低氧环境下人巨噬细胞极化的蛋白质组学分析

摘要

我们提出了一种获取人类巨噬细胞蛋白质组特征的方案，并将其应用于研究低氧环境对巨噬细胞极化的影响。

摘要

巨噬细胞是天然免疫细胞，参与多种生理功能，从应对感染性病原体到维持组织稳态。这些细胞的多种功能与其活化状态相关，这种状态也称为极化。对这些不同极化状态进行精确的分子描述，是巨噬细胞生物学领域的重要研究目标。目前公认，需要采用多维度的方法来描述环境信号如何调控极化过程。在本报告中，我们描述了一种用于获取人巨噬细胞不同极化状态蛋白质组特征的实验方案。该方案基于对细胞裂解物经凝胶分离及Lys C/胰蛋白酶消化后获得的蛋白质表达进行无标记定量分析。此外，我们还提供了一种基于溶液内消化和等电聚焦分离的替代方案。由于氧浓度是组织中一个重要的环境参数，我们利用该方案探讨了大气成分或低氧环境如何影响巨噬细胞极化的分类。

引言

巨噬细胞是天然免疫细胞，参与多种生理功能，包括对感染性病原体的反应以及组织稳态的维持，后者涵盖清除凋亡细胞和细胞外基质的重塑¹。这类细胞具有显著的表型可塑性²，表现为多种可能的活化状态，这些状态也被称为极化状态。对这些不同极化状态进行精确的分子描述，是巨噬细胞生物学领域的重要研究目标³。有研究提出采用所谓的M1/M2二分法对巨噬细胞极化进行分类，其中M1代表促炎型巨噬细胞，M2代表抗炎型巨噬细胞。该模型在多种病理情况下（如急性感染、过敏和肥胖）具有良好的适用性⁴。然而，在慢性炎症组织和肿瘤中，已有研究表明该分类方法无法充分涵盖巨噬细胞在特定细胞环境中所呈现的广泛表型谱系^5,6,7。目前的共识认为，应采用多维模型来描述巨噬细胞极化，以整合特定微环境中的信号刺激⁸。这一结论已通过人类巨噬细胞的转录组学分析得到验证，结果显示M1/M2模型在描述实际获得的极化状态方面效率低下⁹。

本研究旨在提供一种用于获取人类巨噬细....

方案

健康匿名捐赠者的血液样本（LRSC）来自法国国家血液服务中心（EFS），属于经批准的协议项目（CODECOH DC-2018–3114）。捐赠者已签署同意书，允许使用其血液样本。

1. 培养基与缓冲液的配制

1. 配制巨噬细胞培养基 [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1× 非必需氨基酸 (NEAA)]，并将其预热至 37 °C。
2. 配制含 10% AB 型血浆人血清 (SAB) 的巨噬细胞培养基，经 0.22 µm 滤器过滤后，预热至 37 °C（以下简称为巨噬细胞培养基 + 10% SAB）。
3. 配制分选缓冲液 [1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) + 2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)]，经 0.22 µm 滤器过滤，并保持在 4 °C。

2. 从白细胞减少系统储液袋（LRSC）中分离外周血单个核细胞（PBMCs）

1. 取15 mL密度梯度细胞分离液（见材料表）加入50 mL离心管中，使其升至室温（RT），以便后续加入LRSC。
   注意：密度受温度影响。由于该产品储存于4 °C，此步骤需提前进行，使其充分平衡至室温。
2. 将LRSC转移至50 mL离心管中，加入最多50 mL的1×PBS并混匀。缓慢地将步....

结果

从通过差速离心法获得的外周血单个核细胞（PBMCs）开始，本方案可获得经流式细胞术评估纯度超过98%的CD14⁺单核细胞群体（图1）。这些单核细胞可进一步向不同极化方向分化（图2）。当选择凝胶分离时，SDS-PAGE凝胶上的迁移条件经过调整，以获得所需数量的条带，并对目标条带进行切取（图3）。随后在切取的凝胶条带中进行酶解消化，然后提取肽段。肽段通过纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）进行分析。根据已知肽段所获得谱图的注释，MS/MS谱可鉴定出多种蛋白质（图4A）。通过已发表的软件和数据库^15,16，结合来源于特定蛋白质的已鉴定肽段数量，可进一步计算该蛋白质的丰度。采用凝胶内酶解的本.......

