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使用表达增强型绿色荧光蛋白的Escherichia Coli评估小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用

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DOI：

10.3791/58751

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2019年1月4日

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1Anesthesiology Department, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2Scientific Research Center, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

此处介绍一种利用表达增强型绿色荧光蛋白的实验方案，用于评估小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用 大肠杆菌.

摘要

本文描述了一种简单且可重复的吞噬作用检测方法。该方法的第一部分包括构建pET-SUMO-EGFP载体（SUMO = 小泛素样修饰蛋白）并在其中表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP） 大肠杆菌 (BL21DE)。表达EGFP的 E. coli 在37 °C下与巨噬细胞共孵育1小时；阴性对照组在冰上孵育相同时间。随后，巨噬细胞即可用于检测。该技术的优点在于步骤简单直接，且可通过流式细胞仪和荧光显微镜两种方法检测吞噬作用。表达EGFP的 E. coli 即使在用多聚甲醛固定巨噬细胞后，仍能保持稳定并显示出强烈的荧光信号。该方法不仅适用于体外培养的巨噬细胞系或原代巨噬细胞的评估，也适用于外周血单个核细胞中粒细胞和单核细胞吞噬功能的评价。结果显示，来自年轻（8周龄）小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬能力高于来自老龄（16月龄）小鼠的巨噬细胞。综上所述，该方法可用于检测巨噬细胞的吞噬功能，适用于先天免疫系统功能的研究。

引言

巨噬细胞吞噬实验常用于研究先天免疫功能。先天免疫反应可能提示机体对感染的易感性。巨噬细胞系在免疫学研究中被广泛使用。然而，长期传代可能导致这些细胞系发生基因丢失及免疫功能受损。因此，原代腹腔巨噬细胞是研究巨噬细胞功能的理想对象1。

尽管人们认为衰老机体的先天免疫反应仍然完整，但其吞噬能力可能较年轻机体有所下降2,3。本文将介绍一种利用表达EGFP的大肠杆菌（E. coli）评估年轻（8周龄）和老龄（16月龄）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的方法，该方法简便、快速且经济可行。

使用表达EGFP的大肠杆菌（E. coli）菌株是本实验的一个优势，因为这些细菌具有良好的稳定性，即使在巨噬细胞经4%（w/v）多聚甲醛固定后仍能保持强烈的荧光信号。此外，使用表达EGFP的大肠杆菌（E. coli）可避免吞噬作用发生后额外的染色步骤，从而节省时间。更重要的是，巨噬细胞对大肠杆菌（E. coli）表面抗原具有免疫应答性，因此与使用表达EGFP的真菌或荧光素标记的微球相比，大肠杆菌（E. coli）更适用于吞噬作用实验。

使用表达EGFP的E. coli，可在2小时内轻松完成吞噬作用检测，并根据研究者的目的，通过流式细胞术和荧光显微镜进行检测。由于该方法直接测量吞噬能力，其结果比其他间接方法更具可重复性。

该方法已在RAW264.7细胞系和人外周血单个核细胞中得到验证4。下文提供了进行该检测的详细分步操作说明，并强调了研究人员可根据实验需求进行调整的关键步骤。

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方案

​所有操作均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并经大连医科大学实验动物福利与使用委员会批准。实验所用16月龄（体重30–35 g）和8周龄（体重20–25 g）SPF级（无特定病原体）雄性C57BL/6小鼠均购自大连医科大学SPF级动物中心。所有小鼠均饲养于动物房中，自由摄食饮水 随意摄取温度保持在20-24 °C，湿度为40%-70%，光照条件为12小时光照/12小时黑暗。动物在实验前至少适应环境7天。

1. pET-SUMO-EGFP 质粒的构建及 EGFP 表达的诱导

  1. 合成EGFP基因片段（由定制基因合成服务合成的717 bp序列，序列信息见材料表和补充文件1），使用上游引物（5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3'）和下游引物（5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'），以高保真Taq DNA聚合酶扩增该片段。
  2. 为确保聚合酶链式反应（PCR）产物在下一阶段TA克隆中具有单个3'端腺苷突出端，在最后一个循环后于72 °C延伸30分钟（PCR反应条件见补充文件1）。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
  3. 采用TA克隆法5将PCR产物克隆至pET-SUMO载体（见材料表），使用T4 DNA连接酶。反应在室温（20–25 °C）孵育30分钟。该载体在核苷酸653与654之间线性化，每条链均带有1个碱基的5′ T突出端。
  4. 将连接产物转化至化学感受态BL21(DE) E. coli 菌株：将5 µL（100 ng）PCR产物加入100 µL BL21(DE)感受态细胞中，42 °C热激90秒；冰上静置3分钟，随后加入400 µL预热至37 °C的LB（Lysogeny Broth）培养基，于37 °C、120 rpm振荡培养1小时。
  5. 取100 µL菌液涂布于含卡那霉素（100 µg/mL）并添加诱导剂乳糖（0.5 mmol/L）的LB平板表面，获得EGFP表达菌株。于37 °C过夜培养。
    注意：若EGFP成功表达，部分菌落在暗处可见绿色荧光。
    1. 可选步骤：挑取菌落，通过DNA测序验证插入的EGFP片段。DNA测序引物如下：上游引物为5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'；下游引物为5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'。
  6. 挑取阳性单菌落接种于5 mL含100 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37 °C、120 rpm振荡培养2小时，随后加入乳糖至终浓度0.5 mmol/L，继续振荡培养6小时以诱导EGFP表达。经验表明，振荡培养6小时后，600 nm处的光密度（OD600）可达0.7或更高。
  7. 取10 µL菌液滴加至载玻片上，加盖盖玻片，于倒置荧光显微镜下观察EGFP表达情况。表达EGFP的细菌可在培养基中于2–8 °C保存数周。

