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利用酵母中多聚谷氨酰胺毒性检测评估荧光蛋白对融合伴侣的影响

DOI：

10.3791/58748

⸱

2018年11月28日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了评估荧光蛋白对错误折叠的多聚谷氨酰胺扩展的聚集性和毒性影响的实验方案，可用于在荧光报告系统背景下快速评价一种新发现但尚未表征的荧光蛋白。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在利用活细胞成像研究蛋白质定位与转运时，研究人员通常依赖于将目标蛋白与荧光报告蛋白融合。随着基因编码的荧光蛋白（FP）种类不断增多，用户在设计荧光融合蛋白时面临多种选择。每种荧光蛋白都具有特定的光学和生物物理特性，可能影响所形成荧光融合蛋白的生化、细胞及功能特性。例如，某些荧光蛋白倾向于形成非特异性寡聚体，可能干扰融合伴侣蛋白的功能。遗憾的是，目前可用于评估荧光蛋白对报告蛋白行为影响的方法十分有限。本文中，我们描述了一种简单方法，可通过芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中的多聚谷氨酰胺（polyQ）毒性实验，快速评估荧光蛋白的影响。含扩展多聚谷氨酰胺序列的亨廷顿蛋白与亨廷顿病（HD）的发病相关，该蛋白会聚集形成有毒的寡聚体和包涵体。在酵母中，polyQ序列的聚集性和毒性高度依赖于其侧翼序列，包括荧光标签的存在，因此为研究荧光蛋白对其融合伴侣行为的影响提供了理想的实验平台。

引言

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自从首次对来自Aequorea victoria的绿色荧光蛋白（GFP）进行表征以来1，已开发出一系列遗传编码的荧光蛋白（FP），使细胞生物学家能够在活细胞中同时定位并追踪多种细胞事件/蛋白质2,3。荧光蛋白来源于多种生物体，从水母到珊瑚，因此其表现出的生物物理特性远不止各自的荧光光谱范围。这些特性包括亮度、光稳定性以及形成寡聚体的倾向等2,4。在设计荧光报告蛋白时，选择单体形式的荧光蛋白是筛选合适标签的重要考虑因素，以尽量减少不适当的相互作用以及融合伴侣功能的改变，并最大化报告蛋白在特定细胞区室中的效率4,5,6。尽管GFP经过长期优化，已能尽量降低荧光标签对融合伴侣的影响5,7,8，但新型荧光蛋白变体相较于GFP的表现仍难以评估。

目前可用于表征荧光蛋白（FPs）行为的方法较少。大多数方法依赖于生化手段来检测荧光蛋白的生物物理特性，例如超速离心和凝胶过滤实验方案9,10,11,12。然而，这些方法的局限性在于使用溶液中纯化的荧光蛋白，难以反映其在完整细胞内的实际行为。有序光滑内质网（OSER）检测技术的发展为评估荧光蛋白在活细胞中发生寡聚化的倾向提供了可量化的手段13，其原理是检测过表达的荧光蛋白是否能够将内质网小管重组为OSER环状结构14。该技术能够有效区分GFP及其他荧光蛋白的单体与寡聚体变体。然而，该方法主要依赖瞬时转染细胞中的过表达，且定量分析和图像处理可能耗时较长，除非将其整合为自动化的数据采集与分析流程。

为了补充这些方法，我们建立了一种实验方案，利用荧光标签对酵母中多聚谷氨酰胺（polyQ）扩增的毒性和聚集效应的影响15,16。编码亨廷顿蛋白（Htt）的基因第一外显子中，若polyQ序列扩增至36个以上重复，便与亨廷顿病相关17,18。在酵母中表达扩增的Httex1会导致错误折叠的Htt蛋白强烈聚集，并伴随严重的生长缺陷。有趣的是，这些表型受到polyQ序列侧翼序列的显著影响，包括荧光蛋白（FPs）15,16。已有研究认为，不同荧光蛋白的特性可能对酵母中polyQ的毒性产生差异性影响。事实上，与GFP类荧光蛋白相比，红色荧光蛋白及其进化形式表现出较低的毒性和聚集性16。本文提供了一套详细的实验流程，用于评估新一代荧光蛋白对酵母中polyQ毒性和聚集的影响。该检测方法可快速、高通量地分析荧光蛋白变体，可与已有的表征技术并行使用，以全面优化新荧光蛋白的特性评估，并比较其相对于GFP的性能表现。

