本文描述并应用了一种高通量方案，用于功能性评估高效激活HIV并清除潜伏前病毒的效果，通过检测干预措施对HIV转录和剪接的影响来实现。文中提供了潜伏期逆转剂对LTR驱动的转录和剪接作用的代表性结果。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
由于存在一类细胞库，其内藏有稳定且潜伏形式的病毒，这些病毒对免疫系统不可见，也无法被当前的抗逆转录病毒疗法（cART）所清除，因此艾滋病至今无法治愈。研究表明，转录与剪接过程在静息CD4+ T细胞中可加剧HIV-1的潜伏状态。通过使用潜伏逆转剂（LRAs）逆转潜伏状态，是实现“激活并清除”策略的关键步骤 "休克与清除" 该方法已被广泛研究，旨在清除这一潜伏库，但由于缺乏能够有效干扰该潜伏库的合适小分子，迄今为止在临床试验中尚未取得成功。本文所述方案提供了一种可靠且高效评估潜伏逆转剂（LRAs）对HIV转录和剪接作用的方法。该方法基于使用由LTR驱动的双色报告系统，可通过流式细胞术同时检测潜伏逆转剂对转录和剪接的影响。本方案适用于贴壁细胞和悬浮细胞，可用于高通量系统中大量药物的筛选。该方法技术操作简便且成本效益高。此外，结合流式细胞术的应用，可同时评估细胞活力，从而判断药物毒性。
引言
尽管长期抗逆转录病毒治疗有效，HIV仍以整合前病毒的形式在记忆性CD4+ T细胞中处于潜伏状态1。HIV-1 5'长末端重复序列（LTR）启动子的染色质结构以及DNA甲基转移酶（DNMT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）介导的组蛋白甲基化和去乙酰化等表观遗传修饰，是导致转录抑制和整合后潜伏的重要机制2,3。已有大量潜伏逆转剂（LRAs）被研究用于评估其在体外和体内诱导潜伏感染的静息CD4+ T细胞产生病毒的能力4,5,6,7,8。在已测试的LRAs中，HDAC抑制剂（HDACi）和BET溴结构域抑制剂（BETis）分别通过诱导染色质去凝集和释放正性转录延伸因子b（P-TEFb），从而缓解5'LTR处的转录抑制并激活HIV表达9,10,11,<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：克隆、转化和测序的相关操作步骤在其他文献中有详细讨论18,19。本文所述实验方案从转染哺乳动物表达载体开始（图3）。
1. 使用双色报告基因质粒转染 HEK293T 细胞
- 在含有10% (v/v) 胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2 培养箱中培养HEK293T细胞。解冻后，将HEK293T细胞传代2-3次后再用于转染实验，以使细胞有足够时间从冻存复苏过程中恢复。
注意：支原体污染细胞培养物仍然是一个严重问题。良好的实验室操作规范和对细胞培养物进行常规检测对于降低支原体污染风险并防止其扩散至关重要20。 - 接种前一天以1:2比例传代细胞，并将其转移至新鲜DMEM培养基中，在37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养24小时。
- 转染前一天，通过抽吸法移除培养瓶中的培养基，并用不含钙离子（Ca2+）和镁离子（Mg2+）....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
代表性结果如图所示 图5 用于检测溴结构域抑制剂JQ1处理后HIV-1未剪接（EGFP）和剪接（DsRed）产物的表达。JQ1(+)和Tat均显著增加了表达EGFP的细胞比例（相对于DMSO分别为2.18倍和4.13倍；n = 3），提示未剪接转录本的增加。此外，JQ1(+)还显著提高了表达DsRed的细胞比例（相对于DMSO为46.6倍）以及剪接产物的比例（相对于DMSO为7.37倍），其水平与Tat处理组相当（分别为DMSO的59.6倍和5.83倍），证实JQ1(+)具有激活HIV转录和剪接的能力。另一方面，使用立体异构体对照JQ1(-)处理则消除了JQ1(+)对HIV转录和剪接的影响，验证了本实验方案的成功。
在最近的一项研究中，我们通过RNA分析发现，在使用JQ1(+)处理后，HIV剪接转录本出现累积21。事实上，我们的数据显示，未剪接和.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于在体外测量病毒再激活存在困难，长期以来已开发出多种体外模型用于研究HIV潜伏感染，包括潜伏感染的T细胞系（J-Lats、ACH2、U1）以及静息态（O'Doherty、Lewin、Greene和Spina模型）或预激活CD4+ T细胞（Sahu、Marini、Planelles、Siliciano、Karn模型）的原代潜伏感染模型，这些模型使用单周期或具有复制能力的报告病毒22。为了模拟HIV在静息CD4+ T细胞中潜伏的生理条件，相继开发了双荧光报告系统，例如Ivan Sadowski研究组开发的RGH（Red-Green-HIV）报告系统，该系统包含由LTR驱动的Gag-eGFP标记物以及由CMV启动子驱动、取代Nef的mCherry23。E. Verdin实验室开发了类似的双色报告病毒Duo-Fluo，其包含由LTR驱动的EGFP表达和由EF1α启动子驱动的mCherry荧光标记24。在该系统中，EGFP被插入前病毒3'端以取代Nef。这两个系统中包膜蛋白的缺失可防止多轮感染。此外，两.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）项目资助 APP1129320 和项目计划资助 APP1052979 的支持。我们感谢 Adam Wheatley 博士、Marina Alexander 博士、Jenny L. Anderson 博士以及 Michelle Y. Lee 提供了完成本研究所需的关键载体和宝贵建议。我们还感谢 DMI 流式细胞术平台工作人员在本研究所用流式细胞仪的维护过程中提供的专业建议和大力支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | |||
| HEK293T 细胞（人胚胎肾细胞） | ATCC | CRL-3216 | 可复制携带 SV40 复制区的载体。 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM 1x + GlutaMAX-I） | Gibco | 10569-010 | 含 4.5 g/L D-葡萄糖 + 110 mg/L 丙酮酸钠 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | 来源：澳大利亚 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4458 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS），无钙、无镁 | Gibco | 14190-136 | |
| 台盼蓝染液，0.4% | Gibco | 15250 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | 脂质转染试剂 |
| Opti-MEM I（1x）低血清培养基 | Gibco | 31985-070 | 无血清培养基 |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 质粒 | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | 在哺乳动物细胞中表达 EGFP，由 CMVIE 启动子驱动。 |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | 在哺乳动物细胞中表达 DsRed-Express，由 CMVIE 启动子驱动。 |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | 以 DMSO 配制为 10 mM 储存液；工作浓度为 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | 以 DMSO 配制为 10 mM 储存液；工作浓度为 1 μM |