2. 小鼠腹腔巨噬细胞的分离与原代培养

  1. 将3.5 g巯基乙酸盐加入100 mL蒸馏水中，混合后高压灭菌至无菌，备用。在生物安全柜中将巯基乙酸盐培养基抽入1 mL无菌注射器中，用于小鼠腹腔注射。每只小鼠使用一支独立的注射器，以避免感染。使用巯基乙酸盐可增加巨噬细胞数量。无需巯基乙酸盐也可分离常驻腹腔巨噬细胞，但巨噬细胞得率较低。
  2. 采用当地动物护理与使用委员会批准的方法对小鼠进行麻醉。使用1 mL注射器和23 G针头，向小鼠腹腔内注射1 mL 3.5%的巯基乙酸盐培养基。
    注意：通过诱导麻醉，可更顺利地进行腹腔注射，并降低因注射造成内脏器官损伤的风险。
  3. 将小鼠置于自由饮水和进食（ad libitum）条件下饲养3天。每天监测动物的体重和摄食量。若在3天内体重下降超过10%，则将该动物排除在实验之外。
  4. 3天后，在密闭盒中使用七氟烷快速诱导麻醉，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。或者，采用当地动物护理与使用委员会批准的其他方法处死小鼠。
  5. 将小鼠放入盛有75%乙醇的培养皿（直径10 cm）中进行表面消毒，迅速转移至生物安全柜中。将小鼠置于平板上，并用针固定前肢，以固定其位置。
  6. 使用连接20 G针头的5 mL注射器，针尖斜面向上，以30°–40°角将5 mL冷（4–10 °C）磷酸盐缓冲液（PBS）注入小鼠下腹部腹腔内，注意避免刺穿肠道。若刺穿肠道（或其他器官），则该小鼠及其细胞不可再用于实验，因为这可能激活不适合原代细胞培养的细胞。
  7. 轻轻按摩小鼠腹部两侧，然后缓慢轻柔地抽吸腹腔液体。将腹腔灌洗液收集至50 mL离心管中。重复此步骤2至3次。
  8. 将收集的细胞悬液在4–8 °C下以400 × g 离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中。进行细胞计数。经验表明，当细胞重悬于10 mL培养基中时，细胞密度约为5 × 106 个细胞/mL。
  9. 为流式细胞术实验，将5 × 106 个细胞接种至6孔板的每个孔中；为荧光显微镜实验，将5 × 105 个细胞接种至24孔板的每个孔中。将细胞在37 °C、5% CO2 培养箱中培养过夜。可在3小时后更换培养基，以去除非贴壁细胞（主要是淋巴细胞）。贴壁细胞主要为巨噬细胞，可良好贴附于组织培养处理过的塑料表面。

3. 使用荧光显微镜进行巨噬细胞吞噬作用检测

  1. 在明场显微镜下观察细胞，以评估细胞活力和细胞密度。
  2. 从24孔板中移除培养基。按照表1所述，向每孔加入100 µL新鲜培养基和10 µL细菌悬液（约2 × 107个细胞）。在37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时。
  3. 每孔用500 µL冷PBS轻柔洗涤3至5次，以去除未被内化的细菌。
  4. 在室温下用含4%甲醛的PBS固定细胞，孵育30分钟。
  5. 用PBS（500 µL/孔）洗涤固定后的细胞3次。
  6. 加入200 µL鬼笔环肽633（phalloidin 633）荧光染料偶联工作液（见材料表），用于染色F-肌动蛋白。在室温下避光、湿润环境（湿度60%-80%）中孵育60分钟。用PBS（500 µL/孔）冲洗细胞3次，以去除多余的鬼笔环肽。通过染色F-肌动蛋白，可勾勒出细胞质轮廓，有助于区分被内化的细菌。
  7. 加入200 µL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）工作液（1 µg/mL），染色细胞核，在室温下避光、湿润环境中孵育5分钟。用PBS（500 µL/孔）冲洗1次，再用相同体积的蒸馏水冲洗1次。随后，细胞即可用于倒置荧光显微镜观察。

