用于3D打印脱细胞基质的新工艺

摘要

本方案描述了制备嵌入含有脱细胞基质（DM）的聚乳酸（PLA）微球的聚己内酯（PCL）丝材的方法，用于3D打印结构组织工程支架。

摘要

3D生物打印旨在创建具有生物活性、可满足特定尺寸与几何形状需求的定制支架。热塑性材料骨架可提供类似于天然组织的机械稳定性，而生物活性因子则为祖细胞提供组分信号，促进其迁移、增殖和分化，从而重建原始组织或器官^1,2不幸的是，许多与3D打印兼容的生物可吸收聚合物（如聚乳酸，PLA）需要在210 °C或更高温度下打印，而这些温度会对生物活性物质造成损害。另一方面，聚己内酯（polycaprolactone, PCL）是另一种类型的聚酯，是一种可生物降解且适用于3D打印的材料，其打印温度较为温和，仅为65 °C。因此，本研究假设：将去细胞化细胞外基质（DM）包裹在具有热保护作用的PLA屏障内，并将其嵌入PCL丝材中进行打印，可使其保持功能性构象。本研究以骨软骨修复为应用目标，验证该假设。为此，将猪软骨去细胞化后封装于聚乳酸（PLA）微球中，再与聚己内酯（PCL）共挤出成丝材，用于制备3D结构体 通过 熔融沉积成型。对含有或不含微球的支架（分别为PLA-DM/PCL和PCL(-)）进行表面特征差异的评估。

引言

目前用于骨、软骨、肌腱和韧带重建等临床应用的组织工程技术，通常采用自体移植和同种异体移植来修复受损组织。这些技术在临床实践中常规作为"金标准"，首先从患者自身或尸体供体中获取移植物，然后将其植入缺损部位²。然而，这些策略受限于供区并发症、大范围缺损时供体组织稀缺、感染风险，以及难以找到与所需几何形状匹配的移植物。此外，研究显示，用于重建的同种异体移植物在力学性能和生物学特性方面均低于天然组织³。鉴于上述局限，组织工程领域近年来转向三维（3D）生物打印技术，以制造具有生物活性、可定制的复杂几何结构，能够适应缺损的大小和形状，并在生物重塑完成前提供足够的力学性能。

理想的3D打印支架应由聚合物骨架构成，该骨架可保持天然组织所需的机械稳定性，同时所掺入的生物活性物质可为周围细胞提供生化信号，促进其迁移、增殖、分化及组织生成^2,5遗憾的是，大多数含有生物组分的构建物都是用凝胶或聚合物制成的，其强度太低，无法承受 体内 靶向组织在自体/异体移植重建过程中所受的力。其他聚合物如聚乳酸（PLA）具有生物可吸收性、可3D打印且结构稳定，但其打印温度在210 °C及以上，导致无法在制造过程中共打印生物活性物质。聚己内酯（PCL）是另一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的生物可吸收聚合物，可在较低温度（65 °C）下进行3D打印，近年来在制造具有复杂形态的患者特异性植入物方面应用日益广泛^5,6,7,8,9然而，大多数采用气动技术的生物打印机无法在较低温度下打印PCL，而较低温度是保持生物活性不受损害的必要条件。迄今为止，尚未实现将这些聚合物与自体/异体移植物结合成一种新型可打印生物材料。由于缺乏此类材料，实现真正意义上的组织工程化组织重建仍不现实。因此，我们尝试将PLA、PCL与脱细胞异体基质（DM）相结合，以充分利用各材料的优势，制造出能够重建复杂组织的可行结构。该工艺将提供必要的初始机械强度以抵抗 体内 力和热稳定性，以适应在可诱导所需组织形成的构建物中进行增材制造。

在最近一项旨在解决上述难题的研究中，我们证明了将脱细胞软骨细胞外基质包裹于具有热保护作用的聚乳酸（PLA）屏障内，并将其挤出形成聚己内酯（PCL）丝材是可行的，且该结构仍能保持脱细胞基质（DM）影响周围宿主细胞的能力²。这一发现激励我们进一步探索具有临床应用价值的组织重建策略。在本研究中，我们利用该平台技术构建了一体化的支架材料，其中包含PLA、DM和PCL（PLA-DM/PCL）。

