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方法文章

利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

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DOI：

10.3791/58756

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2019年1月21日

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

本文内容

摘要

将介绍一种先进的显微镜，该显微镜能够对分离的质膜及其周围的细胞内体积进行快速且高分辨率的成像。将转盘共聚焦显微技术与全内反射荧光显微技术集成于同一系统，可实现高达每3.5秒获取一幅图像堆栈的高速活细胞成像实验。

摘要

在活细胞中，黏附结构的形成等过程涉及细胞质膜和细胞内部的广泛结构变化。为了可视化这些高度动态的事件，结合了两种互补的光学显微技术，可实现对活体样本的快速成像：旋转盘显微镜（SD）用于快速、高分辨率的三维成像，全内反射荧光显微镜（TIRF）则用于细胞质膜的精确定位与可视化。本文将展示一套全面完整的成像操作流程，指导样本制备、显微镜校准、图像形成与采集，最终获得具有高时空分辨率的多色SD-TIRF活细胞成像序列。同时涵盖生成多维活体成像数据集所需的所有图像后期处理步骤， 即 个体通道的配准与合并通过自主编写的宏在开源软件 ImageJ 中实现。以黏附复合体启动和成熟过程中荧光蛋白的成像，以及肌动蛋白细胞骨架网络的形成作为该新方法的原理验证。高分辨率三维显微成像与全内反射荧光显微技术（TIRF）的结合，不仅在细胞环境中对这些复杂过程提供了详细的描述，同时实现了对膜相关分子的精确定位，并具有高信噪比。

引言

近年来，用于固定和活体样本的高分辨率/超分辨率光学显微技术发展迅速。受激辐射耗尽显微技术（STED）、结构光照明显微技术（SIM）以及光激活定位显微技术（PALM）或直接随机光学重建显微技术（STORM）等超分辨率成像方法已实现商业化，能够对亚细胞结构进行成像，呈现接近分子尺度的精细结构细节1,2,3,4,5,6然而，这些方法在需要以每秒多帧的采集速度对大体积样本进行成像的活体成像实验中，应用仍然受限。多种由质膜调控的高度动态过程， 例如 胞吞/胞吐、黏附、迁移或信号传导等过程在较大的细胞体积内以高速发生。最近，为了弥补这一技术空白，提出了一种称为旋转盘-全内反射荧光（spinning disk-TIRF，SD-TIRF）的整合显微技术。7具体而言，TIRF显微镜能够特异性地分离并定位细胞质膜8,9而SD显微镜是用于观察和追踪细胞质中亚细胞器的最灵敏且快速的活体成像技术之一10,11将两种成像技术结合于同一实验装置中的方法此前已有实现12,13然而，本文所展示的显微镜（图1）最终满足了以每秒3帧的速度对上述过程进行活细胞成像SD-TIRF实验的要求。由于该显微镜为 commercially available，本论文的目标是详细描述与SD-TIRF显微镜相关的图像采集、配准和可视化方法，并提供开源工具和实验方案。

该系统基于一台倒置显微镜，通过独立端口连接两个扫描单元——左侧端口连接SD单元，后端端口连接用于TIRF及光激活/光漂白实验的扫描单元。最多可使用6种激光器（405/445/488/515/561/640 nm）进行激发。激发和荧光信号检测分别采用100倍/NA1.45油镜或60倍/NA1.49油镜TIRF物镜。发射光经由二向色镜（561 nm长通或514 nm长通）分光，并通过置于两个EM-CCD相机前的不同带通滤光片（绿色荧光为525 nm中心波长、带宽55 nm，红色荧光为609 nm中心波长、带宽54 nm）进行过滤。请注意，有关该系统的更多技术细节见Zobiak et al.7。在TIRF配置下，SD单元可在约0.5秒内移出光路，从而可使用相同的两个相机进行信号检测，相较于过去报道的约1秒切换时间，显著加快了两种成像模式之间的切换速度13。该功能支持双通道同步采集，因此可实现前所未有的速度与精度下的四通道SD-TIRF成像。此外，无需对SD与TIRF图像进行对齐。然而，两个相机之间的图像对齐必须在实验开始前检查，并在必要时进行校正。在以下实验方案中，已通过自主编写的ImageJ宏实现了一套图像配准校正程序。该宏主要设计用于在SD与TIRF数据集具有不同维度的情况下仍能实现同步可视化。成像软件本身并不具备这些功能。

