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低氧环境下人巨噬细胞极化的蛋白质组学分析

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DOI：

10.3791/58727

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2019年1月7日

 ,  , 
1Team Mechanobiology, Immunity and Cancer, Institute for Advanced Biosciences, INSERM U1209, CNRS UMR5309, 2Université Grenoble Alpes, 3Pôle Recherche, Centre Hospitalier Universitaire des Alpes

本文内容

摘要

我们提出了一种获取人类巨噬细胞蛋白质组特征的方案，并将其应用于研究低氧环境对巨噬细胞极化的影响。

摘要

巨噬细胞是天然免疫细胞，参与多种生理功能，从应对感染性病原体到维持组织稳态。这些细胞的多种功能与其活化状态相关，这种状态也称为极化。对这些不同极化状态进行精确的分子描述，是巨噬细胞生物学领域的重要研究目标。目前公认，需要采用多维度的方法来描述环境信号如何调控极化过程。在本报告中，我们描述了一种用于获取人巨噬细胞不同极化状态蛋白质组特征的实验方案。该方案基于对细胞裂解物经凝胶分离及Lys C/胰蛋白酶消化后获得的蛋白质表达进行无标记定量分析。此外，我们还提供了一种基于溶液内消化和等电聚焦分离的替代方案。由于氧浓度是组织中一个重要的环境参数，我们利用该方案探讨了大气成分或低氧环境如何影响巨噬细胞极化的分类。

引言

巨噬细胞是天然免疫细胞，参与多种生理功能，包括对感染性病原体的反应以及组织稳态的维持，后者涵盖清除凋亡细胞和细胞外基质的重塑1。这类细胞具有显著的表型可塑性2，表现为多种可能的活化状态，这些状态也被称为极化状态。对这些不同极化状态进行精确的分子描述，是巨噬细胞生物学领域的重要研究目标3。有研究提出采用所谓的M1/M2二分法对巨噬细胞极化进行分类，其中M1代表促炎型巨噬细胞，M2代表抗炎型巨噬细胞。该模型在多种病理情况下（如急性感染、过敏和肥胖）具有良好的适用性4。然而，在慢性炎症组织和肿瘤中，已有研究表明该分类方法无法充分涵盖巨噬细胞在特定细胞环境中所呈现的广泛表型谱系5,6,7。目前的共识认为，应采用多维模型来描述巨噬细胞极化，以整合特定微环境中的信号刺激8。这一结论已通过人类巨噬细胞的转录组学分析得到验证，结果显示M1/M2模型在描述实际获得的极化状态方面效率低下9。

本研究旨在提供一种用于获取人类巨噬细胞不同极化状态蛋白质组特征的实验方案。我们描述了如何在不同氧浓度环境下诱导人类巨噬细胞分化，并从整个巨噬细胞蛋白质组中提取肽段以进行无标记定量分析。该定量方法可用于比较多种蛋白质的表达水平。随着干细胞研究揭示了氧作为关键环境参数的重要性10，我们希望进一步了解这一组织微环境参数如何影响人类巨噬细胞的极化过程。人体内的氧分压范围为3%至20%（占总大气压的百分比），其中20%大致相当于细胞培养孵育箱中常用的氧浓度（考虑水蒸气存在时，实际值约为18.6%）。

既往研究表明，肺泡巨噬细胞与间质巨噬细胞在功能和形态上存在差异11，这些差异可能部分归因于它们所暴露的氧浓度不同12。此外，骨髓来源的巨噬细胞在低氧环境中表现出更强的吞噬细菌能力12。然而，在THP1分化的人源巨噬细胞中观察到了相反的效果13，但这些结果共同支持了氧气是巨噬细胞生物学行为调控因子的观点，提示有必要在分子水平上进一步阐明其在人巨噬细胞中的作用。在之前的一项研究中，我们采用蛋白质组学方法来探讨这些问题。通过同时检测数千种蛋白质的表达水平，我们揭示了氧气对巨噬细胞极化的影响，并提供了一系列新的分子标志物。我们还能够将这些发现与某些巨噬细胞功能相关联。值得注意的是，我们发现经IL4/IL13极化的巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬速率增加，这一现象与蛋白质组学分析所揭示的ALOX15表达上调相关14。在本研究中，我们描述了如何开展此类分析。