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方案

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1. 为在酵母中表达生成新的荧光标记Httex1报告基因

注意：本节内容已根据 Jiang et al.16 和 Albakri et al.19 的实验方案进行了修改。

  1. 设计引物以通过 PCR 扩增编码荧光蛋白或目的序列的片段。上游引物应包含一段有助于限制性内切酶消化的引导序列（GATC），随后接 SpeI 限制性酶切位点（ACTAGT），以及目的荧光蛋白基因 ATG 起始密码子下游 20 个碱基（不包含 ATG）。下游引物应包含引导序列（GATC），随后接 SalI 限制性酶切位点（GTCGAC），以及荧光蛋白序列终止密码子上游 20 个碱基的反向互补序列（包含终止密码子）。
  2. 使用步骤 1.1 中设计的引物，在 PCR 仪中进行 PCR 反应，反应条件如下：95 °C 预变性 1 分钟，随后进行 18 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 30 秒、60 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸（每千碱基产物延伸 2 分钟）。18 个循环已足够。
  3. 将 PCR 产物在琼脂糖凝胶（0.5% Tris-乙酸-EDTA 缓冲液配制）上电泳。应出现一条与预期产物大小相符的单一条带。使用凝胶回收试剂盒回收该片段。
  4. 本实验采用携带 25 个（无毒性）和 72 个（与亨廷顿病相关，具有强聚集性）多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列的 Httex1 载体。将 PCR 产物和载体均用 SpeI 和 SalI 限制性内切酶在 37 °C 下消化 3 小时。
  5. 参照步骤 1.3 的方法，将酶切后的载体在琼脂糖凝胶上电泳并纯化。
  6. 使用 PCR 纯化试剂盒纯化酶切后的 PCR 片段。
  7. 使用 T4 DNA 连接酶将酶切后的 PCR 片段与 p415-GAL1-FLAG-25/72QpolyQ 质粒1 进行连接（室温孵育 1 小时）。连接反应体系为 10 µL（含 1 µL T4 连接酶、1 µL 10× 缓冲液、6 µL PCR 片段和 2 µL 载体）。
  8. 取 2 µL 连接反应产物转化至 50 µL 的 Escherichia coli 感受态细胞中，冰上孵育 30 分钟。随后在 42 °C 热激 30 秒。加入 1 mL SOC 培养基，37 °C 摇床培养 1 小时。取 200 µL 转化液涂布于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。
  9. 挑取三个单菌落，分别接种于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 3 mL LB 液体培养基中，37 °C 摇床过夜培养，并使用质粒提取试剂盒提取质粒 DNA。
  10. 取 500 ng 质粒 DNA，用 SpeI 和 SalI 限制性内切酶在 37 °C 酶切 1 小时，随后在琼脂糖凝胶（0.5% Tris-乙酸-EDTA 缓冲液）上电泳。应出现两条大小正确的条带：载体条带（约 7 kb）和插入片段条带（大小根据目的基因而定）。随后通过测序验证质粒构建的正确性。
  11. 按照标准酵母转化流程2，将 p415-GAL1-FLAG-polyQ-FP 质粒转化至酵母菌株 W303 中。

2. 点样实验

  1. 将携带25Q/72Q并标记有目标荧光蛋白（FP）的酵母克隆划线接种于含有酵母选择性培养基（合成完全型-SC，不含亮氨酸）的琼脂平板上，碳源为葡萄糖。同时，划线接种25Q/72Q-ymsfGFP作为阳性对照。
    注意：不含荧光标签的25Q/72Q构建体无毒性，可作为阴性对照。
  2. 在30 °C下培养平板2–3天。
  3. 从平板上挑选最多三个单菌落。
  4. 接种至5 mL含有2%葡萄糖作为碳源的SC培养基中。
  5. 取200 µL过夜培养物离心收集菌体，并用无菌蒸馏水洗涤3次。
  6. 将菌体重悬于含有2%半乳糖作为碳源的SC培养基中，以诱导polyQ融合蛋白的表达。在30 °C下于旋转管中过夜培养。作为对照，使用含葡萄糖的培养基重复此步骤。
  7. 次日早晨，在无菌96孔板中，将各菌液的细胞密度调整至在600 nm处的光密度（OD600）为0.2，总体积为100 µL的SC培养基。
  8. 用无菌水进行四次五倍梯度稀释：将前一孔中的20 µL样品移液至下一孔中含80 µL培养基的孔中。
  9. 使用酵母点样工具将细胞点样到选择性平板（含葡萄糖或半乳糖）上，并在30 °C下培养2天。
  10. 使用成像记录装置对平板进行成像。