讨论

由于蛋白质组学是研究整个细胞或亚细胞区室中不同蛋白质表达的有力工具，已有许多研究针对细胞裂解方案的优化以及蛋白质的消化过程进行了探讨。目前主要有三类方法，包括凝胶内消化（在聚丙烯酰胺凝胶基质中消化蛋白质）¹⁷、溶液中消化¹⁸和滤膜辅助样品制备¹⁹。最后一种方法最初被称为通用方法，但据报道其重复性较低，且可能存在蛋白质在滤膜上丢失的问题²⁰。凝胶内消化是一种稳健的方法，但耗时较长，且难以评估消化效率，甚至可能无法评估。溶液中消化提供了这种评估的可能性，但需要在消化和等电聚焦（IEF）后对样品进行纯化。当对同一样品比较这两种方法时，采用等电聚焦分级策略的溶液中消化比凝胶内消化能鉴定出更多的蛋白质（在相同数量的分级条件下）²¹。

尽管具有上述优势，仍需考虑在溶液裂解过程中由于细胞内蛋白酶（尤其是在髓系细胞中）可能导致的蛋白质降解问题。此外，必须注意的是.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
缺氧工作站	Oxford Optronix	Hypoxylab
C6 流式细胞仪	BD	Accuri C6
尿素	Agilent Technologies	5188-6435
甲酸（FA）	ARISTAR	450122M
R-250 考马斯亮蓝	Biorad	1,610,436
大肠杆菌脂多糖（LPS）	Calbiochem	437627
2D 样品纯化试剂盒	GE Healthcare	80-6484-51
RPMI 1640 培养基，含谷氨酰胺补充剂	Gibco	61870044
HEPES 1 M	Gibco	15630-080
MEM 非必需氨基酸（NEAA）溶液 100X	Gibco	11140-035
磷酸盐缓冲液（PBS）1X	Gibco	14190-094
Harvard Apparatus 反相 C18 微型离心柱	Harvard Apparatus	74-4601
EDTA 0.5 M，pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12%	Life Technologies SAS	NP0321 BOX
人 CD14 磁珠	Miltenyi Biotec	130-050-201
MACS LS 分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）	Miltenyi Biotec	130-096-485
白细胞介素 4（IL4）	Miltenyi Biotec	130-093-917
白细胞介素 13（IL13）	Miltenyi Biotec	130-112-410
干扰素 γ（INFγ）	Miltenyi Biotec	130-096-482
CD14-FITC（克隆 TÜK4）	Miltenyi Biotec	130-080-701
MACSmix 试管旋转混合仪	Miltenyi Biotec	130-090-753
三氟乙酸（TFA）	Pierce	28904
胰蛋白酶/赖氨酰内切酶混合物	PROMEGA	V5073
完全迷你型无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836170001
密度梯度溶液（Histopaque 1077）	Sigma Aldrich	10771-100ML
Accumax 细胞解离试剂	Sigma Aldrich	A7089-100ML
人男性 AB 型血浆来源人血清（SAB）	Sigma Aldrich	H4522-100ML
30% 牛血清白蛋白（BSA）溶液	Sigma Aldrich	A9576-50ML
Trisma-碱	Sigma Aldrich	T1503
甘油	Sigma Aldrich	49767
β-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M3148
溴酚蓝	Sigma Aldrich	114405
十二烷基硫酸钠（SDS）20%	Sigma Aldrich	5030
碳酸氢铵	Sigma Aldrich	9830
乙腈	Sigma Aldrich	34888
二硫苏糖醇	Sigma Aldrich	43819
碘乙酰胺	Sigma Aldrich	57670
硫脲	Sigma Aldrich	T8656
CHAPS	Sigma Aldrich	C9426
Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒	ThermoFisher	23235
5 mL 无菌塑料移液管	VWR	612-1685
Eppendorf Thermomixer C 恒温混匀仪	VWR	460-0223
Sep-Pak tC18 反相萃取柱，100 mg	Waters	WAT036820