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方案

健康匿名捐赠者的血液样本（LRSC）来自法国国家血液服务中心（EFS），属于经批准的协议项目（CODECOH DC-2018–3114）。捐赠者已签署同意书，允许使用其血液样本。

1. 培养基与缓冲液的配制

  1. 配制巨噬细胞培养基 [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1× 非必需氨基酸 (NEAA)]，并将其预热至 37 °C。
  2. 配制含 10% AB 型血浆人血清 (SAB) 的巨噬细胞培养基，经 0.22 µm 滤器过滤后，预热至 37 °C（以下简称为巨噬细胞培养基 + 10% SAB）。
  3. 配制分选缓冲液 [1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) + 2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)]，经 0.22 µm 滤器过滤，并保持在 4 °C。

2. 从白细胞减少系统储液袋（LRSC）中分离外周血单个核细胞（PBMCs）

  1. 取15 mL密度梯度细胞分离液（见材料表）加入50 mL离心管中，使其升至室温（RT），以便后续加入LRSC。
    注意：密度受温度影响。由于该产品储存于4 °C，此步骤需提前进行，使其充分平衡至室温。
  2. 将LRSC转移至50 mL离心管中，加入最多50 mL的1×PBS并混匀。缓慢地将步骤2.2中制备的混合液25 mL叠加至步骤2.1中已升温的15 mL密度梯度溶液上方。
    注意：此步骤中需避免各相混合。血液必须在不扰动密度梯度溶液相的前提下，小心地加在其上方。
  3. 将两个离心管在700 × g条件下离心25分钟，期间不刹车。
    注意：密度梯度离心结束后，从底部到顶部的分层依次为：形成沉淀的红细胞和粒细胞、密度梯度溶液相、外周血单个核细胞（PBMC）层以及血浆层。
  4. 用移液器穿过血浆层而不吸取血浆，收集PBMC层至新的50 mL离心管中。向PBMC中加入最多50 mL的1×PBS进行洗涤，随后在300 × g条件下离心10分钟。
  5. 吸除上清液，并将沉淀重悬于40 mL巨噬细胞培养基中。

3. CD14+ 细胞（单核细胞）的磁标记与分离

  1. 在马氏计数板中计数外周血单个核细胞（PBMCs）。吸取实验所需数量的PBMCs（通常为100至300 × 106 个细胞），置于离心管中，在300 × g条件下离心10分钟。
  2. 吸除上清液，按每107 个PBMCs加入80 µL步骤1.3中配制的分选缓冲液重悬细胞沉淀。按每107 个PBMCs加入20 µL CD14磁珠。充分混匀后，在4 °C下持续振荡孵育15分钟。
  3. 按每107 个PBMCs加入1 mL分选缓冲液进行洗涤，300 × g离心10分钟。吸除上清液，按每108 个PBMCs用500 µL分选缓冲液重悬细胞沉淀。
  4. 将分选柱置于分离器的磁场中。用3 mL分选缓冲液冲洗分选柱以进行预处理。
  5. 将细胞悬液加至分选柱上。分选柱的选择取决于待分离细胞的数量（此处使用LS柱，适用于最多109 个PBMCs）。收集流穿液，其中含有未标记的细胞。
    注意：从本步骤开始，所有试管（阴性与阳性分选）均需保留，以便后续通过流式细胞术检测各步骤结果。
  6. 用3 × 3 mL分选缓冲液洗涤分选柱。将洗涤液与步骤3.12中的同一试管合并收集未标记细胞。添加分选缓冲液进行洗涤时，注意避免柱子干燥。在分选柱下方放置收集管，随后将其从分离器上取下。
  7. 用移液器向分选柱中加入5 mL分选缓冲液。立即用力推动柱塞，将磁性标记的细胞快速洗脱下来。为提高CD14+ 细胞的纯度，可将洗脱组分通过第二个分选柱进一步富集。
  8. 使用新的分选柱重复步骤3.4至3.7。

