利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

摘要

将介绍一种先进的显微镜，该显微镜能够对分离的质膜及其周围的细胞内体积进行快速且高分辨率的成像。将转盘共聚焦显微技术与全内反射荧光显微技术集成于同一系统，可实现高达每3.5秒获取一幅图像堆栈的高速活细胞成像实验。

摘要

在活细胞中，黏附结构的形成等过程涉及细胞质膜和细胞内部的广泛结构变化。为了可视化这些高度动态的事件，结合了两种互补的光学显微技术，可实现对活体样本的快速成像：旋转盘显微镜（SD）用于快速、高分辨率的三维成像，全内反射荧光显微镜（TIRF）则用于细胞质膜的精确定位与可视化。本文将展示一套全面完整的成像操作流程，指导样本制备、显微镜校准、图像形成与采集，最终获得具有高时空分辨率的多色SD-TIRF活细胞成像序列。同时涵盖生成多维活体成像数据集所需的所有图像后期处理步骤， 即 个体通道的配准与合并通过自主编写的宏在开源软件 ImageJ 中实现。以黏附复合体启动和成熟过程中荧光蛋白的成像，以及肌动蛋白细胞骨架网络的形成作为该新方法的原理验证。高分辨率三维显微成像与全内反射荧光显微技术（TIRF）的结合，不仅在细胞环境中对这些复杂过程提供了详细的描述，同时实现了对膜相关分子的精确定位，并具有高信噪比。

引言

近年来，用于固定和活体样本的高分辨率/超分辨率光学显微技术发展迅速。受激辐射耗尽显微技术（STED）、结构光照明显微技术（SIM）以及光激活定位显微技术（PALM）或直接随机光学重建显微技术（STORM）等超分辨率成像方法已实现商业化，能够对亚细胞结构进行成像，呈现接近分子尺度的精细结构细节^1,2,3,4,5,6然而，这些方法在需要以每秒多帧的采集速度对大体积样本进行成像的活体成像实验中，应用仍然受限。多种由质膜调控的高度动态过程， 例如 胞吞/胞吐、黏附、迁移或信号传导等过程在较大的细胞体积内以高速发生。最近，为了弥补这一技术空白，提出了一种称为旋转盘-全内反射荧光（spinning disk-TIRF，SD-TIRF）的整合显微技术。⁷具体而言，TIRF显微镜能够特异性地分离并定位细胞质膜^8,9而SD显微镜是用于观察和追踪细胞质中亚细胞器的最灵敏且快速的活....

方案

1. 细胞的制备

1. 实验前两天，接种 3*10⁵ 6 孔细胞培养板中每孔加入 2 mL 完全生长培养基培养 HeLa 或 NIH3T3 细胞。本实验步骤全程须在超净工作台中操作。
2. 实验前一天，根据制造商的建议或经验确定的方案配制转染试剂， 例如:
   1. 将1 µg RFP-Lifeact和1 µg YFP-Vinculin溶于总共200 µL低血清培养基中。短暂涡旋震荡转染试剂，取4 µL加入200 µL上述溶液中 DNA并再次涡旋。将转染混合物在室温下孵育15-20分钟。
   2. 将全部转染混合物逐滴直接加入细胞中。轻轻摇动培养板混匀，然后放回培养箱。
3. 实验当天，准备样品用于活体成像：
   1. 在35 mm玻璃底培养皿的玻璃表面，用PBS配制10 µg/mL的纤连蛋白溶液进行包被。为获得最佳全内反射荧光（TIRF）成像效果，应仅使用高质量的0.17 mm玻璃盖玻片，并避免使用塑料底培养皿。将溶液在室温下孵育30分钟，随后吸除溶液，让培养皿自然风干。
   2. 将0.1 µm多荧光微球溶液稀释至密度为1.8 x 10⁹ 每毫升蒸馏水中加入颗粒，将溶液滴加至纤维连接蛋白包被的玻璃表面，作用30-60秒。立即吸去溶液，让培养皿自然风干。
      注意：仅当需要在接种细胞前确定TIRF成像平面和/或获取基于微珠....

