方法文章

利用先进的纺额圆盘全内反射荧光显微镜观察细胞粘附形成

DOI：

10.3791/58756

⸱

2019年1月21日

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将提供一种先进的显微镜, 可对这两种情况、隔离的质膜和周围的细胞内体积进行快速和高分辨率的成像。将纺盘和总内部反射荧光显微镜集成到一个装置中, 可以在每个图像堆栈的高采集速率下进行实时成像实验。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在活细胞中, 粘附形成等过程涉及质膜和细胞内部的广泛结构变化。为了可视化这些高度动态的事件, 结合了两种互补的光显微镜技术, 可以快速成像实时样品: 旋转盘显微镜 (sd), 用于快速和高分辨率的体积记录和全面的内部反射荧光 (tirf) 显微镜, 用于精确定位和可视化质膜。将展示一个全面、完整的成像方案, 用于指导样品制备、显微镜校准、图像形成和采集, 从而形成具有高时空分辨率的多色 sd-tirf 实时成像系列。生成多维实时成像数据集所需的所有图像后处理步骤, 即各个通道的注册和组合,都在开源软件 imagej 的自写宏中提供。在粘附配合物的萌发和成熟过程中, 荧光蛋白的成像, 以及肌动蛋白细胞骨架网络的形成, 被用作这一新方法的原理证明。高分辨率三维显微镜和 tirf 的结合提供了对细胞环境中这些复杂过程的详细描述, 同时, 精确定位了与膜相关的分子。信噪比。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们的时代, 光显微镜技术提供了高/超分辨率成像的固定和活的标本是迅速发展。超分辨率技术, 如受激发射耗尽 (sted)、结构化照明显微镜 (sim) 和光激活定位显微镜 (palm) 或直接随机光学重建显微镜 (storm), 分别是商业上可获得的, 并使成像的亚细胞结构显示的细节几乎在分子规模 1,2,3, 4, 5,6。然而, 这些方法在现场成像实验中的适用性仍然有限, 在现场成像实验中, 需要以每秒多个帧的采集速度对大容量进行可视化。通过质膜调节的高度动态过程的品种,如内/外渗、粘附、迁移或信号, 在大细胞内高速发生。最近, 为了填补这一空白, 提出了一种集成的显微镜技术, 称为旋转磁盘 tirf (sd-tirf)7。具体而言, tirf 显微镜允许专门分离和定位质膜8,9, 而 sd 显微镜是最敏感和快速的实时成像技术之一, 用于可视化和跟踪细胞质中的亚细胞细胞器10,11。在过去的 12,13, 这两种成像技术的组合已经实现, 然而, 这里介绍的显微镜 (图 1) 终于符合执行实时成像 sd-tirf 实验的标准以每秒3帧的速度完成上述过程。由于这种显微镜是商业上可用的, 这份手稿的目标是详细描述, 并提供开源工具和协议的图像采集, 注册, 和可视化与 sd-tirf 显微镜。

该设置基于通过独立端口连接到两个扫描单元的倒置显微镜--左端口连接到 sd 单元, 后端口连接到 tirf 和光激活漂白实验的扫描仪单元。可用于激发的激光器 (40\ 445/488/48\ 56n--)。对于荧光信号的激发和检测, 分别采用了 100 xn1.45 油或60xéna1.49 油 tirf 目标。发射的光由双色反射镜 (561 纳米长通或561纳米长通) 分割, 并由放置在两个 em-ccd 凸轮前的各种带通滤波器 (55 纳米宽, 中心在561纳米, 54 纳米宽分别以609纳米为中心, 用于绿色和红色荧光)时代。请注意, zobiak 等人列出了有关设置的更多技术细节.7. 在 tirf 配置中, sd 单元在大约0.5 秒内移出光路, 以便可以使用相同的两个摄像机进行检测, 从而与过去13报告的大约1秒相比, 可以在两种成像模式之间更快地切换./c2 >。此功能可实现双通道同步采集, 因此可以以以前无与伦比的速度和精度执行4个通道 sd-tirf 成像。此外, sd 和 tirf 图像之间的对齐是不必要的。但是, 在开始实验之前, 必须检查两个摄像机之间的图像对齐情况, 并在必要时进行更正。在下面的协议中, 在自写 imagej 宏中实现了注册更正例程。此外, 该宏的主要目的是允许同时显示 sd 和 tirf 数据集, 尽管它们的维度不同。采集软件本身并没有提供这些功能。