4. 使用流式细胞术进行巨噬细胞吞噬作用检测

  1. 为尽量减少实验误差并正确解读实验结果，请按照表2中列出的设置分组和对照管。
    1. 对于置于冰上的对照组（表2中的第4组），移除6孔板中的培养基，用PBS洗涤1次。然后向孔中加入1 mL 70 mM冷EDTA以解离细胞，并将细胞转移至流式管中。向管中加入50 µL细菌悬液，置于冰上孵育1 h。
    2. 对于其他各组，移除培养基，每孔加入1 mL新鲜培养基。根据表2中的分组设置，向各孔中加入50 µL细菌悬液。然后将6孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育1 h。
  2. 为淬灭未被内化的E. coli的荧光，向孔中加入200 µL 0.8%结晶紫（CV）水溶液，短暂摇动，以避免表达EGFP的E. coli仅结合于巨噬细胞表面而未被内化所导致的假阳性结果。用PBS洗涤细胞3次，以去除残留的CV。
  3. 然后向孔中加入1 mL 70 mM冷EDTA以解离细胞，并将细胞转移至流式管中。
  4. 将各管在400 × g下离心5 min，弃去上清液。
  5. 加入100 µL PBS重悬细胞。根据分组设置，向各管中加入5 µL F4/80-PE标记抗体（小鼠巨噬细胞表面抗原）或IgG2a-PE同型对照抗体。短暂涡旋混匀，冰上避光孵育5–10 min。
  6. 每管加入1 mL PBS，400 × g离心5 min，弃去上清液。用200–300 µL PBS重悬细胞沉淀，进行流式细胞术分析。每管上机检测，至少获取10,000个F4/80+细胞的事件数据。

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结果

pET-SUMO 载体利用一种小泛素样修饰蛋白，以实现目标蛋白在 E. coli 中的天然表达。SUMO 融合可显著提高 EGFP 的可溶性，使其易于检测。若乳糖成功诱导 EGFP 表达，则可在暗处观察到绿色菌落（图 1A）。在荧光显微镜下使用 40 倍物镜，可观察到代表表达 EGFP 的 E. coli 的绿色荧光点（图 1B）。

显微镜分析显示了来自年轻组和老龄组小鼠腹腔巨噬细胞的荧光图像（图1C）。图1C展示了F-actin的红色荧光、表达EGFP的大肠杆菌（E. coli）的绿色荧光、DAPI细胞核染色的蓝色荧光，以及三个荧光通道的合并图像。16月龄小鼠被...

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讨论

本方案中的步骤非常简单直接。其中一个关键步骤是在E. coli中诱导EGFP表达。通常情况下，当计划在原核生物（如E. coli）中表达真核生物来源的基因（如EGFP）时，存在蛋白质形成无活性聚集体（包涵体）的风险，这会改变蛋白质的天然结构和活性。通过使用pET-SUMO载体并构建pET-SUMO-EGFP质粒，成功表达了EGFP-SUMO融合蛋白，其荧光信号足够强，可通过荧光显微镜和流式细胞仪检测到。

另一个关键步骤是淬灭未被巨噬细胞内化的细菌的荧光。尽管台盼蓝已被证明可淬灭异硫氰酸荧光素（FITC）标记的热灭活细菌的荧光，但其对活的 E. coli 无效。使用0.8%的结晶紫水溶液可淬灭大部分结合在细胞表面的 E. coli 的荧光。一些文献建议用抗生素洗涤代替台盼蓝洗涤可能有助于淬灭荧光，但在本实验中该方法并不有效10。

细胞密度可能限制该技术的应用。由于细胞由淋巴细胞和巨噬细胞的混合物组成，在从小鼠腹...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究受到中国国家自然科学基金（编号：31800046）和辽宁省自然科学基金（编号：20170540262）的资助。本研究在大连医科大学附属第二医院科研中心实验室完成。作者感谢桑晓林在流式细胞术方面的协助，感谢曲波和杨东川在视频制作过程中的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD FACSCanto II 流式细胞仪BD Biosciences-
生物素标记抗小鼠 CD16/32 抗体BiolegendCat101303
Champion pET SUMO 蛋白表达系统InvitrogenK300-01
定制基因合成服务Takara Biotech.-
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）ThermoFisherD1306
用于流式细胞术的 F4/80-PE 抗小鼠抗体BiolegendCat123110
Leica DMI3000 B  倒置显微镜Leica Microsystems-
PE 标记大鼠 IgG2a，κ 同型对照抗体BiolegendCat400507
鬼笔环肽 633 荧光染料偶联工作液AAT BioquestCat23125
巯基乙酸盐培养基Sigma-AldrichT9032

参考文献

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