利用酵母中多聚谷氨酰胺毒性检测评估荧光蛋白对融合伴侣的影响

摘要

本文描述了评估荧光蛋白对错误折叠的多聚谷氨酰胺扩展的聚集性和毒性影响的实验方案，可用于在荧光报告系统背景下快速评价一种新发现但尚未表征的荧光蛋白。

摘要

在利用活细胞成像研究蛋白质定位与转运时，研究人员通常依赖于将目标蛋白与荧光报告蛋白融合。随着基因编码的荧光蛋白（FP）种类不断增多，用户在设计荧光融合蛋白时面临多种选择。每种荧光蛋白都具有特定的光学和生物物理特性，可能影响所形成荧光融合蛋白的生化、细胞及功能特性。例如，某些荧光蛋白倾向于形成非特异性寡聚体，可能干扰融合伴侣蛋白的功能。遗憾的是，目前可用于评估荧光蛋白对报告蛋白行为影响的方法十分有限。本文中，我们描述了一种简单方法，可通过芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中的多聚谷氨酰胺（polyQ）毒性实验，快速评估荧光蛋白的影响。含扩展多聚谷氨酰胺序列的亨廷顿蛋白与亨廷顿病（HD）的发病相关，该蛋白会聚集形成有毒的寡聚体和包涵体。在酵母中，polyQ序列的聚集性和毒性高度依赖于其侧翼序列，包括荧光标签的存在，因此为研究荧光蛋白对其融合伴侣行为的影响提供了理想的实验平台。

引言

自从首次对来自Aequorea victoria的绿色荧光蛋白（GFP）进行表征以来¹，已开发出一系列遗传编码的荧光蛋白（FP），使细胞生物学家能够在活细胞中同时定位并追踪多种细胞事件/蛋白质^2,3。荧光蛋白来源于多种生物体，从水母到珊瑚，因此其表现出的生物物理特性远不止各自的荧光光谱范围。这些特性包括亮度、光稳定性以及形成寡聚体的倾向等^2,4。在设计荧光报告蛋白时，选择单体形式的荧光蛋白是筛选合适标签的重要考虑因素，以尽量减少不适当的相互作用以及融合伴侣功能的改变，并最大化报告蛋白在特定细胞区室中的效率^4,5,6。尽管GFP经过长期优化，已能尽量降低荧光标签对融合伴侣的影响^5,7,8，但新型荧光蛋白变体相较于GFP的表现仍难以评估。

方案

1. 为在酵母中表达生成新的荧光标记Htt^ex1报告基因

注意：本节内容已根据 Jiang et al.¹⁶ 和 Albakri et al.¹⁹ 的实验方案进行了修改。

1. 设计引物以通过 PCR 扩增编码荧光蛋白或目的序列的片段。上游引物应包含一段有助于限制性内切酶消化的引导序列（GATC），随后接 SpeI 限制性酶切位点（ACTAGT），以及目的荧光蛋白基因 ATG 起始密码子下游 20 个碱基（不包含 ATG）。下游引物应包含引导序列（GATC），随后接 SalI 限制性酶切位点（GTCGAC），以及荧光蛋白序列终止密码子上游 20 个碱基的反向互补序列（包含终止密码子）。
2. 使用步骤 1.1 中设计的引物，在 PCR 仪中进行 PCR 反应，反应条件如下：95 °C 预变性 1 分钟，随后进行 18 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 30 秒、60 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸（每千碱基产物延伸 2 分钟）。18 个循环已足够。
3. 将 PCR 产物在琼脂糖凝胶（0.5% Tris-乙酸-EDTA 缓冲液配制）上电泳。应出现一条与预期产物大小相符的单一条带。使用凝胶回收试剂盒回收该片段。
4. 本实验采用携带 25 个（无毒性）和....

结果

荧光蛋白（FPs）具有不同的生物物理特性，包括其形成寡聚体的倾向，这些特性可能会影响它们在荧光报告系统中与融合伙伴蛋白的相互作用行为。本实验方案描述了一种简单的方法，可将多种荧光蛋白与具有毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）扩增片段融合。由于polyQ的毒性高度依赖于polyQ序列两侧的侧翼序列¹⁵，该检测方法可实现对不同荧光标记的polyQ融合报告蛋白进行快速而直接的比较（图1）。实验中采用非亨廷顿病（HD）相关长度的polyQ序列（25Q）作为阴性对照，该序列不会表现出明显的毒性或聚集现象^15,16,21,22。而72Q则用于诱导类似亨廷顿病的表型，包括显著的生长抑制和polyQ聚集。重要的是，本实验所使用的Ht.......

讨论

本文采用多种检测方法，以Htt^ex1 polyQ扩展片段的聚集及其对酵母生长影响为模型，研究不同荧光蛋白在荧光报告系统中如何改变其融合蛋白的特性。通过使用一种GFP变体（ymsfGFP）作为阳性对照，我们证明了该系统能够检测到不同荧光标签在polyQ毒性及聚集性方面的显著差异，并可对polyQ-FP融合蛋白的性能与GFP标记的构建体进行直接且快速的比较^16,19。

尽管本实验方案主要针对荧光蛋白，但其中多个步骤可轻松调整以检测其他蛋白标签的影响。此外，本方案使用的是低拷贝酵母着丝粒载体，其在细胞内的拷贝数可能存在差异（通常为1至2个拷贝）²⁵。采用整合型载体可确保不同实验条件下表达水平的一致性，从而避免这一问题。虽然本方案已针对W303遗传背景进行优化，但也可使用其他酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株。然而，在设计新的构建体之前，应先使用带有ymsfGFP标签的载体确定菌.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-α 型高效感受态大肠杆菌（E. coli）	New England Biolab	C2987
SpeI-HF	New England Biolab	R3133	推荐使用高保真酶
SalI-HF	New England Biolab	R0138	推荐使用高保真酶
琼脂糖	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	BP160
LB-琼脂	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	BP1425
LB 肉汤培养基	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	BP1426
氨苄青霉素	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	BP1760
PfuUltra 高保真 DNA 聚合酶	安捷伦科技（Agilent Technologies）	600382
EPOCH2 微孔板分光光度计	BioTek 仪器公司（BioTek Instruments inc）	EPOCH2TC
酵母点印迹复制器	V&P 科学公司（V&P Scientific inc.）	VP407AH
SPI 成像仪	S&P 机器人公司（S&P Robotics inc.）	spImager-M
配备 AryScan 的蔡司 LSM 800 共聚焦显微镜	卡尔蔡司显微镜公司（Carl Zeiss Microscopy）	LSM 800
8 孔 Lab-Tek 成像培养皿	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	12565470
Bio-Dot 点印迹装置	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+ 成像系统	Bio-Rad	1708265
抗 FLAG M1 抗体	西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）	F3040
山羊抗小鼠 IgG Alexa 555 二抗	赛默飞世尔科技（Thermo ）	A32727
质粒小提试剂盒	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	K0503
质粒凝胶回收试剂盒	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	K0831
PCR 产物纯化试剂盒	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	BP13354