4. 单核细胞铺板

  1. 在Malassez计数板中计数单核细胞。通过流式细胞术检测CD14+细胞的纯度。取实验所需数量的单核细胞，置于离心管中。
  2. 以300 × g离心10分钟。吸除上清液，将单核细胞沉淀重悬于巨噬细胞培养基中。接种细胞，静置贴壁50分钟至1小时。吸除培养基，更换为含10% SAB和25 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的巨噬细胞培养基，以诱导细胞分化。

5. 第6天巨噬细胞的极化

  1. 吸弃培养基，加入含 10% SAB 的巨噬细胞培养基，并添加不同的刺激物。例如，加入 10 ng/mL 干扰素 γ (INFγ) 和 1 ng/mL 脂多糖 (LPS) 以诱导 M1 极化，或加入 20 ng/mL 白细胞介素 4 (IL4) 和 20 ng/mL 白细胞介素 13 (IL13) 以诱导 M2 极化。
    注意：刺激处理可在进行其他检测前 24 至 48 小时内进行。
  2. 使用细胞脱离溶液或细胞刮刀收集细胞。

6. 低氧条件下的细胞培养

  1. 从第4步开始，在受控氧环境中培养单核细胞，随后培养巨噬细胞，以进行低氧条件分析。实验期间使用低氧工作站，以维持细胞处于所需的氧分压条件下。
    注意：在低氧压力下操作时，重要的是在工作站内配制所有培养基和洗涤缓冲液，并留出足够时间使液体达到目标氧分压。例如，60 mm培养皿中的10 mL PBS从大气氧浓度开始，约需2小时才能达到25 mmHg的O2分压（该数据由光纤氧传感器测得）。在许多低氧工作站或培养箱中，氧压力以大气压的百分比设定。若需精确控制，建议使用可直接以mmHg为单位设定氧分压的工作站。

7. 裂解与胶内消化（方案1）

注意：在本节及后续章节中，将介绍两种用于获取肽段并进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的实验方案。方案1描述了细胞裂解及凝胶内分级分离与消化；方案2描述了溶液内细胞裂解，随后采用等电聚焦方法进行溶液内消化与分级分离。

  1. 在Laemmli缓冲液[234 mM Tris-HCl (pH 6.8)、7.5% SDS、37%甘油、33.3% (v/v) β-巯基乙醇、0.2% (w/v) 溴酚蓝]中进行细胞裂解。将每份样品相当于300,000个细胞的蛋白量上样至4–12% bis-Tris丙烯酰胺凝胶中。
  2. 控制电泳迁移时间，使每种蛋白样品分离为6个凝胶条带，如图3所示。
  3. 用固定液（30%乙醇 + 7.5%乙酸，20分钟）固定凝胶，然后加入染色液（R-250考马斯亮蓝，45分钟）。加入脱色液（30%乙醇 + 7.5%乙酸，直至条带显现）后，用洁净的手术刀切下蛋白条带。
  4. 将每条切下的条带在500 µL离心管中切碎。应使用洁净的玻璃表面以避免角蛋白污染（可用去离子水中含5% SDS的溶液清洁表面）。
  5. 将凝胶切片在200 µL 25 mM碳酸氢铵溶液中洗涤3次，每次20分钟，37 °C；随后用25 mM碳酸氢铵与乙腈（50% v/v）混合液洗涤一次。再加入200 µL 100%乙腈，脱水10分钟。
  6. 将每块凝胶切片与200 µL含10 mM DTT（二硫苏糖醇）的25 mM碳酸氢铵溶液在56 °C孵育45分钟，随后在室温避光条件下，与200 µL含55 mM碘乙酰胺的25 mM碳酸氢铵溶液孵育35分钟。
  7. 为终止烷基化反应，将每块凝胶切片与200 µL含10 mM DTT的25 mM碳酸氢铵溶液在室温孵育10分钟。用200 µL 25 mM碳酸氢铵溶液洗涤凝胶切片，再用200 µL 100%乙腈脱水10分钟。
  8. 根据制造商说明书，使用胰蛋白酶/赖氨酰内切酶（Trypsin/Lys-C）混合液在37 °C过夜消化蛋白。
  9. 通过加入50 μL 50%乙腈振荡15分钟，然后加入50 μL 5%甲酸振荡15分钟，最后加入50 μL 100%乙腈振荡15分钟，从凝胶切片中提取肽段。将各次提取液合并，并在低吸附性离心管中干燥，以减少肽段吸附和样品损失。将样品储存于-80 °C，待后续分析。

