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用于在聚合物纳米颗粒中包载疏水性和亲水性化合物的闪速纳米沉淀法

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DOI：

10.3791/58757

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2019年1月7日

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1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

本文内容

摘要

闪速纳米沉淀法（FNP）是一种可放大的制备聚合物核-壳纳米颗粒的方法。本文描述了用于包载疏水性或亲水性治疗药物的实验室规模配方。

摘要

将治疗性化合物制备成纳米颗粒（NPs）可赋予其独特的性质。对于水溶性差的药物，纳米颗粒制剂可提高其生物利用度，并改变药物在体内的分布。对于肽类或蛋白质等亲水性药物，包封于纳米颗粒中还可使其免受体内自然清除机制的降解。目前可用于制备可规模化生产的聚合物纳米颗粒的技术较少。闪速纳米沉淀法（FNP）是一种利用工程化混合结构来制备纳米颗粒的技术，所得颗粒具有较窄的粒径分布，并可在30至400 nm范围内调节粒径。本实验方案详细说明了在实验室规模下，利用FNP技术制备目标粒径的核-壳结构聚合物纳米颗粒的方法。该方案只需稍作修改，即可用于包封亲水性或疏水性化合物。该技术可在实验室中以毫克级规模进行制剂筛选，筛选出的优选配方可直接放大至克级甚至千克级。作为一种连续化工艺，放大过程仅需延长混合过程的运行时间，而无需更换新的反应容器。通过FNP制备的纳米颗粒具有高载药量、致密的稳定聚合物刷结构，且粒径重现性可达±6%。

引言

自20世纪90年代末以来，采用纳米材料的临床试验数量稳步增加1,2。这一增长趋势反映了纳米材料在提高疏水性药物生物利用度以及实现体内靶向递送方面的巨大潜力3。聚合物纳米颗粒（本文中简称纳米颗粒或NPs）在这一类材料中所占比例日益增加2。纳米颗粒备受关注，因其具有高度可调控的特性，如粒径、组成和表面功能化4。在用于难溶性药物递送时，纳米颗粒通常具有核-壳结构，其中治疗药物被包封于疏水性内核，而外壳则由亲水性聚合物刷构成。一种简单的构建方法是使用两亲性二嵌段共聚物（BCP），该共聚物包含一个可降解的疏水嵌段（构成颗粒内核的一部分）和一个亲水性聚乙二醇（PEG）嵌段（形成聚合物刷并提供空间稳定性）4,5。

纳米沉淀法是一种常见的聚合物纳米颗粒制备技术，因其操作简单且能耗较低而被广泛应用6。在最简单的形式中，该方法通过移液将含有纳米颗粒组分的有机溶剂（如丙酮）加入到大量搅拌的水中。当溶剂环境转变为稀释的水相时，不溶性核心组分随即发生沉淀。稳定剂则通过疏水链段的吸附作用，在不断生长的颗粒表面自组装成结构7,8,9,10。当有机溶剂与水快速混合形成均一溶液时，可获得粒径分布均匀的纳米颗粒。若混合速度慢于组分的成核与自组装过程，则会导致颗粒尺寸更大且多分散性更高。尽管传统的搅拌批量法易于进行初步测试，但由于混合不一致，所得结果变异较大，且难以实现放大生产6,11。微流控技术作为另一种纳米颗粒制备途径，可实现连续化生产，该生产方式最近已被Ding et al.11。 所综述。一种常用的方法是利用层流聚焦，将溶剂的特征长度缩小至亚微米级别。反溶剂的混合依赖于扩散作用，因此微小的流道尺寸对于获得均一颗粒至关重要11,12。然而，为实现规模化生产而并行多个微流控腔室时，在大体积生产方面仍存在实际困难。

有利于微流控中均匀纳米沉淀的快速混合条件，也可在受限的湍流流动中实现。闪速纳米沉淀法（Flash NanoPrecipitation, FNP）采用特殊的混合几何结构，可在比微流控更高的体积流速下实现此类条件。在湍流条件下，进样流体进入混合腔室，产生涡旋，从而使溶剂与反溶剂的层状结构在扩散长度尺度上形成11,13。因此，可在短于治疗剂成核与生长的时间尺度内实现均匀混合。混合器的受限几何结构可防止流体绕过湍流能量耗散区域，使整个系统经历相同的工艺历程13。成核在混合腔室内均匀发生，颗粒生长持续进行，直至嵌段共聚物（BCP）在颗粒表面组装而终止生长9,14。随后，含有稳定颗粒的混合流可进一步用额外的反溶剂稀释，以抑制颗粒的奥斯特瓦尔德熟化（Ostwald ripening）15,16,17。

受限撞击射流（CIJ）混合器是FNP中最简单的混合器设计，可实现两股流体的可扩展且连续的混合，如图1A13所示。多入口涡流混合器（MIVM）被开发用于支持最多四股不同的进样流，同时仍能实现均匀颗粒形成所需的快速微混合，如图1B18所示。FNP能够简化制剂筛选过程，并可轻松转化为商业化规模生产。由于该工艺具有连续性，增大批次规模无需更换新的容器，而只需延长运行时间，从而可在同一设备系统中简便地实现千克级规模的生产。