3. 液体培养中细胞生长的定量分析

  1. 按照本实验方案的步骤 2.1 - 2.5 准备细胞培养物。
  2. 使用分光光度计测量 OD600。
  3. 将细胞用 300 µL 培养基稀释至 OD600 为 0.1，置于 96 孔板中。
  4. 每个样品设置三个重复孔。
  5. 将 96 孔板放入具备振荡功能的酶标仪/培养箱中孵育。设置样品数量、温度为 30 °C、吸光度检测波长为 600 nm、实验总时长为 24 h、检测间隔为 15 min，并选择连续振荡模式。
  6. 使用科学绘图软件绘制生长曲线，并量化曲线下面积。推荐使用 GraphPad Prism 7。将数据粘贴至 XY 表格中，包含三个重复值。生长曲线将在左侧的 Graphs 文件夹下显示。为量化曲线下面积，请点击左上角的 Analyze ，然后在 XY analyses 中选择 Area under curve。

4. 荧光显微镜

  1. 按照本实验方案的步骤 2.1 - 2.5 准备细胞培养物。
  2. 用生长培养基将细胞稀释 10 倍，并将每种样品 200 µL 转移至 8 孔成像培养皿中。
  3. 使用配备 63X Plan Aprochromat 物镜（1.4 NA）的共聚焦显微镜在室温下对细胞进行成像。
    注意：共聚焦显微镜的使用为可选步骤，也可使用标准的宽场荧光显微镜。
  4. 调整针孔和激光功率以获得最佳图像采集效果。由于 72Q 聚集体的荧光信号远强于弥散的 25Q 信号，通常需要针对不同质粒采用不同的采集参数，以避免荧光信号饱和。
  5. 使用 ImageJ20 或其他图像处理软件对图像进行处理。在此步骤中，可根据需要手动计算显示聚集体的细胞百分比。

5. 点印迹

注意：本方案中使用点印迹法检测蛋白质表达水平。请按照本方案的步骤 2.1 - 2.5 准备细胞培养物。

  1. 使用玻璃珠在裂解缓冲液（100 mM Tris，pH 7.5；200 mM NaCl；1 mM EDTA；5% 甘油，1 mM 二硫苏糖醇 [DTT]）中制备蛋白裂解物。使用前直接加入蛋白酶抑制剂，包括 4 mM 苯甲基磺酰氟（PSMF）和蛋白酶抑制剂混合物。收集 5 mL 过夜培养物，离心后重悬于 200 µL 玻璃珠和 200 µL 裂解缓冲液中。涡旋 30 秒，重复 12 轮。在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟，收集上清液。
  2. 使用微滤装置将等量的总蛋白点样到硝酸纤维素膜上。先用 PBS 预润膜，然后组装装置。连接真空源，并确保螺丝已拧紧。开启真空，使样品在重力作用下通过膜过滤。
  3. 用含 0.05% Tween 和 5% 脱脂牛奶的 PBS 封闭膜。
  4. 在 4 °C 下用一抗抗-FLAG 抗体孵育膜过夜。推荐使用单克隆抗-FLAG M1 抗体。
  5. 用含 0.05% Tween 的 PBS 洗涤膜，每次 10 分钟，共洗 3 次。
  6. 在室温下用荧光标记的二抗（抗小鼠 IgG）在含 0.05% Tween 和 5% 脱脂牛奶的 PBS 中孵育膜 1 小时。
  7. 用含 0.05% Tween 的 PBS 洗涤膜，每次 10 分钟，共洗 3 次。
  8. 使用免疫印迹成像系统对膜进行成像。