结果

为了展示SD-TIRF成像的潜力，开发了一种检测方法，旨在揭示细胞-基质黏附复合物在细胞黏附过程中其与细胞骨架相互作用的时空组织特性。因此，将贴壁生长的HeLa细胞或NIH3T3细胞转染YFP-Vinculin和RFP-Lifeact 18–24小时，经胰蛋白酶消化后接种于纤维连接蛋白包被的玻璃底培养皿中。选择这些细胞系是因为其细胞骨架结构显著，且在活细胞成像实验中比原代细胞等更具稳定性；而原代细胞在胰蛋白酶处理后的敏感状态下可能无法耐受成像过程。在显微镜下挑选表达YFP/RFP的细胞，并在60分钟的时间序列中观察黏附过程图2 以及电影1和2）。该特定实验方法在文献中极少被提及，且描述尚不清晰。^17,18此外，粘连形成主要在 例如 迁移中的细胞^19,20因此，我们.......

讨论

本文首次展示了在适用于活细胞成像实验的配置中，成功实现散斑照明显微镜（SD）与全内反射荧光显微镜（TIRF）的结合应用。 即 以每分钟在3个不同载物台位置采集2组SD-TIRF图像堆栈的高速采集速率，共获取168帧图像（约每秒3帧）。此前已有少数研究报道过SD-TIRF显微镜^12,13，主要受限于成像速度不足，难以在三维细胞过程的动态观测中实现每图像堆栈小于2秒的时间分辨率。本研究所展示的系统可达到每秒0.78个图像堆栈的成像速率，并已在活体实验中针对三维囊泡动态的研究实现了每大图像堆栈3.5秒的成像速度⁷此外，以往的SD-TIRF显微镜每种成像模式仅配备一个探测器，进一步限制了多通道采集的速度。从技术上讲，这些系统可采用分光成像配置，从而实现单个相机同时进行双色采集。然而，这种方法仅能对一半视场进行成像。其他可生成高时空分辨率多维数据集的方法，如结合去卷积的宽场成像或三维超分辨率显微技术， 即 3D SIM 或晶格光片显微镜

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜及附件
SD-TIRF 显微镜	Visitron Systems
Ti 带完美聚焦系统	Nikon		倒置显微镜支架
CSU-W1 T2	Yokogawa		双相机配置的转盘共聚焦单元
iLAS2	Roper Scientific		TIRF/FRAP 扫描仪
Evolve	Photometrix		EM-CCD 相机
PiezoZ 载物台	Ludl Electronic Products		电动 Z 轴载物台
Bioprecision2 XY 载物台	Ludl Electronic Products		电动 XY 载物台
载物台顶部培养室	Okolab	Bold Line	温度、CO2 和湿度供给
细胞培养
HeLa 宫颈癌细胞	DSMZ	ACC-57
NIH3T3 成纤维细胞	DSMZ	ACC-59
杜氏磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	14190144
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300054
杜氏改良伊格尔培养基 + GlutaMAX-I (DMEM)	Gibco	31966-021
OptiMEM	Gibco	31985070	低血清培养基
胎牛血清 (FCS)	Gibco	10500064
青霉素/链霉素 (PenStrep)	Gibco	15140148
完全生长培养基 (DMEM 添加 10% FCS 和 1% PenStrep)
TurboFect	ThermoFisher Scientific	R0531	转染试剂
抗坏血酸 (AA)	Sigma	A544-25G
6 孔细胞培养板	Sarstedt	83.392
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-10-C	35 mm，0.17 mm 玻璃盖玻片
纤维连接蛋白，牛血浆来源	ThermoFisher Scientific	33010018
改进型 Neubauer 计数板	VWR	631-0696
TetraSpeck 微球	ThermoFisher Scientific	T7279
质粒
RFP-Lifeact			Maren Rudolph，德国汉堡埃彭多夫大学医学中心医学微生物学研究所
YFP-Vinculin			Andrea Mordhorst，德国汉堡埃彭多夫大学医学中心医学微生物学研究所
软件与插件
VisiView	Visitron Systems		版本 3
ImageJ			版本 1.52c
Turboreg 插件			http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
宏 "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"	本出版物		https://github.com/bzobiak/ImageJ
Volocity	PerkinElmer		版本 6.2.2