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方案

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1. 细胞的制备

  1. 实验前两天, 种子 3 * 105 h秒钟或 NIH3T3 细胞在2毫升的全生长培养基每口6井细胞培养板。确保在整个协议中, 细胞在层流引擎盖中处理。
  2. 在实验前一天, 根据制造商的建议或经验确定的协议准备转染试剂,例如:
    1. 在总共200μl 还原血清中稀释1微克的 rfp-生命和1μg 的 yfp-vinculin。短暂的转染试剂涡旋, 再向 200μl dna 中加入4μl 和涡旋。在室温下将转染混合物孵化15-20。
    2. 将整个转染混合直接滴入细胞。通过晃动盘子, 把它放回孵化器, 混合在一起。
  3. 在实验当天, 准备用于实时成像的样品:
    1. 在 pbs 中制备10μgml 纤维连接蛋白溶液, 以覆盖35毫米玻璃底盘的玻璃表面。只使用高品质 0.17 mm 的玻璃盖板, 以获得最佳的 tirf 性能, 避免塑料底盘。在室温下将溶液放在玻璃表面 30分钟, 然后取出, 让盘子风干。
    2. 将0.1μm 的多荧光珠溶液稀释到蒸馏水中每毫升1.8 x 10 9 粒粒子的密度, 并将该溶液添加到纤维镀膜玻璃表面30-60。立即取出溶液, 让盘子风干。
      注: 只有在播种单元格之前找到 tirf 平面和/或获取用于基于珠子的图像配准的2色参考图像时, 才需要执行此步骤。
    3. 制备 0.1 m 抗坏血酸 (aa) 溶液, 并将其稀释到生长介质 (aa-介质) 中的最终浓度 0.1 mm。将溶液放在37°c 的水浴中。
      注: 如有可能, 请使用荧光优化的细胞培养基, 如无酚类和 (核子) 减少黄酮的培养基。aa 是一种抗氧化剂, 可在实时成像14中减少光毒性效应。我们已经成功地在这个测试中测试它,即更多的细胞出现健康条件下应用比没有 aa 添加。然而, 该介质的 ph 值降低了 0.17 ph 单位。
    4. 用2毫升 pbs 清洗细胞, 加入250μl 胰蛋白酶-edta, 等待细胞完全分离 (37°c 孵化器中 2-3分钟)。用移液器在1毫升预热的 aa 介质中仔细地将细胞重新移植, 并将其添加到 15 ml 细胞培养管中的 4 ml aa 培养基中。将细胞悬浮液与稍微打开的盖子放在孵化器设置为37°c 和 5% co2 在显微镜附近。
    5. 在玻璃底盘中加入1毫升预热的 aa 介质, 并将其放置在预热显微镜的支架中 (见下一段)。