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方案

1. 细胞的制备

  1. 实验前两天，接种 3*105 6 孔细胞培养板中每孔加入 2 mL 完全生长培养基培养 HeLa 或 NIH3T3 细胞。本实验步骤全程须在超净工作台中操作。
  2. 实验前一天，根据制造商的建议或经验确定的方案配制转染试剂， 例如:
    1. 将1 µg RFP-Lifeact和1 µg YFP-Vinculin溶于总共200 µL低血清培养基中。短暂涡旋震荡转染试剂，取4 µL加入200 µL上述溶液中 DNA并再次涡旋。将转染混合物在室温下孵育15-20分钟。
    2. 将全部转染混合物逐滴直接加入细胞中。轻轻摇动培养板混匀，然后放回培养箱。
  3. 实验当天，准备样品用于活体成像：
    1. 在35 mm玻璃底培养皿的玻璃表面，用PBS配制10 µg/mL的纤连蛋白溶液进行包被。为获得最佳全内反射荧光（TIRF）成像效果，应仅使用高质量的0.17 mm玻璃盖玻片，并避免使用塑料底培养皿。将溶液在室温下孵育30分钟，随后吸除溶液，让培养皿自然风干。
    2. 将0.1 µm多荧光微球溶液稀释至密度为1.8 x 109 每毫升蒸馏水中加入颗粒，将溶液滴加至纤维连接蛋白包被的玻璃表面，作用30-60秒。立即吸去溶液，让培养皿自然风干。
      注意：仅当需要在接种细胞前确定TIRF成像平面和/或获取基于微珠的双色参考图像以进行图像配准时，此步骤才为必要。
    3. 配制 0.1 M 的抗坏血酸（AA）溶液，并用培养基稀释至终浓度为 0.1 mM（AA-培养基）。将溶液置于 37 °C 水浴中。
      注意：尽可能使用适用于荧光成像的细胞培养基，例如无酚红且（核黄素）黄素含量降低的培养基。抗坏血酸（AA）是一种抗氧化剂，可减少活细胞成像过程中的光毒性效应14我们已在此项检测中成功验证了其效果， 即 添加AA的条件下，更多细胞呈现健康状态，但培养基的pH值降低了0.17个单位。
    4. 用 2 mL PBS 清洗细胞，加入 250 µL 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 培养箱中孵育 2–3 分钟，直至细胞完全脱落。用移液器将细胞轻轻重悬于 1 mL 预热的 AA 培养基中，并转移至含 4 mL AA 培养基的 15 mL 细胞培养管内。将细胞悬液置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中，管盖稍松以保证通气。2 显微镜附近
    5. 向玻璃底培养皿中加入1 mL预热的AA培养基，并将其放入预热显微镜的载物台 holder 中（见下一段）。