我们的目标是利用所提出的新型生物制造技术，更精确地模拟天然组织，以提高同种异体移植物的疗效和实用性，并最终将其应用于多种领域。

方案

1. 微球的获取与预处理

1. 制备含有目标基质（PLA-DM）包封的微球²。
   注意：微球必须具有均匀的尺寸。因此，在使用前对微球进行筛分至关重要。尽管基质脱细胞及包封过程已在先前的文献中详细描述²，以下仍提供该过程的简要概述。
   1. 首先，从猪后肢获取软骨组织块。使用0.05%胰蛋白酶/0.5 mm四钠乙二胺四乙酸（EDTA）、DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）、1.5%过氧乙酸和2.0% Triton X-100依次进行洗涤脱细胞处理，每步处理4小时，每步前后均用蒸馏水清洗²。
   2. 将脱细胞后的基质排干，冷冻、冻干、研磨，并溶解于胃蛋白酶溶液中。溶解完成后，将该胃蛋白酶溶液与已溶于二氯甲烷的PLA混合。
   3. 将上述混合液逐滴加入3%聚乙烯醇水溶液中。离心收集生成的微球，冲洗、排干后再次冻干。
      注意：有关该过程的完整细节，请参见先前发表的实验方案²。
2. 对微球进行筛分。
   1. 确保所有筛板在使用前已彻底清洁并完全干燥。如有必要，使用超声波清洗器清洗筛网，以确保筛网上无残留微球。
   2. 将筛分仪组装好，最上层放置106 µm筛网，中间层为53 µm筛网，底部为接样盘。
   3. 将干燥的微球置于最上层筛网中，并盖上顶盖。开启粗筛模式8至10分钟，随后切换至细筛模式继续筛分8至10分钟。
      注意：筛分时间可能需根据具体批次适当调整。
   4. 依次小心取下各层筛板，倒置于大张称量纸上。轻敲筛板边缘，确保绝大多数微球已从筛网中脱落并落入纸上。
   5. 弃去粒径过大（>106 µm）和过小（<53 µm）的微球。将粒径在53至106 µm范围内的微球收集至已标记类型和批次编号的离心管中，并储存于-20 °C冰箱中，待后续使用。

2. 微球质量控制评估

注意：参见图1。

1. 进行宏观/肉眼评估，检查微球是否均匀且呈球形，无聚集物存在。
2. 使用扫描电子显微镜（SEM）对微球进行评估。
   1. 将微球置于SEM样品台，使用溅射镀膜仪在氩气环境中以金-钯合金溅射镀膜，厚度为4 nm。
   2. 采用10 kV加速电压和10 mm工作距离观察微球的表面特征、形态及直径，以确认微球的制备和筛分过程成功。

3. 3D打印用丝材的制备

1. 称量并记录步骤 2 和 3 所得微球的质量；至少需要 25 g。
2. 将聚己内酯（PCL）粉末加入微球中，使微球与 PCL 的质量比为 1:4。
3. 将粉末混合物置于微型滚筒混合器上，以 20 rpm 转速混合 5 分钟，然后翻转容器，再以 20 rpm 转速继续混合 5 分钟（见图 2）。
4. 许多市售挤出机（见材料表）配有隔热套，因其设计工作温度适用于传统的熔融沉积成型（FDM）线材。如有必要，可通过移除隔热材料对挤出机进行改装，并结合使用台式风扇（向挤出机和挤出线材吹送环境空气），以实现在较低温度下使用该挤出机。
   注：在本操作中，使用向挤出机和线材吹送环境空气的台式风扇有助于冷却。
5. 搭建挤出设备装置。见图 3。
   1. 设置挤出机，使其出口距离收线装置入口约 60 cm，并确保从挤出出口到收线入口之间路径直接通畅。
      注：若发现线材下垂至接触台面，可选择将收线装置抬高 3–4 英寸。
   2. 将一台台式风扇放置在距加热套约 15 cm 处，并朝向加热套吹风，以便在整个线材生产过程中提供环境空气冷却。将第二台风扇置于挤出机与收线装置之间的中点附近，朝向挤出物吹风，以协助线材冷却。
   3. 根据需要在过程中随时调整设备位置。
6. 将改装后的挤出机加热元件设定为 52 °C，开启台式冷却风扇，使仪器平衡 20 至 30 分钟。确保挤出机已安装合适的喷嘴。
7. 开始前，将步骤 3.3 所得的微球/PCL 混合物填入挤出机料斗中。启动收线装置和挤出机螺杆，开始线材挤出。
8. 当初始线材被挤出后，使用镊子手动从挤出出口拉出挤出物，并将其导入线材收线装置。
9. 所需线材需一段时间后才会稳定输出。使用不同的收线轴或胶带，明确标记线材组成在视觉上呈现均匀的起始位置。
10. 密切监控整个过程，并根据需要调整参数。调节挤出机温度、挤出螺杆转速和收线装置转速，使所得线材直径为 1.75 mm（用游标卡尺测量）。根据需要调节风扇，确保线材充分冷却，避免截面非圆形。根据需要混合并补充料斗中的物料。
    注：此过程需密切监控，以获得足够质量的线材用于后续 3D 打印。上述参数会因环境条件、料斗中混合物的填充量和均匀性，以及特定批次 PCL 和微球的热力学与流变学特性而发生变化。
11. 持续挤出直至所有粉末用尽且料斗接近排空。向料斗中加入纯 PCL 粉末（不含微球），以冲洗当前残留在挤出机内的微球混合物。继续向料斗中添加 PCL 粉末，直至挤出物中不再可见微球。
12. 务必对含有目标浓度微球的线材进行标记并单独存放，因为线材冷却后，均匀与非均匀线材更难区分。
13. 继续挤出直至料斗中残留粉末极少，随后关闭收线装置、挤出机螺杆、挤出机加热元件及风扇。