8. 蛋白质提取与溶液内消化（方案2）

  1. 使用以下裂解缓冲液对 2 × 106 个细胞进行细胞裂解，缓冲液体积为 150 µL：
    1. 7 M 尿素，2 M 硫脲，40 mM Tris，4% CHAPS，并添加蛋白酶抑制剂（complete mini，无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物）。
  2. 在室温下使用恒温振荡器均质化溶液 30 分钟。在室温下以 13,800 × g 离心 20 分钟，保留上清液。
  3. 使用二维清洁试剂盒去除杂质：
    1. 该试剂盒包含沉淀液、共沉淀液、洗涤缓冲液和洗涤添加剂。
    2. 加入 300 µL 沉淀液并充分混匀。冰上孵育 15 分钟。加入 300 µL 共沉淀液。将离心管以至少 12,000 × g 离心 5 分钟。应可见少量沉淀。迅速进行下一步操作，以避免沉淀重新悬浮或扩散。去除上清液时勿扰动沉淀。
    3. 再次离心，将离心管的铰链盖和沉淀朝外放置，使残留液体聚集至管底。短暂离心即可。管内应无可见液体残留。
    4. 勿扰动沉淀，加入 40 µL 共沉淀液。将离心管置于冰上静置 5 分钟。离心 5 分钟后，去除并弃去洗涤液。加入 25 µL 去离子水。每管涡旋振荡 5–10 秒。沉淀应在水中分散但不完全溶解。
    5. 加入 1 mL 预冷（在 -20°C 下至少预冷 1 小时）的洗涤缓冲液和 5 µL 洗涤添加剂。涡旋振荡至沉淀完全分散。在 -20°C 下孵育至少 30 分钟。每隔 10 分钟涡旋振荡 20–30 秒。
      注意：离心管可在 -20°C 下保存最多 1 周，蛋白质降解或修饰程度极低。
    6. 将离心管以至少 12,000 × g 离心 5 分钟。小心去除并弃去上清液。应可见白色沉淀。让沉淀在空气中干燥不超过 5 分钟（若沉淀过于干燥，则难以重新悬浮）。
  4. 将蛋白沉淀重悬于 300 µL 的 8 M 尿素和 0.1 M 碳酸氢铵溶液中。强力涡旋振荡 1 分钟。使用比色法测定蛋白浓度。

9. 溶液内消化（方案2）

  1. 向第8.4步重悬的蛋白质中加入5.1 µL 700 mM DTT水溶液（终浓度为12.5 mM），在37 °C下使用恒温振荡仪孵育30分钟，以还原二硫键。随后加入20.3 µL 700 mM碘乙酰胺水溶液（终浓度为40 mM），在25°C避光条件下使用恒温振荡仪孵育30分钟，以烷基化半胱氨酸残基。
  2. 向样品中加入990 µL 0.1 M碳酸氢铵溶液。加入相应体积的胰蛋白酶/赖氨酸酶混合液（酶与底物质量比为1:100）。在37°C下使用恒温振荡仪过夜孵育。

10. 净化柱（方案 2）

  1. 用1个柱体积（1 mL）的甲醇润湿小柱。用1个柱体积（1 mL）的80%乙腈/高效液相色谱级水清洗小柱，并弃去穿流液。用4个柱体积（4 mL）的0.1%甲酸/高效液相色谱级水平衡小柱，并弃去穿流液。
  2. 用90 µL的10%甲酸或水将样品酸化至pH 2–3（使用pH指示剂检测pH值）。上样酸化后的样品并收集穿流液。将穿流液（含有未保留的肽段）重新上样。用6个柱体积（6 mL）的0.1%甲酸/高效液相色谱级水洗涤小柱。
  3. 用1个柱体积（1 mL）的0.1%甲酸/50%乙腈/高效液相色谱级水从小柱洗脱肽段。转移至1.5 mL微量离心管中。使用真空浓缩仪浓缩样品（150 × g，160 mBar真空度）。