2. 活体成像

  1. 启动显微镜的环境控制系统，以达到稳定的 37 °C、5% CO2 和湿润的环境。
    注意：此处使用了一个小型台顶式培养箱，可在约 15 分钟内实现稳定设置。较大的培养箱需要更长时间才能达到稳定条件。
  2. 在加入细胞悬液前，预先固定显微镜的所有采集参数：
    1. 将时间间隔设为 30 秒，持续时间为 60–90 分钟。激活基于硬件的自动对焦功能，使其在每个时间点均运行（数值设为“1”）。
    2. 调整每个通道的相机曝光时间与增益，以及激光功率。建议采用高增益、低曝光时间和低激光功率，以减少光毒性。
      注意：本文所展示的数据采集参数为 200 毫秒曝光时间、增益水平 500 和 20% 激光功率，分别对应 488 nm 激发强度 0.5 W/cm² 和 561 nm 激发强度 1 W/cm²。
    3. 将转盘共聚焦通道的 z 轴扫描范围设为 10 µm，步进间距为 0.4 µm。关闭全内反射荧光（TIRF）通道的 z 轴扫描。将底部偏移设为“0”，即 最低平面为硬件自动对焦的焦点位置。
    4. 激活多点采集功能“stage positions”。
      注意：在 30 秒时间间隔内最多可记录 3 个位置。
  3. 通过落射荧光照明在目镜或计算机屏幕上找到荧光微珠，然后激活一个 TIRF 通道，并将照明角度调整至实现全内反射照明的数值。按下显微镜控制面板上的按钮启动自动对焦，并使用偏移调节轮调整焦点。采集一个双色数据集，即 TIRF-488 和 TIRF-561，用于后续基于微珠的图像配准（见第 3.1 步）。
    1. 可选：为确认 TIRF 照明效果，可加入几微升自由悬浮的多色荧光微珠悬液（见第 1.3.2 步）。激活 TIRF 通道的实时成像并逐步增加照明角度。非黏附性微珠在超过临界角后将消失，从而验证 TIRF 照明的正确性8。
  4. 通过将封闭的离心管上下颠倒 2–3 次重新混匀细胞悬液，然后向成像培养皿中加入 1 mL 细胞悬液。
  5. 使用低强度落射荧光照明快速找到双转染细胞，利用明场照明在实时相机预览中将细胞居中，并标记该位置。再寻找另外 1–2 个感兴趣的区域，并将其保存至位置列表中。
    注意：实验初期，细胞可能因载物台移动而容易脱落，因此建议先设置 4–5 个位置，并在开始图像采集前重新检查所有位置，之后舍弃其中 1–2 个。
  6. 点击“Sequence”按钮开始数据采集。

3. 在 ImageJ 中进行图像后期处理

  1. 为了在 FIJI 中生成无需配准的超堆叠图像15，已编写一个名为“SD-TIRF_helper”的宏，可用于处理 2 至 4 通道的 SD-TIRF 时间序列数据集。将文件“SD-TIRF_helper_JoVE.ijm”保存至 FIJI 的子文件夹“macros”中，并通过点击菜单命令“Plugins>Macros>Run…”来运行该宏。
    1. 如果颜色通道需要进行配准校正，请选择相应选项，并创建一个新的基于荧光小球的配准参考（标记点文件），或使用先前创建的已有文件。
      注意：Turboreg 插件16将应用于荧光小球参考图像。请根据插件安装的一般指南，在 FIJI 软件中安装该插件。
    2. 使用 Bio-Formats 导入器导入数据，并选择“超堆叠”作为查看模式。加载图像数据集时，首先选择 SD 序列，然后选择 TIRF 序列。FIJI 将按通道和载物台位置对数据进行排序显示，i.e. 通常情况下，每个选定的载物台位置都会显示一个包含所有 SD 通道和所有 TIRF 通道的超堆叠图像。
      注意：数据可从多种文件类型导入，例如 TIFF 序列或平台相关文件类型（如 *.nd）。仅当文件未由采集软件导出为独立、无压缩的 TIFF 格式时，文件类型才无法被识别。
    3. 通过加载预先确定的标记点文件，对相应通道应用配准校正。
    4. 为每个 SD 和 TIRF 通道选择所需的色彩查找表（LUT），并将它们合并为一个单一的多维超堆叠图像。
      注意：在处理 TIRF 通道过程中，会在与 SD 数据集 z 平面数相匹配的底部平面上方，添加若干个强度值为零的 z 平面。此步骤对于最终超堆叠图像的可视化至关重要。该方法是合理的，因为 TIRF 照明的穿透深度（小于 200 nm7）小于 SD 堆叠的 z 步长（400 nm）。

