅对免疫监视和免疫应答的启动至关重要，而且有助于外周组织免疫反应的消退。尽管已有多种方法用于量化白细胞从非淋巴器官的外周组织中的迁移，但调控其依赖于微环境的迁移过程的细胞与分子机制仍不甚清楚。本文描述了 原位 用于定量分析白细胞从小鼠皮肤和肿瘤中移出的光转化技术。光转化可直接标记存在于皮肤组织中的白细胞。尽管皮肤暴露于紫光会引发局部炎症反应，表现为白细胞浸润和血管通透性增加，但在与经皮施用荧光示踪剂的直接比较中，光转化技术特异性地标记了迁移性树突状细胞群体，同时实现了对髓系和淋巴系细胞从皮肤微环境及肿瘤中移出的定量分析。白细胞移出机制是我们理解肿瘤内白细胞复杂性所缺失的重要环节，因此，本文所述工具的应用将为肿瘤免疫微环境在稳态条件下及对治疗响应时的动态变化提供独特的见解。

引言

外周组织的免疫应答不仅由白细胞募集至炎症部位所决定，还受到调控其后续滞留机制的影响。因此，保护性免疫取决于一系列累积的细胞与分子机制，这些机制共同决定白细胞是进入外周组织、在组织内停留，还是通过淋巴管迁移出组织。值得注意的是，白细胞经淋巴管离开组织的倾向（称为外迁）与其特化功能密切相关。树突状细胞（DC）在成熟信号刺激下获得迁移能力，从而将抗原转运至引流淋巴结（dLN）并进行呈递，这一过程对适应性免疫的启动至关重要。1清除型髓系细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）通过吞噬作用清除凋亡碎片。在细菌感染期间，中性粒细胞从组织迁移至深部淋巴结（dLNs），最终发生凋亡。2 在DSS诱导的结肠炎模型中，数据支持巨噬细胞外排对于缓解局部炎症是必要的这一假设3然而，中性粒细胞和巨噬细胞的迁移是否发生在所有炎症环境中尚不清楚。关于T淋巴细胞从稳态下迁移的证据4,5,6,7，感染的8，以及发炎的4,9,10,11,12 外周非淋巴组织中的研究表明，T细胞会主动再循环，但驱动其离开组织的组织内信号仍不甚清楚。多项研究已鉴定出T细胞向引流淋巴毛细管定向迁移及随后迁移出组织所必需的信号，包括趋化因子（C-C基序）配体21（CCL21）及其受体CCR7。4,11,13，趋化因子（C-X-C基序）配体12（CXCL12）及其受体CXCR42,14，以及鞘氨醇-1-磷酸（S1P）10,15,16然而，这些机制并非在所有情况下都具有活性，它们是否决定所有细胞类型的逸出仍有待阐明。重要的是，要深入了解调控逸出的机制及其在疾病中的功能相关性，需要进行定量分析 体内 分析方法

已在多种动物模型中采用多种方法来定量分析逸出过程 体内 包括淋巴管直接插管、过继性细胞转移 离体 标记的白细胞、荧光示踪剂的经皮应用、标记颗粒的注射，以及 体内 光转化17,18直接插管小鼠传入淋巴管较为困难，且由于可收集液体体积的限制，在小型动物中的应用受到局限。因此，插管技术主要在大型动物中进行例如，绵羊）中进行此类手术操作是可行的。这些研究为淋巴液中存在淋巴细胞和髓系细胞提供了直接证据10,19,20此外，绵羊模型显示，急性和慢性炎症使淋巴液中的淋巴细胞数量增加了近100倍10,21.