11. 等电聚焦分级分离（方案 2）

注意：使用13 cm胶条在pH 3至10范围内，通过等电聚焦分离仪根据肽段的等电点进行分离。我们采用供应商提供的以下方案（如下简述）：

  1. 配制以下溶液：溶液A（600 µL 甘油溶液、60 µL OFFGEL缓冲液、4.34 mL超纯水）和溶液B（1.776 mL溶液A和444 µL超纯水）。
  2. 根据制造商说明书组装IPG胶条、框架和电极。
  3. 用1.8 mL溶液B重悬样品。向每个加样孔中加入40 µL溶液B，然后向每个孔中加入150 µL样品。
  4. 选择肽段的默认方法：OG12PE00（用于3100 OFFGEL低分辨率试剂盒、pH 3-10、12孔框架的OFFGEL肽段默认方法）。等待该方法运行完成（约20小时）。将各组分收集至正确标记的离心管中。

12. 清洁 Harvard Apparatus C18反相柱（等电聚焦后，方案2）

  1. 每次逐滴加入几微升（μL）含1%三氟乙酸（TFA）的去离子水至各组分中，以酸化样品。使用pH试纸检测，确保pH值约为3或更低。
  2. 配制以下溶液：溶液1（5 mL乙腈、10 µL甲酸、4.99 mL超纯水）和溶液2（0.5 mL乙腈、10 µL甲酸、9.49 mL超纯水）。
  3. 用150 µL溶液1预润湿离心柱。在750 × g条件下离心90秒，弃去穿流液。再用150 μL溶液2洗涤离心柱，在750 × g条件下离心90秒，弃去穿流液。
  4. 将组分溶液通过离心柱。在750 × g条件下离心90秒，弃去穿流液。用150 μL溶液2洗涤，在750 × g条件下离心90秒，弃去穿流液。
  5. 用50 μL溶液1洗脱组分，在750 × g条件下离心90秒。重复此步骤一次。
  6. 使用真空浓缩仪（150 × g，真空度160 mBar）干燥组分，并于-80°C保存。

13. 蛋白质组学数据分析与生物信息学18

  1. 使用定量分析软件（如 MaxQuant，版本 1.5.2.8）和 Andromeda 搜索引擎分析纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC MS/MS）质谱仪获得的数据。
  2. 将蛋白质和肽段的错误发现率（FDR）均设为 1%，最小肽段长度设为 7 个氨基酸。酶切特异性设为精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）的 C 末端。允许在脯氨酸键处发生最多 2 次漏切。选择半胱氨酸的羧甲基化作为固定修饰，蛋白质 N 末端乙酰化和甲硫氨酸氧化作为可变修饰。
  3. 使用统计分析软件进一步分析数据。利用 FunRich 软件（www.funrich.org/）进行功能富集分析。利用 DAVID 软件（https://david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（gene ontology）富集分析。

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结果

从通过差速离心法获得的外周血单个核细胞（PBMCs）开始，本方案可获得纯度经流式细胞术评估超过98%的CD14+单核细胞群体（图1）。这些单核细胞可进一步向不同极化方向分化（图2）。当选择凝胶分离时，SDS-PAGE凝胶上的迁移条件经过优化以获得所需数量的条带，并对目标条带进行切取（图3）。随后在切下的凝胶条带中进行酶解消化，然后提取肽段。肽段通过纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）进行分析。根据已知肽段所产生的谱图注释，MS/MS谱可鉴定出多种蛋白质（图4A）。通过已发表的软件和数据库15,16，结合来源于特定蛋白质的已鉴定肽段数量，可进一步计算蛋白质的丰度定量。采用凝胶内酶解的本...