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结果

为了展示SD-TIRF成像的潜力，开发了一种检测方法，旨在揭示细胞-基质黏附复合物在细胞黏附过程中其与细胞骨架相互作用的时空组织特性。因此，将贴壁生长的HeLa细胞或NIH3T3细胞转染YFP-Vinculin和RFP-Lifeact 18–24小时，经胰蛋白酶消化后接种于纤维连接蛋白包被的玻璃底培养皿中。选择这些细胞系是因为其细胞骨架结构显著，且在活细胞成像实验中比原代细胞等更具稳定性；而原代细胞在胰蛋白酶处理后的敏感状态下可能无法耐受成像过程。在显微镜下挑选表达YFP/RFP的细胞，并在60分钟的时间序列中观察黏附过程图2 以及电影1和2）。该特定实验方法在文献中极少被提及，且描述尚不清晰。17,18此外，粘连形成主要在 例如 迁移中的细胞19,20因此，我们...

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讨论

本文首次展示了在适用于活细胞成像实验的配置中，成功实现散斑照明显微镜（SD）与全内反射荧光显微镜（TIRF）的结合应用。 即 以每分钟在3个不同载物台位置采集2组SD-TIRF图像堆栈的高速采集速率，共获取168帧图像（约每秒3帧）。此前已有少数研究报道过SD-TIRF显微镜12,13，主要受限于成像速度不足，难以在三维细胞过程的动态观测中实现每图像堆栈小于2秒的时间分辨率。本研究所展示的系统可达到每秒0.78个图像堆栈的成像速率，并已在活体实验中针对三维囊泡动态的研究实现了每大图像堆栈3.5秒的成像速度7此外，以往的SD-TIRF显微镜每种成像模式仅配备一个探测器，进一步限制了多通道采集的速度。从技术上讲，这些系统可采用分光成像配置，从而实现单个相机同时进行双色采集。然而，这种方法仅能对一半视场进行成像。其他可生成高时空分辨率多维数据集的方法，如结合去卷积的宽场成像或三维超分辨率显微技术， 即 3D SIM 或晶格光片显微镜

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢汉堡埃彭多夫大学医学中心的科研人员为我们提供用于评估的样品。特别感谢Sabine Windhorst提供NIH3T3细胞，Andrea Mordhorst提供YFP-Vinculin，以及Maren Rudolph提供RFP-Lifeact。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜及附件
SD-TIRF 显微镜Visitron Systems
Ti 带完美聚焦系统Nikon倒置显微镜支架
CSU-W1 T2Yokogawa双相机配置的转盘共聚焦单元
iLAS2 Roper ScientificTIRF/FRAP 扫描仪
Evolve PhotometrixEM-CCD 相机
PiezoZ 载物台Ludl Electronic Products电动 Z 轴载物台
Bioprecision2 XY 载物台Ludl Electronic Products电动 XY 载物台
载物台顶部培养室OkolabBold Line温度、CO2 和湿度供给
细胞培养
HeLa 宫颈癌细胞DSMZACC-57
NIH3T3 成纤维细胞DSMZACC-59
杜氏磷酸盐缓冲液 (PBS)Gibco14190144
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco25300054
杜氏改良伊格尔培养基 + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070低血清培养基
胎牛血清 (FCS)Gibco10500064
青霉素/链霉素 (PenStrep)Gibco15140148
完全生长培养基 (DMEM 添加 10% FCS 和 1% PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531转染试剂
抗坏血酸 (AA)SigmaA544-25G
6 孔细胞培养板Sarstedt83.392
玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-10-C35 mm，0.17 mm 玻璃盖玻片
纤维连接蛋白，牛血浆来源ThermoFisher Scientific33010018
改进型 Neubauer 计数板VWR631-0696
TetraSpeck 微球ThermoFisher ScientificT7279
质粒
RFP-LifeactMaren Rudolph，德国汉堡埃彭多夫大学医学中心医学微生物学研究所
YFP-VinculinAndrea Mordhorst，德国汉堡埃彭多夫大学医学中心医学微生物学研究所
软件与插件
VisiViewVisitron Systems版本 3
ImageJ版本 1.52c
Turboreg 插件http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
宏 "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"本出版物https://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmer版本 6.2.2

参考文献

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