方法文章

利用先进的纺额圆盘全内反射荧光显微镜观察细胞粘附形成

DOI：

10.3791/58756

⸱

2019年1月21日

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

本文内容

摘要

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将提供一种先进的显微镜, 可对这两种情况、隔离的质膜和周围的细胞内体积进行快速和高分辨率的成像。将纺盘和总内部反射荧光显微镜集成到一个装置中, 可以在每个图像堆栈的高采集速率下进行实时成像实验。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在活细胞中, 粘附形成等过程涉及质膜和细胞内部的广泛结构变化。为了可视化这些高度动态的事件, 结合了两种互补的光显微镜技术, 可以快速成像实时样品: 旋转盘显微镜 (sd), 用于快速和高分辨率的体积记录和全面的内部反射荧光 (tirf) 显微镜, 用于精确定位和可视化质膜。将展示一个全面、完整的成像方案, 用于指导样品制备、显微镜校准、图像形成和采集, 从而形成具有高时空分辨率的多色 sd-tirf 实时成像系列。生成多维实时成像数据集所需的所有图像后处理步骤, 即各个通道的注册和组合,都在开源软件 imagej 的自写宏中提供。在粘附配合物的萌发和成熟过程中, 荧光蛋白的成像, 以及肌动蛋白细胞骨架网络的形成, 被用作这一新方法的原理证明。高分辨率三维显微镜和 tirf 的结合提供了对细胞环境中这些复杂过程的详细描述, 同时, 精确定位了与膜相关的分子。信噪比。

引言

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我们的时代, 光显微镜技术提供了高/超分辨率成像的固定和活的标本是迅速发展。超分辨率技术, 如受激发射耗尽 (sted)、结构化照明显微镜 (sim) 和光激活定位显微镜 (palm) 或直接随机光学重建显微镜 (storm), 分别是商业上可获得的, 并使成像的亚细胞结构显示的细节几乎在分子规模 1,2,3, 4, 5,6。然而, 这些方法在现场成像实验中的适用性仍然有限, 在现场成像实验中, 需要以每秒多个帧的采集速度对大容量进行可视化。通过质膜调节的高度动态过程的品种,如内/外渗、粘附、迁移或信号, 在大细胞内高速发生。最近, 为了填补这一空白, 提出了一种集成的显微镜技术, 称为旋转磁盘 tirf (sd-tirf)7。具体而言, tirf 显微镜允许专门分离和定位质膜8,9, 而 sd 显微镜是最敏感和快速的实时成像技术之一, 用于可视化和跟踪细胞质....

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方案

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1. 细胞的制备

  1. 实验前两天, 种子 3 * 105 h秒钟或 NIH3T3 细胞在2毫升的全生长培养基每口6井细胞培养板。确保在整个协议中, 细胞在层流引擎盖中处理。
  2. 在实验前一天, 根据制造商的建议或经验确定的协议准备转染试剂,例如:
    1. 在总共200μl 还原血清中稀释1微克的 rfp-生命和1μg 的 yfp-vinculin。短暂的转染试剂涡旋, 再向 200μl dna 中加入4μl 和涡旋。在室温下将转染混合物孵化15-20。
    2. 将整个转染混合直接滴入细胞。通过晃动盘子, 把它放回孵化器, 混合在一起。
  3. 在实验当天, 准备用于实时成像的样品:
    1. 在 pbs 中制备10μgml 纤维连接蛋白溶液, 以覆盖35毫米玻璃底盘的玻璃表面。只使用高品质 0.17 mm 的玻璃盖板, 以获得最佳的 tirf 性能, 避免塑料底盘。在室温下将溶液放在玻璃表面 30分钟, 然后取出, 让盘子风干。
    2. 将0.1μm 的多荧光珠溶液稀释到蒸馏水中每毫升1.8 x 10 9 粒粒子的密度, 并将该溶液添加到纤维镀膜玻璃表面30-60。立即取出溶液, 让盘子风干。
      注: 只有在播种单元格之前找到 tirf 平面和/或获取用于基于珠子的图像配准的2色参考图像时, 才需要执行此步骤。
    3. 制备 0.1 m 抗坏....