2. 实时成像

  1. 启动显微镜的环境控制, 达到稳定的37°c、5% 的二氧化碳和潮湿的大气。
    注: 在这里, 使用了一个小的舞台顶部孵化器, 允许在大约15分钟内稳定设置. 较大的孵化器将需要更多的时间来实现稳定的条件。
  2. 在应用细胞悬浮液之前, 请在显微镜下修复所有采集设置:
    1. 将时间间隔设置为 30秒, 将持续时间设置为 60-90分钟, 激活每个时间点 (值 "1") 的基于硬件的自动对焦功能。
    2. 调整相机曝光和增益, 以及每个通道的激光功率。高增益水平、低曝光时间和低激光功率可减少光毒性。
      注: 此处提供的数据是通过200毫秒曝光、增益级别500和20% 的激光功率获得的, 该功率等于488纳米的激发强度 0.5 w/cm²和561纳米的 1 wcm²。
    3. 将纺盘通道的 z 堆栈设置为 10μm, 间距为0.4μm。tirf 通道的停用 z 堆栈。将底部偏移量设置为 "0",即最低平面将是硬件自动对焦的焦点位置。
    4. 激活多点功能 "舞台位置"。
      注: 在30秒的时间间隔内最多可以记录3个位置。
  3. 在眼睛或计算机屏幕上找到带有 epi-fluorescent 照明的荧光灯珠, 然后激活一个 tirf 通道, 并将照明角度设置为表示 tirf 照明的值。通过按下显微镜面板上的按钮激活自动对焦, 并使用偏移轮调整对焦。获取2色数据集,即tirf-488 和 tirf-561, 用于后续基于珠子的图像配准 (见 point 3.1)。
    1. 可选: 为确保 tirf 照明, 添加一些自由浮动的荧光多色珠悬浮液 (见点 1.3.2)。激活 tirf 通道的实时视图并增加照明角度。非粘附磁珠将消失在临界角度之外, 确保正确的 tirf 照明8。
  4. 通过将封闭的管反转2-3 次, 再次将细胞悬浮液混合在一起, 并将1毫升的细胞应用到成像盘中。
  5. 快速找到具有低电平波-荧光照明的双转染细胞。使用明亮的字段照明将实时相机预览中的单元格居中, 并标记位置。再找1-2 点兴趣, 并将其保存到仓位列表中。
    注: 在开始时, 细胞可以很容易地分离由于阶段运动, 从而设置4-5 个位置, 并重新检查所有之前开始图像采集。随后, 丢弃1-2 个位置。
  6. 点击 "序列" 按钮开始数据采集。

3. 图像中的图像后处理 j

  1. 为了在 fiji15中生成一个无注册的超堆栈, 编写了一个名为 "sd-tirf _ 帮助器" 的宏, 该宏可应用于2-4 通道 sd-tirf 时间数据集。将文件 "sd-tirf _ 联接 _ jove. ijm" 保存在 fiji 子文件夹 "宏" 中, 然后通过单击菜单命令 "插件 > 的宏 > 运行..." 来运行宏。
    1. 如果颜色通道需要更正, 请选择该选项并创建新的基于珠子的注册引用 (地标文件), 或使用之前创建的现有文件。
      注: 涡轮增压插件16将应用于荧光珠子参考图像。根据插件安装的一般指南, 在 fiji 软件中安装插件。
    2. 使用生物格式导入程序导入数据, 并选择超堆栈作为查看选项。加载图像数据集, 在第一步中选择 sd 系列, 在第二步中选择 tirf 系列。fiji 将显示按通道和阶段位置排序的数据,即通常所有 sd 通道和所有 tir 通道都显示为已选择的每个阶段位置的一个超堆栈。
      注: 可以从各种文件类型导入数据, 例如 tiff 系列或与平台相关的文件类型, 如 *. nd。只有当采集软件未将文件类型导出为独立的、无压缩的 tiff 格式时, 才能识别该文件类型。
    3. 通过加载预先确定的地标文件, 将注册更正应用于相应的通道。
    4. 为每个 sd 和 tirf 通道选择所需的颜色查找表 (lut), 并将它们合并到一个多维超堆栈中。
      注: 在处理 tirf 通道的过程中, 在底部平面的顶部添加了一些具有零强度值的 z 平面, 这些 z 平面与 sd 数据集中的 z 平面数相匹配。此步骤对于最终超堆栈的可视化非常重要。这种方法是正确的, 因为 tirf 照明的深度 (小于 200nm7) 小于 sd 堆栈的 z 步长 (400 nm)。

