使用金纳米颗粒配制蛋白激酶C-delta抑制肽

摘要

我们此前曾使用金纳米颗粒-多肽杂合物通过静脉递送一种合成多肽——蛋白激酶C-δ抑制剂，该方法减轻了缺血-再灌注所致的急性肺损伤。本文展示了该药物制剂的详细方案。其他细胞内多肽也可采用类似方法进行制剂开发。

摘要

蛋白激酶C-δ抑制剂（PKCδi）是一种有前景的药物，可用于预防缺血-再灌注引起的器官损伤。该药物通常与细胞穿透肽TAT偶联，以实现细胞内递送。然而，TAT已被发现具有非特异性的生物学活性。金纳米颗粒（GNPs）可作为药物递送载体，且无已知毒性。因此，我们采用了一种GNP/肽杂合体系来递送PKCδi。两种短肽（P2：CAAAAE和P4：CAAAAW）以95:5的比例用于修饰GNP的表面性质。与PKCδi偶联的GNPs（GNP/PKCi）在蒸馏水、0.9% NaCl以及含牛血清白蛋白或胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS）中均保持稳定。先前研究表明，静脉注射GNP-PKCi可预防肺部缺血-再灌注损伤。本文概述了制备GNP/PKCi的方案及其理化性质的表征方法。我们已使用类似方法将其他基于肽的药物与GNP进行制剂化。本文有望引起更多关注，推动这一新型细胞内药物递送技术及其在体应用的发展。

引言

肺移植可挽救终末期肺病患者的生命¹。然而，肺移植后严重的并发症仍然是一个障碍。在肺移植后的早期阶段，原发性移植物功能障碍是最严重的并发症¹，其主要原因是缺血-再灌注（IR）引起的急性肺损伤²。

在低温保存期间，供体肺的代谢活动被限制在极低水平。然而，由于血流停止，活性氧和一氧化氮的合成被激活³。移植后，血液灌注恢复，冷缺血期间产生的活性氧和一氧化氮会加剧炎症反应和细胞死亡，导致组织损伤。

为预防缺血再灌注损伤（IR损伤），蛋白激酶Cδ抑制剂（PKCδi）已被应用于心脏、大脑和肺组织^4,5,6,7,8。这些研究表明，PKCδi可在再灌注期间减轻炎症反应和细胞凋亡。此外，PKCδi还可在大鼠模型及肺移植模型中预防肺部IR损伤⁶。PKCδi通常与一种细胞穿透肽TAT偶联，以实现细胞内递送。然而，已有研究显示TAT肽本身具有非特异性的生物学效应，包括促进血管生成、诱导细胞凋亡以及抑制多种细胞因子^9,10,11。纳米颗粒是直径在1至100 nm范围内的微小颗粒¹²，已被探索作为药物递送的候选载体¹³。特别是金纳米颗粒（GNPs）被认为具有无创性和低毒性。因此，我们已开发GNPs作为基于肽类药物的递送载体^14,15。

金纳米颗粒（GNPs）的表面可针对特定应用进行修饰，例如分子识别^16,17、化学传感¹⁸、成像¹⁹以及药物递送。已开发出一种金纳米颗粒/多肽杂合体系，包含20 nm的金纳米颗粒和两种短肽（P2：CAAAAE 和 P4：CAAAAW），其比例为95:5，用于调控金纳米颗粒的表面性质。P2多肽末端含有带负电荷的谷氨酸（E），可在水溶液中稳定金纳米颗粒；P4多肽末端含有疏水性色氨酸（W），有助于金纳米颗粒进入细胞¹⁴。这些多肽N端的半胱氨酸（C）残基含有巯基，可与金表面结合¹⁴。该多肽/金纳米颗粒杂合体系进一步用于递送PKCδi（CSFNSYELGSL）。P2:P4与PKCδi的最佳摩尔比为47.5:2.5:50。与PKCδi偶联的金纳米颗粒（GNP/PKCi）在蒸馏水、0.9% NaCl及含有牛血清白蛋白或胎牛血清的PBS 中均具有良好的稳定性¹⁴。静脉注射GNP/PKCi已被证明可预防肺缺血-再灌注损伤¹⁵。本文概述了制备GNP/PKCi的方法，并描述了如何评估其理化性质。我们已采用类似方法制备了其他基于多肽的药物与金纳米颗粒的偶联物^20,21,22。我们希望本文能引起更多关注，推动这一新型胞内药物递送体系的发展。

方案

1. 肽溶液的制备

1. 从 -20 °C 冰箱中取出肽段（P2：CAAAAE，P4：CAAAAW，PKCδi：CSFNSYELGSL），在室温（RT）下解冻。
   注意：保持瓶盖关闭，防止水分在肽段上冷凝。
2. 使用微量天平称取每种肽段各 0.01 g，分别放入不同的 50 mL 锥形管中。
3. 向 P2 管中加入 18.74 mL 去离子水（DI 水）。
4. 向 P4 管中加入 16.93 mL 去离子水（DI 水）。
5. 向 PKCδi 管中加入 8.21 mL 用去离子水稀释的 50% 乙腈。
6. 短暂涡旋混合肽段溶液，将 50 mL 锥形管置于超声仪（40 MHz）中处理 5 分钟。
7. 将肽段溶液转移至生物安全柜中。所配制的肽段溶液浓度均应为 1 mM。
8. 将每种肽段溶液各 1 mL 转移至新的 50 mL 锥形管中；向 P2 和 P4 管中各加入 19 mL 去离子水，向 PKCδi 管中加入 19 mL 50% 乙腈，使各溶液稀释至 50 µM，并分别储存于各自的管中。