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结果

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为了显示 sd-tirf 成像的潜力, 我们开发了一种检测方法, 该方法应揭示细胞基质粘附物的时空组织及其在细胞粘附过程中与细胞骨架的相互作用。因此, 粘附的 hea 或 NIH3T3 细胞转染 yfp-vinculin 和 rfp-liveact 18-24, 胰蛋白酶化, 并播种到纤维镀膜玻璃底部的盘子。这些细胞系的选择是由于它们在实时成像实验中具有明显的细胞骨架和更高的鲁棒性, 而不是原代细胞。这些可能经不起成像在非常敏感的条件下, 因为他们是在胰蛋白酶治疗后。在显微镜下, 选择了 yfp/rfp 表达细胞, 并在60分钟的时间间隔内观察了粘附过程 (图 2和电影1和 2)。这个具体的分析很少和没有清楚地被描述在文学17,18。此外,在迁移细胞19、20 等.......

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讨论

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本文首次成功地实现了 sd 和 tirf 显微镜, 其配置适合进行活细胞成像实验,即3个不同阶段每分钟 2个 sd-tirf 图像堆栈的高采集率。位置, 相当于总共168帧 (约3帧/秒), 被收购。前面描述的少数 sd-tirf 显微镜, 主要是缺乏足够高的成像速度, 无法在3d 中跟踪细胞过程, 在3d 中, 每个图像堆栈的时间分辨率通常小于 2 s。该装置可实现高达0.78 图像堆栈每秒, 并在研究三维囊泡动力学的现场实验中证明了每个大图像堆栈的3.5秒的成像速率。此外, 以前的 sd-tirf 显微镜每个成像模式只有一个检测器, 进一步降低了多通道采集的速度。从技术上讲, 在这些系统中, 可以实现分视图配置, 也可以使用单个摄像机同时进行双色采集。然而, 这将只允许对一半的视野进行成像。其他用于生成具有高时空分辨率的多维数据集的方法, 如宽场成像与反卷积或3d 超分辨率显微镜相结合,即3d sim 或格子光片

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们非常感谢大学医学中心汉堡-埃彭多夫的科学界为我们提供样本评估。也就是说, 我们感谢 sabine windhorst 的 NIH3T3 细胞, 感谢 andrea mordhorst 的 yfp-vinculin 和 rfp-liffolact 的马伦·鲁道夫。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜及配件
SD-TIRF 显微镜Visitron Systems
Ti 带完美对焦系统尼康倒置显微镜支架
CSU-W1 T2横河电机双摄像头配置的转盘单元
iLAS2 Roper ScientificTIRF/FRAP 扫描仪
Evolve PhotometrixEM-CCD 相机
PiezoZ 载物台Ludl 电子产品电动 Z 载物台
Bioprecision2 XY 载物台Ludl 电子产品电动 XY 载物
台 载物台顶部培养室Okolab粗线温度、CO2 和湿度供应
细胞培养
HeLa 宫颈癌细胞DSMZACC-57
NIH3T3 成纤维细胞DSMZACC-59
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Gibco14190144
胰蛋白酶-EDTA 0.05%Gibco25300054
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 + GlutaMAX-I （DMEM）Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070减血清培养基
胎牛血清 （FCS）Gibco10500064
青霉素/链霉素 （PenStrep）Gibco15140148
全生长培养基（补充有 10% FCS 和 1% PenStrep 的 DMEM）
TurboFectThermoFisher ScientificR0531转染试剂
抗坏血酸 （AA）SigmaA544-25G
6 孔细胞培养板Sarstedt83.392
玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-10-C35 mm，0.17 mm 玻璃盖玻片
纤连蛋白、牛血浆ThermoFisher Scientific33010018
Neubauer 改进室VWR631-0696
TetraSpeck 微珠ThermoFisher ScientificT7279
质粒
RFP-LifeactMaren Rudolph，德国汉堡埃彭多夫大学医学中心医学微生物学研究所
YFP-VinculinAndrea Mordhorst，汉堡大学医学中心医学微生物学研究所Eppendorf， 德国
软件和插件
VisiViewVisitron Systems版本 3
ImageJ版本 1.52c
Turboreg 插件http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
宏 "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"此出版物https://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmer版本 6.2.2

参考文献

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  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Gustafsson, M. G. L.

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