标记并经基因改造的淋巴细胞过继转移实验已明确证实，CCR7 对 CD4+ T 细胞从外周组织向次级淋巴器官的迁移至关重要。+ 急性炎症皮肤中的T细胞5,11，而淋巴细胞经小分子S1P受体激动剂FTY720预处理后，仅能部分抑制其迁移出10有趣的是，转移的淋巴细胞从慢性炎症皮肤中的迁移不依赖于 CCR7。10，但可能部分依赖 CXCR49. 然而，过继转移实验所递送的细胞数量非生理水平 离体 通过注射将活化并标记的淋巴细胞导入组织，这会改变组织的生物力学环境，升高间质液压力，从而打开初始淋巴毛细管并改变其运输特性22作为替代方法，可在有或无皮肤刺激物存在的情况下经皮应用异硫氰酸荧光素（FITC）例如邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）或感染23,24 可实现对吞噬示踪剂并迁移至引流淋巴结（dLNs）的吞噬细胞的追踪。类似地，荧光标记的肿瘤可用来追踪已摄取肿瘤物质的吞噬细胞25这些方法为揭示调控树突状细胞迁移的机制提供了重要见解13,14,17,26,27 但无法追踪非吞噬性淋巴细胞，且可溶性FITC通过自由淋巴引流可能导致非迁移性的淋巴结常驻树突状细胞（DCs）被标记，从而干扰结果解读。

此外，活体显微镜是一种强大的工具，可实现对生理相关白细胞群体进行实时的体内追踪28,29。结合报告基因小鼠和基于抗体的体内免疫荧光标记技术，活体显微镜已揭示了免疫细胞迁移过程中复杂的空间和时间动态，包括间质迁移30、穿越淋巴管内皮细胞的跨内皮迁移、在淋巴管腔内的运行以及进入淋巴结后的迁移过程28,31。然而，由于设备成本高、实验设置需要专业技术以及在定量多种细胞类型方面通量有限，活体成像技术的广泛应用仍受到限制。尽管如此，将分析群体动态组织的定量方法与活体成像相结合，将为进一步阐明细胞向淋巴毛细血管迁移及在其中运动的机制提供额外且重要的机制性见解18,31,32。

因此， 体内 光转换已成为一种允许实现 原位 标记，且不受吞噬活性影响，可用于在有或无刺激条件下定量生理状态下的白细胞迁移（结合流式细胞术）。Kaede-Tg 小鼠持续表达一种源自石珊瑚的蛋白质，该蛋白在暴露于紫光前呈绿色荧光（Kaede green），经紫光照射后不可逆地转变为红色荧光（Kaede red）33光转换后的细胞可被追踪其从外周组织位点迁移并积聚到引流淋巴结（dLNs）的过程。此类及其他类似的光转换小鼠模型34,35 揭示了重要的生物学现象，包括调节性T细胞从皮肤的持续迁移36，CXCR4依赖性B细胞从派伊尔集合淋巴结的迁移37肽再次刺激后驻留记忆T细胞的动员38以及白细胞从肿瘤微环境中的广泛迁移39在此，我们对光转化法与经皮FITC应用在皮肤炎症和感染背景下的效果进行直接比较，以实现现有数据与光转化方法的直接对照。此外，我们展示了植入性肿瘤中的光转化效果，并描述了其转化效率以及白细胞从肿瘤微环境中的选择性迁移。因此，我们认为有必要进一步应用这些方法，以阐明白细胞从肿瘤中迁移的关键生物学过程，这将对解析肿瘤内白细胞复杂性、抗肿瘤免疫及治疗反应具有重要意义。

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方案

所有动物实验方案均已获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会的批准 & 科学大学

1. 小鼠耳廓炎症诱导与FITC涂抹

  1. 在超净工作台中，使用气化异氟烷对C57Bl/6小鼠进行麻醉（诱导麻醉时异氟烷浓度为3-5%，维持麻醉时为1-3%；氧气流速为0.5-1.0 L/min）。通过监测足底反射消失、无自主运动及呼吸频率降低来确认麻醉效果。
  2. 将小鼠耳朵平铺，耳腹面朝上。用移液器将20 µL溶于丙酮:邻苯二甲酸二丁酯（DBP）（1:1）的5% FITC溶液滴加至耳廓腹面。静置数秒使耳朵自然干燥。
  3. 应用FITC后24小时，通过二氧化碳暴露处死小鼠，随后行颈椎脱位确认死亡。使用剪刀将耳廓从头部剪下并收集至PBS中。用镊子分离周围组织，将颈部引流淋巴结（cervical dLNs）和腹股沟非引流淋巴结（inguinal non-draining LNs）收集至PBS中。腹股沟非引流淋巴结将作为检测FITC+/Kaede red+白细胞的阴性对照。按照机构规定处理动物尸体。
    注意：光转化后最佳分析时间取决于细胞类型及其已知的迁移行为。例如，树突状细胞在DBP处理后6小时即可在引流淋巴结中被检测到。

