我们此前曾使用金纳米颗粒-多肽杂合物通过静脉递送一种合成多肽——蛋白激酶C-δ抑制剂，该方法减轻了缺血-再灌注所致的急性肺损伤。本文展示了该药物制剂的详细方案。其他细胞内多肽也可采用类似方法进行制剂开发。
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摘要
摘要
蛋白激酶C-δ抑制剂（PKCδi）是一种有前景的药物，可用于预防缺血-再灌注引起的器官损伤。该药物通常与细胞穿透肽TAT偶联，以实现细胞内递送。然而，TAT已被发现具有非特异性的生物学活性。金纳米颗粒（GNPs）可作为药物递送载体，且无已知毒性。因此，我们采用了一种GNP/肽杂合体系来递送PKCδi。两种短肽（P2：CAAAAE和P4：CAAAAW）以95:5的比例用于修饰GNP的表面性质。与PKCδi偶联的GNPs（GNP/PKCi）在蒸馏水、0.9% NaCl以及含牛血清白蛋白或胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS）中均保持稳定。先前研究表明，静脉注射GNP-PKCi可预防肺部缺血-再灌注损伤。本文概述了制备GNP/PKCi的方案及其理化性质的表征方法。我们已使用类似方法将其他基于肽的药物与GNP进行制剂化。本文有望引起更多关注，推动这一新型细胞内药物递送技术及其在体应用的发展。
引言
肺移植可挽救终末期肺病患者的生命1。然而，肺移植后严重的并发症仍然是一个障碍。在肺移植后的早期阶段，原发性移植物功能障碍是最严重的并发症1，其主要原因是缺血-再灌注（IR）引起的急性肺损伤2。
在低温保存期间，供体肺的代谢活动被限制在极低水平。然而，由于血流停止，活性氧和一氧化氮的合成被激活3。移植后，血液灌注恢复，冷缺血期间产生的活性氧和一氧化氮会加剧炎症反应和细胞死亡，导致组织损伤。
为预防缺血再灌注损伤（IR损伤），蛋白激酶Cδ抑制剂（PKCδi）已被应用于心脏、大脑和肺组织4,5,6,7,8。这些研究表明，PKCδi可在再灌注期间减轻炎症反应和细胞凋亡。此外，PKCδi还可在大鼠模型及肺移植模型中预防肺部IR损伤6。PKCδi通常与一种细胞穿透肽TAT偶联....
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方案
1. 肽溶液的制备
- 从 -20 °C 冰箱中取出肽段（P2：CAAAAE，P4：CAAAAW，PKCδi：CSFNSYELGSL），在室温（RT）下解冻。
注意：保持瓶盖关闭，防止水分在肽段上冷凝。 - 使用微量天平称取每种肽段各 0.01 g，分别放入不同的 50 mL 锥形管中。
- 向 P2 管中加入 18.74 mL 去离子水（DI 水）。
- 向 P4 管中加入 16.93 mL 去离子水（DI 水）。
- 向 PKCδi 管中加入 8.21 mL 用去离子水稀释的 50% 乙腈。
- 短暂涡旋混合肽段溶液，将 50 mL 锥形管置于超声仪（40 MHz）中处理 5 分钟。
- 将肽段溶液转移至生物安全柜中。所配制的肽段溶液浓度均应为 1 mM。
- 将每种肽段溶液各 1 mL 转移至新的 50 mL 锥形管中；向 P2 和 P4 管中各加入 19 mL 去离子水，向 PKCδi 管中加入 19 mL 50% 乙腈，使各溶液稀释至 50 µM，并分别储存于各自的管中。
2. GNP/PKCi 的配制
- 应在生物安全柜内将多肽加入GNP溶液中
- 向一个15 mL离心管中加入475 μL的P2、25 μL的P4和500 μL的δPKCi溶液。再向同一离心管中加入9 mL....
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结果
应仔细评估 GNP/PKCi 杂交体的生物物理特性，因为 GNP 在溶剂中容易发生聚集。当 GNP 聚集时，溶液颜色会从粉红色变为紫色（图 1a）。紫外-可见分光光度计能够更灵敏地检测到这种变化。若 GNP/PKCi 未发生聚集，则吸收峰应位于 525 nm 处（图 1b）。若 GNP 发生聚集，吸收峰将向长波方向移动。作为另一种分析方法，当形成聚集体时，Δ光密度（ΔOD = 525 nm 处的 OD 减去 440 nm 处的 OD）会降低。
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讨论
为确保正确的配制，δPKCi 溶液必须经过步骤 1.6 中所述的超声处理。δPKCi 肽序列含有疏水性部分，因此使用超声仪有助于将 PKCi 溶解于 50% 乙腈溶液中。此外，必须严格按照步骤 2.7 所述仔细混合溶剂。 如果未正确执行这些步骤，δPKCi 肽可能发生聚集，导致 GNP/PKCi 杂化物配制不良23。
基于金纳米颗粒（GNP）的药物配制具有多项优势。首先，GNP 可在严格控制下合成，尺寸范围从几个纳米到约 100 nm。通常，较小尺寸的 GNP 比大尺寸的 GNP 更能高效地将药物递送入细胞，因为小尺寸颗粒更容易扩散至靶区域24。 其次，GNP 在体外和体内均无毒性25，因此是安全的药物载体。 第三，疏水性药物可被负载于经修饰的 GNP 上26。 第四，GNP 的表面化学性质易于针对特定应用进行修饰。在我们的研究中，使用两种短肽修饰 G.......
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披露
作者在此项目中无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了加拿大卫生研究院（PJT-148847）、安大略省研究与创新部（RE-08-029）以及多伦多大学卓越医学设计加拿大首要研究卓越计划的资助。刘明耀博士担任肺损伤、修复与再生领域的詹姆斯和玛丽·达维讲席教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带负电荷的谷氨酸肽（P2） | CanPeptide | 序列：CAAAAE-NH2 长度：6aa 修饰：C端酰胺化 数量：50mg 纯度：>95% | |
| 疏水性色氨酸肽（P4） | CanPeptide | 序列：CAAAAW-NH2 长度：6aa 修饰：C端酰胺化 数量：50mg 纯度：>95% | |
| δPKCi 肽 | CanPeptide | 序列：CSFNSYELGSL-NH2 长度：11aa 修饰：C端酰胺化 数量：50mg 纯度：>95% | |
| 锥形管（50ml） | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| 锥形管（15ml） | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| 超声波破碎仪 | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| 微量离心管 | Diamed.ca | AD 150-N | |
| 金纳米颗粒溶液 | Ted Pella | 15705-5 | 颗粒大小为20nm |
| 摇床振荡器 | VWR international | 40000-304 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5417R | |
| 丙烯酸比色皿 | SARSREDT | 67.758 | |
| 紫外-可见分光光度计 | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
参考文献
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S.
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重印与许可