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结果

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荧光蛋白（FPs）具有不同的生物物理特性，包括其形成寡聚体的倾向，这些特性可能会影响它们在荧光报告系统中与融合伙伴蛋白的相互作用行为。本实验方案描述了一种简单的方法，可将多种荧光蛋白与具有毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）扩增片段融合。由于polyQ的毒性高度依赖于polyQ序列两侧的侧翼序列15，该检测方法可实现对不同荧光标记的polyQ融合报告蛋白进行快速而直接的比较（图1）。实验中采用非亨廷顿病（HD）相关长度的polyQ序列（25Q）作为阴性对照，该序列不会表现出明显的毒性或聚集现象15,16,21,22。而72Q则用于诱导类似亨廷顿病的表型，包括显著的生长抑制和polyQ聚集。重要的是，本实验所使用的Ht...

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讨论

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本文采用多种检测方法，以Httex1 polyQ扩展片段的聚集及其对酵母生长影响为模型，研究不同荧光蛋白在荧光报告系统中如何改变其融合蛋白的特性。通过使用一种GFP变体（ymsfGFP）作为阳性对照，我们证明了该系统能够检测到不同荧光标签在polyQ毒性及聚集性方面的显著差异，并可对polyQ-FP融合蛋白的性能与GFP标记的构建体进行直接且快速的比较16,19。

尽管本实验方案主要针对荧光蛋白，但其中多个步骤可轻松调整以检测其他蛋白标签的影响。此外，本方案使用的是低拷贝酵母着丝粒载体，其在细胞内的拷贝数可能存在差异（通常为1至2个拷贝）25。采用整合型载体可确保不同实验条件下表达水平的一致性，从而避免这一问题。虽然本方案已针对W303遗传背景进行优化，但也可使用其他酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株。然而，在设计新的构建体之前，应先使用带有ymsfGFP标签的载体确定菌...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究得到了加拿大卫生研究院向 M.L.D. 和 P.L. 提供的运营资助。本文所述工作得到了加拿大创新基金会约翰·R·埃文斯领袖基金以及安大略研究基金向 P.L. 提供的配套资金支持。Y.J. 获得了西安大略大学舒立克医学与牙科学院院长颁发的硕士转博士奖学金支持。S.D.G. 获得了加拿大肌萎缩性脊髓侧索硬化症协会博士奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-α 型高效感受态大肠杆菌（E. coli）New England BiolabC2987
SpeI-HFNew England BiolabR3133推荐使用高保真酶
SalI-HFNew England BiolabR0138推荐使用高保真酶
琼脂糖赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）BP160
LB-琼脂赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）BP1425
LB 肉汤培养基赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）BP1426
氨苄青霉素赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）BP1760
PfuUltra 高保真 DNA 聚合酶安捷伦科技（Agilent Technologies）600382
EPOCH2 微孔板分光光度计BioTek 仪器公司（BioTek Instruments inc）EPOCH2TC
酵母点印迹复制器V&P 科学公司（V&P Scientific inc.）VP407AH
SPI 成像仪S&P 机器人公司（S&P Robotics inc.）spImager-M
配备 AryScan 的蔡司 LSM 800 共聚焦显微镜卡尔蔡司显微镜公司（Carl Zeiss Microscopy）LSM 800
8 孔 Lab-Tek 成像培养皿赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）12565470
Bio-Dot 点印迹装置Bio-Rad1706545
Chemi Doc XRS+ 成像系统Bio-Rad1708265
抗 FLAG M1 抗体西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）F3040
山羊抗小鼠 IgG Alexa 555 二抗赛默飞世尔科技（Thermo ）A32727
质粒小提试剂盒赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）K0503
质粒凝胶回收试剂盒赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）K0831
PCR 产物纯化试剂盒赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）K0702
PrizmGraphPadN/A
TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）BP13354

参考文献

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  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  3. Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
  4. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  5. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670(2015).
  6. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  7. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  8. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  9. Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
  10. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
  11. Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
  12. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  14. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
  15. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
  16. Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
  17. Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
  18. Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
  19. Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242(2018).
  20. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  21. Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
  22. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
  23. Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902(2013).
  24. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838(2008).
  25. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  26. Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
  27. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  28. Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
  29. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
  30. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  31. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).

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