2. 小鼠耳廓炎症诱导与光转化

  1. 在超净工作台中，通过腹腔注射80 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪（溶于生理盐水）麻醉Kaede-Tg小鼠（背景为C57Bl/6）。确保麻醉效果符合步骤1.1所述标准。
  2. 将耳朵平铺，耳腹面朝上。用移液器向耳廓腹面滴加20 µL 1:1丙酮:DBP混合液，静置数秒使其自然干燥。
  3. 应用DBP后，在铝箔上剪开一条切口，将耳朵穿过切口，使耳部暴露于紫光光源下。用双面胶带将耳朵固定在铝箔上，背面朝上并保持平整。
  4. 将耳朵置于光源正下方，使用405 nm光源（功率100 mW）照射3分钟以完成光转化。
  5. 光转化后24小时，处死Kaede-Tg小鼠，并按照步骤1.3所述方法取下耳廓、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结。
    注意：除步骤1.3中提到的注意事项外，细胞增殖速率将决定分析时间点，因为快速分裂的细胞中Kaede红色信号会逐渐丢失。

3. 小鼠耳廓的痘苗病毒感染及FITC应用

  1. 按照步骤1.1所述，使用气化异氟烷麻醉C57Bl/6小鼠。
  2. 将耳朵腹侧展平。用移液器将5 × 106斑块形成单位（PFU）的痘苗病毒（VacV）溶于10 µL PBS中，滴加至耳廓上。使用29号针头在耳廓上穿刺25次40。
  3. 感染后24小时，按照步骤1.1所述使用异氟烷麻醉VacV感染的小鼠，并将20 µL溶于丙酮中的5% FITC滴加至耳廓腹侧。静置数秒使耳朵干燥。
  4. FITC处理24小时后，处死小鼠，并按照步骤1.3所述采集耳廓、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结。
    注意：为评估不同时间点树突状细胞（DC）向引流淋巴结的迁移情况，可在感染后的任意时间点施加FITC，随后均间隔24小时进行观察。我们先前报道过，从感染后第1天至第3天，DC向引流淋巴结的迁移水平保持相似41。

4. 小鼠耳廓的痘苗病毒感染与光转化。

  1. 按照步骤1.1所述，使用气化异氟烷麻醉Kaede-Tg小鼠。
  2. 按照步骤3.2所述，用VacV感染耳廓。
  3. 感染后24小时，按照步骤2.1所述麻醉感染VacV的Kaede小鼠，并按照步骤2.3–2.4进行光转化。
  4. 光转化后24小时，处死小鼠，并按照步骤1.3所述取耳廓、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结。
    注意：如步骤3.4中所述，光转化可在感染后的任意时间点进行。

5. 耳部和淋巴结样本制备用于流式细胞术

  1. 制备耳廓单细胞悬液：使用两把镊子将耳廓的腹侧和背侧分离，并将耳廓内侧朝下放入24孔板的孔中，孔内含有用Hank’s平衡盐溶液（HBSS，含Ca2+和Mg2+）稀释的1 mg/mL胶原酶D和80 U/mL DNase。在37 °C孵育30分钟。将消化后的组织通过70 µm尼龙细胞滤网压滤。
  2. 从淋巴结制备单细胞悬液：将淋巴结放入24孔板的孔中，孔内含有用HBSS稀释的1 mg/mL胶原酶D和80 U/mL DNase。用两根29号针头轻轻撕开淋巴结包膜，然后在37 °C孵育30分钟。将消化后的组织通过70 µm尼龙细胞滤网压滤。