诸如多肽和蛋白质（“生物制剂”）等亲水性化合物也可通过一种称为反向快速纳米沉淀（inverse Flash NanoPrecipitation, iFNP）的过程进行包封。该技术需要一种两亲性嵌段共聚物（BCP），其中一段为疏水性，另一段为聚酸19。第一步是将含有生物制剂和BCP的二甲基亚砜（DMSO）溶液流与一种脂溶性溶剂（如二氯甲烷或氯仿）迅速混合。这会导致形成由疏水性嵌段刷稳定的颗粒。此类结构在此被称为“反向”纳米颗粒（NP）。其核心含有聚酸，随后通过多价阳离子进行离子交联。该步骤可使颗粒在后续加工中稳定存在于水相环境中，可制备成微粒或聚乙二醇（PEG）包覆的纳米颗粒，相关技术已在文献中报道19,20,21。

本方案可用于实验室规模制备包载疏水性或亲水性化合物的聚合物核壳纳米颗粒。方案的各个小节介绍了两种混合器——CIJ 和 MIVM 的使用方法。读者应能够根据流体输入选择合适的混合器，将本方案适配于新的核组分，并可重复地制备出目标粒径的纳米颗粒。下文展示了使用 FNP 和 iFNP 的三个示例配方。其中两个采用 CIJ 混合器，一个需要使用 MIVM15,22。第一个配方演示了通过 FNP 封装模型 疏水性 化合物。第二个配方演示了在 CIJ 混合器中通过 iFNP 封装模型 亲水性 化合物。最后一个配方提供了使用 MIVM 通过 iFNP 封装蛋白质的实例。该第三种配方的方案描述了一种小型手持式 MIVM，称为“μMIVM”的使用方法。该混合器设计尺寸更小，便于简化配方筛选，但其放大行为已被充分理解，且该混合器并非微流控装置22。方案的最后一部分包含有关筛选出的优选配方放大生产的若干说明。这些配方旨在为学习该工艺提供切入点，因此采用了不可降解的聚苯乙烯类聚合物。文献中已报道了多种替代性稳定剂，并有多种生物相容性的商业化选择可供使用14,23,24。