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结果

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为了显示 sd-tirf 成像的潜力, 我们开发了一种检测方法, 该方法应揭示细胞基质粘附物的时空组织及其在细胞粘附过程中与细胞骨架的相互作用。因此, 粘附的 hea 或 NIH3T3 细胞转染 yfp-vinculin 和 rfp-liveact 18-24, 胰蛋白酶化, 并播种到纤维镀膜玻璃底部的盘子。这些细胞系的选择是由于它们在实时成像实验中具有明显的细胞骨架和更高的鲁棒性, 而不是原代细胞。这些可能经不起成像在非常敏感的条件下, 因为他们是在胰蛋白酶治疗后。在显微镜下, 选择了 yfp/rfp 表达细胞, 并在60分钟的时间间隔内观察了粘附过程 (图 2和电影1和 2)。这个具体的分析很少和没有清楚地被描述在文学17,18。此外,在迁移细胞19、20 等...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文首次成功地实现了 sd 和 tirf 显微镜, 其配置适合进行活细胞成像实验,即3个不同阶段每分钟 2个 sd-tirf 图像堆栈的高采集率。位置, 相当于总共168帧 (约3帧/秒), 被收购。前面描述的少数 sd-tirf 显微镜, 主要是缺乏足够高的成像速度, 无法在3d 中跟踪细胞过程, 在3d 中, 每个图像堆栈的时间分辨率通常小于 2 s。该装置可实现高达0.78 图像堆栈每秒, 并在研究三维囊泡动力学的现场实验中证明了每个大图像堆栈的3.5秒的成像速率。此外, 以前的 sd-tirf 显微镜每个成像模式只有一个检测器, 进一步降低了多通道采集的速度。从技术上讲, 在这些系统中, 可以实现分视图配置, 也可以使用单个摄像机同时进行双色采集。然而, 这将只允许对一半的视野进行成像。其他用于生成具有高时空分辨率的多维数据集的方法, 如宽场成像与反卷积或3d 超分辨率显微镜相结合,即3d sim 或格子光片

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们非常感谢大学医学中心汉堡-埃彭多夫的科学界为我们提供样本评估。也就是说, 我们感谢 sabine windhorst 的 NIH3T3 细胞, 感谢 andrea mordhorst 的 yfp-vinculin 和 rfp-liffolact 的马伦·鲁道夫。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜及配件
SD-TIRF 显微镜Visitron Systems
Ti 带完美对焦系统尼康倒置显微镜支架
CSU-W1 T2横河电机双摄像头配置的转盘单元
iLAS2 Roper ScientificTIRF/FRAP 扫描仪
Evolve PhotometrixEM-CCD 相机
PiezoZ 载物台Ludl 电子产品电动 Z 载物台
Bioprecision2 XY 载物台Ludl 电子产品电动 XY 载物
台 载物台顶部培养室Okolab粗线温度、CO2 和湿度供应
细胞培养
HeLa 宫颈癌细胞DSMZACC-57
NIH3T3 成纤维细胞DSMZACC-59
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Gibco14190144
胰蛋白酶-EDTA 0.05%Gibco25300054
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 + GlutaMAX-I （DMEM）Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070减血清培养基
胎牛血清 （FCS）Gibco10500064
青霉素/链霉素 （PenStrep）Gibco15140148
全生长培养基（补充有 10% FCS 和 1% PenStrep 的 DMEM）
TurboFectThermoFisher ScientificR0531转染试剂
抗坏血酸 （AA）SigmaA544-25G
6 孔细胞培养板Sarstedt83.392
玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-10-C35 mm，0.17 mm 玻璃盖玻片
纤连蛋白、牛血浆ThermoFisher Scientific33010018
Neubauer 改进室VWR631-0696
TetraSpeck 微珠ThermoFisher ScientificT7279
质粒
RFP-LifeactMaren Rudolph，德国汉堡埃彭多夫大学医学中心医学微生物学研究所
YFP-VinculinAndrea Mordhorst，汉堡大学医学中心医学微生物学研究所Eppendorf， 德国
软件和插件
VisiViewVisitron Systems版本 3
ImageJ版本 1.52c
Turboreg 插件http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
宏 "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"此出版物https://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmer版本 6.2.2

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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