6. 皮肤内黑色素瘤肿瘤植入与光转化。

  1. 使用电动剃刀剃除Kaede-Tg小鼠背部中央的毛发。
  2. 将29号针头置于左右肩胛骨上缘背部中央位置，进行皮内注射5 x 105 将肿瘤细胞（溶于50 µL生理盐水中）注射至Kaede-Tg小鼠的皮肤内。必须准确定位肿瘤位置，以确保其淋巴引流至指定的淋巴结即，背部上半部中央接种肿瘤时，取左侧和右侧臂淋巴结（brachial LNs）。避免将肿瘤置于引流淋巴结（dLN）上方，以免光线经皮肤或肿瘤直接穿透导致淋巴结发生光转化。
  3. 让肿瘤生长至所需大小（100–650 mm）3).
  4. 在组织取材前一天，按照2.1节所述方法麻醉Kaede-Tg小鼠，并剃除肿瘤周围新长出的毛发。
  5. 在铝箔上剪一个圆形小孔，将肿瘤穿过小孔暴露于光源下。小孔直径应略小于肿瘤，以防止肿瘤回缩穿过小孔，并尽量减少邻近非肿瘤皮肤的光转化。
  6. 将肿瘤置于光源正下方，使用405 nm波长、200 mW功率的光源照射5分钟进行光转化。
  7. 光转换后24 h，按照步骤1.3所述方法处死小鼠。将肿瘤、腋窝引流淋巴结（brachial dLNs）和腹股沟非引流淋巴结（inguinal non-draining LNs）收集至PBS中。用剪刀将肿瘤组织与周围皮肤分离，淋巴结的剥离方法同步骤1.3所述。

7. 肿瘤和淋巴结的流式细胞术处理

  1. 制备肿瘤的单细胞悬液：将肿瘤用剪刀剪碎，放入含有1 mg/mL胶原酶D和80 U/mL DNase（溶于HBSS中）的24孔板孔内。37 °C孵育1小时。将消化后的组织通过70 µm尼龙滤网压滤。
  2. 按步骤5.2所述方法制备淋巴结的单细胞悬液。

8. 流式细胞术抗体染色

  1. 将组织消化为单细胞悬液后，采用标准的流式细胞术染色技术，用目标标记物对细胞进行标记。简言之，将 2 × 106 个细胞移入 96 孔板中。在冰上用 Fc 封闭剂（1 µg/mL）孵育样本 20 分钟，用 FACs 缓冲液（含 1% 牛血清白蛋白的 PBS）洗涤两次。向样本中加入活/死细胞染料（用 PBS 稀释），冰上孵育 15 分钟，再用 FACs 缓冲液洗涤两次。加入用 FACs 缓冲液稀释的一抗（材料表）在冰上孵育 30 分钟，随后用 FACs 缓冲液洗涤两次。
    注意：Kaede 绿色和 Kaede 红色荧光与 FITC 和 PE 荧光基团存在光谱重叠；因此，FITC 和 PE 标记的抗体不能与 Kaede 蛋白联合使用。
  2. 染色完成后，在流式细胞仪上检测样本。或者，可用 2% 多聚甲醛固定细胞。

9. 流式细胞术分析

  1. 将FITC（Kaede绿色）和PE（Kaede红色）通道的PMT电压设置为总范围的70-80%（中心群体位于约10处）4) 使用 离体 Kaede 绿色或 Kaede 红色单色脾细胞或血液
    注意：不要对Kaede绿色（FITC）和Kaede红色（PE）通道进行补偿，否则会导致信号扩散更明显。
    1. 为制备单色Kaede对照，从Kaede-Tg小鼠中采集脾脏或血液。用ACK缓冲液裂解红细胞，然后将细胞分为两组：未转化的Kaede绿色和转化后的Kaede红色。
    2. 对于单色Kaede红色对照，将细胞重悬于1 mL PBS中，置于24孔板中，使用405 nm光源（功率100 mW）照射5分钟进行光转化。使用这些细胞在流式细胞仪上设定Kaede绿色（FITC）和Kaede红色的PMT电压（步骤9.1）。
  2. 在设定好Kaede蛋白的电压后，按照制造商的说明，使用单荧光标记的补偿微珠对所有其他一抗染色进行补偿。
  3. 在流式细胞仪上运行样品以收集数据。
    注意：Kaede蛋白会持续由细胞产生。这意味着光转换24小时后，转换后的细胞将同时表达Kaede绿色和Kaede红色，因为新合成的Kaede（绿色）蛋白已在细胞内积累。
  4. 使用 FlowJo 软件或类似软件分析数据。