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讨论

由于蛋白质组学是研究整个细胞或亚细胞区室中不同蛋白质表达的有力工具，已有许多研究针对细胞裂解方案的优化以及蛋白质的消化过程进行了探讨。目前主要有三类方法，包括凝胶内消化（在聚丙烯酰胺凝胶基质中消化蛋白质）17、溶液中消化18和滤膜辅助样品制备19。最后一种方法最初被称为通用方法，但据报道其重复性较低，且可能存在蛋白质在滤膜上丢失的问题20。凝胶内消化是一种稳健的方法，但耗时较长，且难以评估消化效率，甚至可能无法评估。溶液中消化提供了这种评估的可能性，但需要在消化和等电聚焦（IEF）后对样品进行纯化。当对同一样品比较这两种方法时，采用等电聚焦分级策略的溶液中消化比凝胶内消化能鉴定出更多的蛋白质（在相同数量的分级条件下）21。

尽管具有上述优势，仍需考虑在溶液裂解过程中由于细胞内蛋白酶（尤其是在髓系细胞中）可能导致的蛋白质降解问题。此外，必须注意的是...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

AM 由青年课题组长计划（ATIP/Avenir Inserm-CNRS）、法国国家抗癌联盟（la Ligue Nationale contre le Cancer）以及癌症研究ARC基金会（la Fondation ARC pour la recherche sur le Cancer）资助。我们感谢巴黎巴斯德研究所质量分析生物学平台（UTECHS MSBIO, Pasteur Institute, Paris）的 Mariette Matondo。我们感谢 Lauren Anderson 对手稿的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
缺氧工作站Oxford OptronixHypoxylab
C6 流式细胞仪BDAccuri C6
尿素Agilent Technologies5188-6435
甲酸（FA）ARISTAR450122M
R-250 考马斯亮蓝Biorad1,610,436
大肠杆菌脂多糖（LPS）Calbiochem437627
2D 样品纯化试剂盒GE Healthcare80-6484-51
RPMI 1640 培养基，含谷氨酰胺补充剂Gibco61870044
HEPES 1 MGibco15630-080
MEM 非必需氨基酸（NEAA）溶液 100XGibco11140-035
磷酸盐缓冲液（PBS）1XGibco14190-094
Harvard Apparatus 反相 C18 微型离心柱Harvard Apparatus74-4601
EDTA 0.5 M，pH 8.0InvitrogenAM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12%Life Technologies SASNP0321 BOX
人 CD14 磁珠Miltenyi Biotec130-050-201
MACS LS 分离柱Miltenyi Biotec130-042-401
巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）Miltenyi Biotec130-096-485
白细胞介素 4（IL4）Miltenyi Biotec130-093-917
白细胞介素 13（IL13）Miltenyi Biotec130-112-410
干扰素 γ（INFγ）Miltenyi Biotec130-096-482
CD14-FITC（克隆 TÜK4）Miltenyi Biotec130-080-701
MACSmix 试管旋转混合仪Miltenyi Biotec130-090-753
三氟乙酸（TFA）Pierce28904
胰蛋白酶/赖氨酰内切酶混合物PROMEGAV5073
完全迷你型无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物Roche11836170001
密度梯度溶液（Histopaque 1077）Sigma Aldrich10771-100ML
Accumax 细胞解离试剂Sigma AldrichA7089-100ML
人男性 AB 型血浆来源人血清（SAB）Sigma AldrichH4522-100ML
30% 牛血清白蛋白（BSA）溶液Sigma AldrichA9576-50ML
Trisma-碱Sigma AldrichT1503
甘油Sigma Aldrich49767
β-巯基乙醇Sigma AldrichM3148
溴酚蓝Sigma Aldrich114405
十二烷基硫酸钠（SDS）20%Sigma Aldrich5030
碳酸氢铵Sigma Aldrich9830
乙腈Sigma Aldrich34888
二硫苏糖醇Sigma Aldrich43819
碘乙酰胺Sigma Aldrich57670
硫脲Sigma AldrichT8656
CHAPSSigma AldrichC9426
Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒ThermoFisher23235
5 mL 无菌塑料移液管VWR612-1685
Eppendorf Thermomixer C 恒温混匀仪VWR460-0223
Sep-Pak tC18 反相萃取柱，100 mgWatersWAT036820

参考文献

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