2. GNP/PKCi 的配制

1. 应在生物安全柜内将多肽加入GNP溶液中
2. 向一个15 mL离心管中加入475 μL的P2、25 μL的P4和500 μL的δPKCi溶液。再向同一离心管中加入9 mL的20 nm GNP溶液（7.0×10¹¹ 粒子/mL）
3. 离开生物安全柜，用铝箔包裹15 mL离心管，并在室温下置于摇床上过夜
4. 将样品重新放回生物安全柜内，将1 mL的GNP/PKCi溶液分装至各1.5 mL微量离心管中
5. 在4 °C条件下，以15,294 × g离心30分钟
6. 在生物安全柜内小心吸除每根离心管中的上清液
   注意：吸除上清液时需小心操作，确保GNP沉淀完整，避免吸出沉淀
7. 根据所需浓度，将沉淀重悬于适当的溶剂中。适用的溶剂包括去离子水、PBS和0.9% NaCl
   注意：从1 mL的GNP/PKCi溶液开始，GNP沉淀含有6.3 × 10¹¹ 个粒子（基于制造商提供的GNP浓度）。若需在500 µL的0.9% NaCl溶液中给予1.3 × 10¹² 个粒子，则向三个沉淀中各加入232 µL的0.9% NaCl，合并后即可获得500 µL的GNP/PKCi溶液
   注意：在稀释GNP/PKCi沉淀前，应充分混匀所用溶剂，否则GNP/PKCi可能发生聚集

3. GNP/PKCi 杂化物溶解度的评估

1. 将0.5 mL的GNP/PKCi溶液倒入丙烯酸比色皿中。将丙烯酸比色皿置于紫外-可见分光光度计上，检测其最大吸收峰¹⁵。

结果

应仔细评估 GNP/PKCi 杂交体的生物物理特性，因为 GNP 在溶剂中容易发生聚集。当 GNP 聚集时，溶液颜色会从粉红色变为紫色（图 1a）。紫外-可见分光光度计能够更灵敏地检测到这种变化。若 GNP/PKCi 未发生聚集，则吸收峰应位于 525 nm 处（图 1b）。若 GNP 发生聚集，吸收峰将向长波方向移动。作为另一种分析方法，当形成聚集体时，Δ光密度（ΔOD = 525 nm 处的 OD 减去 440 nm 处的 OD）会降低。

讨论

为确保正确的配制，δPKCi 溶液必须经过步骤 1.6 中所述的超声处理。δPKCi 肽序列含有疏水性部分，因此使用超声仪有助于将 PKCi 溶解于 50% 乙腈溶液中。此外，必须严格按照步骤 2.7 所述仔细混合溶剂。  如果未正确执行这些步骤，δPKCi 肽可能发生聚集，导致 GNP/PKCi 杂化物配制不良²³。 
 
基于金纳米颗粒（GNP）的药物配制具有多项优势。首先，GNP 可在严格控制下合成，尺寸范围从几个纳米到约 100 nm。通常，较小尺寸的 GNP 比大尺寸的 GNP 更能高效地将药物递送入细胞，因为小尺寸颗粒更容易扩散至靶区域²⁴。  其次，GNP 在体外和体内均无毒性²⁵，因此是安全的药物载体。  第三，疏水性药物可被负载于经修饰的 GNP 上²⁶。  第四，GNP 的表面化学性质易于针对特定应用进行修饰。在我们的研究中，使用两种短肽修饰 G...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带负电荷的谷氨酸肽（P2）	CanPeptide		序列：CAAAAE-NH2 长度：6aa 修饰：C端酰胺化 数量：50mg 纯度：>95%
疏水性色氨酸肽（P4）	CanPeptide		序列：CAAAAW-NH2 长度：6aa 修饰：C端酰胺化 数量：50mg 纯度：>95%
δPKCi 肽	CanPeptide		序列：CSFNSYELGSL-NH2 长度：11aa 修饰：C端酰胺化 数量：50mg 纯度：>95%
锥形管（50ml）	Corning Life Sciences	3582070
锥形管（15ml）	Corning Life Sciences	3582096
乙腈	Sigma-Aldrich	271004-100ML
超声波破碎仪	Branson Ultrasonics Corp.	Branson 2510MTH
微量离心管	Diamed.ca	AD 150-N
金纳米颗粒溶液	Ted Pella	15705-5	颗粒大小为20nm
摇床振荡器	VWR international	40000-304
微量离心机	Eppendorf	5417R
丙烯酸比色皿	SARSREDT	67.758
紫外-可见分光光度计	Agilent	Caty 60 UV-Vis