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结果

我们首先尝试重复文献中报道的光转化实验结果，以评估其效率并确定小鼠皮肤中伴随的炎症反应。耳廓暴露于100 mW的紫光（405 nm）照射3分钟，操作方法如前所述。33耳部皮肤或颈部引流淋巴结在暴露后立即制备的单细胞悬液显示，所有CD45细胞中转化效率达到78%+ 皮肤中存在白细胞，但在dLNs中未观察到转化细胞（图1A）。为了评估与光转化相关的炎症反应，我们对浸润的 CD45 细胞数量进行了定量分析+ 转化后0小时和24小时耳部白细胞图1B以及通过 Mile's 测定法测量的血管通透性的急性变化42 (图1C）。简而言之， 200 µL 0.5%伊文思蓝在光转化后2小时经血管内注射。注射后30分钟取耳组织，用甲酰胺提取伊文思蓝24小时 55°C （在 610...

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讨论

尽管白细胞从外周非淋巴组织中的逸出对于免疫应答的启动与消退至关重要，但调控该逸出过程的分子机制仍不甚清楚。这一知识空白在很大程度上源于可用于定量分析的工具尚不完善。 体内在此，我们描述了使用光转换小鼠（Kaede-Tg）来定量内源性白细胞从皮肤和肿瘤中的迁移，并在炎症与感染模型中将其与FITC染料标记法进行直接的头对头比较。我们证明，尽管两种模型均可追踪内源性树突状细胞（DC）群体，但FITC的自由引流及其被非吞噬细胞摄取效率低下，限制了FITC染料在分析髓系和淋巴系细胞从外周非淋巴组织（包括肿瘤）迁移中的广泛应用。此外，我们提供了数据表明，细胞从肿瘤中的迁移是选择性的而非随机的，从而证实了Torcellan等人所提出的发现。 等39进一步研究白细胞从肿瘤中迁移的机制，可能为肿瘤相关炎症和免疫提供新的见解。

我们首先评估了在文献报道的实验条件下，光转化在小鼠皮肤中的效率及其对局部炎症的影响。以100 mW功率的紫光照射耳部3分钟，可实现耳部皮肤内CD45+细胞的有效光转化（转化...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Marcus Bosenberg 博士提供了 YUMM 1.1 和 YUMM 1.7 小鼠黑色素瘤细胞系，以及 Deborah J. Fowell 博士提供了 B6.Cg-Tg(CAG-tdKaede)15Utr 小鼠，该小鼠系根据日本文部科学省国家生物资源项目（MEXT NBRP）与理化学研究所生物资源研究中心（RIKEN BRC）协议获得。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胶原酶DRoche11088866001
脱氧核糖核酸酶（DNase）Roche4536282001
带光纤和准直器的Silver-LED-405B光源Prizmatix LtdV8144
异硫氰酸荧光素同分异构体ISigma-AldrichF4274
邻苯二甲酸二丁酯Sigma-Aldrich524980
丙酮Macron Fine Chemicals2440-02
29号针头注射器Exel International26029
伊文思蓝Sigma-AldrichE2129
70 μm细胞筛VWR732-2758
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染色试剂盒InvitrogenL34966
纯化抗小鼠CD16/CD32抗体Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605标记CD11c（克隆N418）Biolegend117334
PerCP-Cy5.5标记MHCII（克隆M5/114.15.2）BD Pharmingen562363
BV421标记CD3e（克隆145-2C11）Biolegend100341
APC标记CD8a（克隆53-6.7）TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7标记CD45（克隆30-F11）Biolegend103116
BV650标记CD19（克隆6D5）Biolegend115541
PercCP-Cy5.5标记Ly6C（克隆HK1.4）Biolegend128011
Alexa Fluor 647标记F4/80（克隆BM8）Biolegend123121
APC-Cy7标记Ly6G（克隆1A8）Biolegend127623
BV711标记CD11b（克隆M1/70）Biolegend101241
BV605标记CD45（克隆30-F11）Biolegend103155
BV711标记CD4（克隆RM4-5）BD Biosciences563726
牛血清白蛋白（V组分）Fisher ScientificBP1600-100
抗大鼠和抗仓鼠Igk/阴性对照补偿微粒组BD Biosciences552845
Fortessa流式细胞仪BD Biosciences
FlowJo v10软件FlowJo

参考文献

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