| 佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA） | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | 以 DMSO 配制为 100 μg/mL 储存液；工作浓度为 10 nM |
| 植物血凝素（PHA） | Remel | HA15/R30852701 | 以 PBS 配制为 1 μg/μL 储存液；工作浓度为 10 μg/mL |
| 伏立诺他（VOR） | Cayman Chemical | 10009929 | 以 DMSO 配制为 10 mM 储存液；工作浓度为 0.5 μM |
| 帕比司他（PAN） | TRC | P180500 | 以 DMSO 配制为 10 mM 储存液；工作浓度为 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒 | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | 支原体检测试剂盒，基于 PCR 方法 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 流式细胞术试剂 | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | 流式细胞仪（4 激光器：蓝色、红色、紫色和黄色） | |
| LSR II | BD Biosciences | 流式细胞仪（3 激光器：蓝色、红色和紫色） | |
| LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒 | Life Technologies | L34976 | 活力染料：适用于 633 或 635 nm 激发，共 400 次检测。试剂盒内含组分 A 和 B。 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| 甲醛溶液 37/10（37%） | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T 研究用微球 | BD Biosciences | 655050 | 校准微球 |
| Sphero 彩虹校准微粒（8 峰） | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| 鞘液 | Chem-Supply | SA046 | 10 L 水中含 90 g NaCl |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | 释放氯的消毒片剂 |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | 流式细胞仪专用浓缩清洗剂。工作液为 5% Decon 90。 |
| 次氯酸钠（12-13% 溶液） | Labco | SODHYPO-5L | 流式细胞仪专用浓缩清洗剂。工作液为 1% 漂白液。 |
| 7x | MPBio | IM76670 | 流式细胞仪专用浓缩清洗剂。工作液为 1% 7x。 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 材料 | |||
| 组织培养瓶（75 cm2，斜颈，带透气盖） | Corning | 430641U | |
| 组织培养板（96 孔平底，带盖） | Costar | 3599 | |
| 组织培养板（96 孔 V 形底，无盖） | Costar | 3896 | |
| 离心管（10 mL） | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| 离心管（50 mL） | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| 微量离心管（1.5 mL） | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| 血清移液管（25 mL），无菌 | Corning | CLS4489-200EA | |
| 血清移液管（10 mL），无菌 | Corning | CLS4488-200EA | |
| 血清移液管（5 mL），无菌 | Corning | CLS4487-200EA | |
| 试剂储液槽（50 mL），无菌 | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带滤网盖 | Corning | 352235 | 12 x 75 mm 规格，70 mm |
| 尼龙筛网 | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube 微量测试管，散装 | BIO-RAD | 2239391 | 微流式细胞管 |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，无盖 | Corning | 352008 | 12x75 mm 规格 |
| 12x75 mm 试管密封盖 | Corning | 352032 | |
| 计数室，改进型 Neubauer 双网格刻度，亮线（血球计数板，LO-Laboroptik） | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 个大格，每格 1 mm2；深度 0.100 mm；体积 0.1 mL；最小面积 0.0025 mm2 |
| 盖玻片（Menzel-Gläser） | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| 显微镜 | Nikon TMS | 310528 | |
| 5810R 冷冻离心机 | Eppendorf | 5811000487 | 配备 A-4-81 转子，含适用于 15/50 mL 锥形管的适配器 |
| FLUOstar Omega 微孔板读板仪 | BMG Labtech | N/A | 用于细胞增殖检测的微孔板读板仪。滤光片：490 nm。 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 软件 | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | 流式细胞仪数据采集与分析软件，版本 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | 流式细胞仪数据分析软件，FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar 多用户读板仪控制软件，版本 5.11 | |
| Omega - 数据分析 | BMG Labtech | MARS | FLUOstar 数据分析软件，版本 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | 版本 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | 版本 7.0c |
参考文献
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cur....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