4. 使用纤维进行打印

1. 使用计算机辅助设计软件设计所需形状和结构的几何模型，然后使用与所用3D打印设备兼容的切片软件对模型进行切片并规划打印路径。
2. 将第3步制备的线材装载到配备标准喷嘴（通常直径为0.4 mm）的常规FDM打印机上。启动打印过程，打印设备以逐层沉积的方式开始打印（通常打印温度为65–70 °C，线速度为300 mm/min）。
3. 务必特别关注第一层打印效果，并根据需要调整参数以获得高质量的打印结果。
   注意：可调整打印速度、打印温度、平台温度、挤出倍率及其他参数。如需进一步帮助，请参考打印机和切片软件制造商提供的故障排除指南。

5. 质量控制评估

1. 将打印好的结构置于扫描电镜样品台，使用溅射镀膜仪在氩气环境中溅射镀上一层厚度为4 nm的金-钯涂层。
2. 在显微镜下观察，加速电压设为10 kV，工作距离设为10 mm，以检查表面形貌，并根据需要确认微球是否存在。

6. 打印结构的功能测试

注意：碱性磷酸酶（ALP）可作为脱细胞基质的替代物，用于判断在纤维制备过程后包封的蛋白质是否具有生物学活性。之所以使用ALP，是因为它能够催化底物对硝基苯磷酸盐发生反应，生成黄色产物对硝基苯酚和无机磷酸盐，但此反应仅在ALP处于功能构象时才能发生。

1. 使用与PLA-DM/PCL支架相同的打印参数，采用ALP微球丝材（PLA-ALP/PCL）打印一种具有至少400 mg末端质量的几何结构（n = 3）。同时打印与PLA-ALP/PCL支架相同几何形状的仅PCL材料（PCL(-)）支架。将支架浸入1 mL Tris-HCl缓冲液中，在37 °C、110 rpm振荡条件下孵育24 h，以促进酶的扩散。
2. 加入1 mL浓度为1 mg/mL的对硝基苯磷酸二钠六水合物（p-nitrophenyl phosphate, disodium hexahydrate）Tris-HCl溶液。在37 °C、110 rpm条件下继续孵育10 h。读取上清液在415 nm处的吸光度。

结果

过筛后，微球应呈现均匀状态且无聚集体。在扫描电镜（SEM）下，过筛后的微球表面可能具有微小孔隙，但整体应呈球形且表面光滑，如图1所示。所有挤出的丝材应具有均匀的直径和圆形的横截面。含有微球的丝材（PLA-DM/PCL）表面略显哑光，而仅含PCL的丝材（PCL(-)）则更为光亮。PLA-DM/PCL丝材触感也比PCL(-)丝材更粗糙。支架应按照第4.1步软件设定的所需几何形状进行打印。支架的质量和形状应在不同打印件之间具有可重复性和一致性。打印完成后，含微球与不含微球的支架在宏观上难以区分，但在扫描电镜下，微球应在支架表面及内部结构中清晰可见。在扫描电镜下，PCL(-)丝材表面光滑，可见因挤出工艺产生的条纹状伪影（图4B）。微球应可在PLA-DM/PCL支架的表面及表面下明显观察到（见图4C）。当使用ALP作为DM的替代物时，支架...

讨论

脱细胞基质和3D打印的PCL支架均已被单独证实可支持细胞的黏附与增殖，证实了其在骨软骨修复中的应用价值^10,11,12脱细胞基质在组织修复工程策略中的应用在近年来备受关注并取得了诸多成功^2,3,14,15与传统技术相比，我们此前已注意到细胞迁移、黏附、增殖以及所形成组织整体维持能力的增强^2,15,16,17,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
筛分机	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
90 µm 筛网	Fisherbrand	170328156	No. 170
53 µm 筛网	Fisherbrand	162513588	No. 270
106 µm 筛网	Fisherbrand	162018121	No. 140
溅射镀膜仪	Leica	n/a
扫描电子显微镜	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot 卷线器	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010023
6" 风扇	Comfort Zone, Amazon	n/a
超声波水浴器	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
滚筒混合器	定制	n/a	类似设备：https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
微量天平	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
微球	实验室自制，详见同期提交的 JoVE 论文
对硝基苯磷酸二钠盐六水合物	Millipore	4876-5GM
碱性磷酸酶	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
吸光度读数仪	Tecan	Sunrise
Tris-HCl 缓冲液	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
加热振荡器	New Brunswick Scientific	Excella E24