方案

1. 使用CIJ混合器将疏水性化合物包封于聚合物纳米颗粒中

  1. 准备并清洁设备。
    1. 采购并验证CIJ混合器。
      注意：参见 补充信息 第1节为构造指南。CAD文件可获取为 补充信息 同样。
    2. 每次使用前，确保CIJ混合器上的所有接头均拧紧，且出口管路无弯曲或受压。
    3. 在通风橱中，将装有2-3 mL溶剂的5 mL鲁尔锁型注射器连接至每个入口接头。选择一种溶剂（例如，丙酮）以清洗混合器中最近使用的任何化合物。
      注意：通常选择丙酮或四氢呋喃（THF）。请仅使用聚丙烯注射器，以避免溶剂相容性问题（如浸出）。切勿使用带有橡胶O形圈密封活塞的注射器。
    4. 将CIJ组件置于废液容器上方。
      注意：使用瓶口小于CIJ主体的烧瓶效果较好，因为这样可支撑混合器并便于操作注射器。
    5. 缓慢而稳定地按压注射器推杆，使内容物在数秒内通过混合室排空。移除注射器。
      注意：注射器可在多次FNP运行之间的清洁过程中保留并重复使用。
    6. 使用氮气干燥 CIJ 混合器内部2 流。N末端的雄性鲁尔接头2 该方法行之有效。
      注意：如果清洗溶剂不是挥发性的（例如， DMSO），在进行步骤1.1.6之前，使用丙酮或四氢呋喃重复步骤1.1.3–1.1.5。为确保批次间的一致性，必须彻底去除残留溶剂。
  2. 配制目标组成的溶剂和抗溶剂流。
    1. 溶解疏水性化合物（即，维生素E）溶于未稳定的THF中，浓度为10 mg/mL，配制足量以完成所需次数的FNP实验。每次实验所需量应稍多配制一些。
      注意：这些步骤中可使用其他溶剂，但需遵守讨论部分中的限制条件。若使用四氢呋喃（THF），建议采用不含稳定剂的溶剂，因为丁基化羟基甲苯在水中的溶解度较低。应谨慎操作以避免过氧化物积累（包括进行过氧化物检测），并需注意低浓度的过氧化物可能干扰某些纳米颗粒（NP）的应用。例如， 染料漂白。
    2. 在涡旋混合器上混合维生素E溶液直至溶解。
      注意：对于某些化合物，浴式超声处理1-2分钟可能有助于形成溶解溶液。必须确保所有纳米颗粒组分均以分子状态完全溶解。
    3. 溶解嵌段共聚物稳定剂（即聚苯乙烯-b-聚乙二醇，PS1.6k-b-聚乙二醇5k) 于THF中配制成10 mg/mL的溶液，体积与1.2.1步骤大致相同，以形成聚合物溶液。
      注意：其他溶剂也可使用，但需符合讨论部分所述的限制条件。
    4. 将聚合物溶液用涡旋混合器混合至溶解。如有必要，将溶液置于超声浴中1-2分钟，以促进固体溶解。
      注意：聚合物不能处于胶束形态。动态光散射（DLS）可作为判断新配制溶液是否符合此标准的有效工具。
    5. 通过移液枪先将0.25 mL维生素E溶液加入1.5 mL离心管中，再向同一管中加入0.25 mL聚合物溶液，配制含有维生素E和稳定剂（维生素E载药量50%）且浓度均为5 mg/mL的溶剂进样流。
      注意：使用不同规格的注射器可实现每次运行超过 0.5 mL 的体积。当输入体积超过 10 mL 时，建议使用注射泵。
    6. 在涡旋混合器上充分混匀5-10秒。可选步骤：在1000 × g离心5-10秒，以回收附着在管盖上的液体，这有助于提高CIJ实验重复性。
    7. 将0.525 mL去离子水移液至另一支1.5 mL离心管中，作为反溶剂流。
      注意：使用过量的反溶剂更为理想，这能确保溶剂流在进入混合室时始终有反溶剂存在。在某些情况下，若盐在溶剂/反溶剂混合体系中的溶解度不受限，可采用缓冲水相系统。
    8. 将4 mL去离子水移液至20 mL闪烁瓶或其他合适的容器中，作为淬灭浴。在瓶中放入一根小型磁力搅拌子。
      注意：淬灭浴通过将最终溶剂含量降低至体积比10%，从而减少奥斯特瓦尔德熟化现象15,17该体积可根据工艺限制进行调整，并可随输入流体积直接放大。
  3. 使用CIJ混合器通过FNP法制备NPs。
    1. 将敞口的淬灭浴小瓶置于通风橱内已清洁的CIJ混合器下方的搅拌板上。一种实用的配置是使用50 mL试管架模块支撑CIJ混合器，使小瓶位于其下方，并将出口管路导入小瓶中。参见 图1A 用于定位。
    2. 开始搅拌淬火浴 通过 以约最大速度的75%启动磁力搅拌子。
    3. 使用带有钝头针头的1 mL聚丙烯注射器，从反溶剂管中吸取全部体积的液体。
      注意：请勿使用带有橡胶O形圈密封的注射器，以避免兼容性问题。对于较大的进样体积，应使用尺寸合适的鲁尔锁扣注射器。注射器出口必须位于注射器轴线的中心位置，否则在按压过程中会不稳定。
    4. 小心地将注射器中的所有气泡排出，并取下钝头针尖，将其丢弃至锐器容器中。
    5. 将活塞预推至液流恰好到达注射器开口处。将注射器连接到CIJ进样口接头之一。
    6. 重复步骤 1.3.3–1.3.5，对溶剂溶液进行相同操作。
    7. 迅速、平稳且均匀地同时按压注射器，可根据个人习惯选择用手掌根部、整个手掌或单个拇指分别按住推杆顶部进行操作。将流出液收集至淬灭浴小瓶中。
      注意：0.5 mL 的进样量应在不到 0.5 s 内推注完成。
    8. 将CIJ混合器放置一旁 注射器仍连接着. 取出搅拌子并盖紧小瓶，此时小瓶内含有具有核-壳粒子结构的纳米颗粒分散液（图1C).
    9. 将混合器置于废液容器上方，取下注射器，滞留体积（约0.25 mL）将随之排出。丢弃使用过的注射器，并在下一次FNP实验前重复步骤1.1的清洗操作。
      注意：切勿让滞留体积的液体流入含有纳米颗粒（NPs）的小瓶中，否则将对样品的均一性产生不利影响。
  4. 进行纳米颗粒分散体系的分析与后续处理。
    1. 使用DLS表征纳米颗粒尺寸时，将100 μL纳米颗粒分散液移入塑料比色皿中，再加入900 μL淬灭浴溶剂（例如， 水
      注意：低体积比色皿可使用较小体积。通常进行10倍稀释即可。
    2. 通过移液吹打或轻微振荡充分混匀。根据仪器特定说明分析样品。
      注意：可根据需要进行其他表征技术，如zeta电位分析或电子显微镜检测。纳米颗粒分散液可依据具体应用需求进行后续处理，相关讨论详见讨论部分。

2. 使用 CIJ 混合器将亲水性化合物包封于倒置纳米颗粒中

  1. 在通风橱中配制溶剂、反溶剂和淬灭溶液。
    1. 完成第1.1步中所述的清洗和准备工作，使用DMSO作为清洗溶剂，并按照第1.1.6步的备注要求，用THF进行第二次冲洗。
    2. 溶解亲水性化合物（即，麦芽糊精（MD，葡萄糖当量（DE）为4-7，平均分子量 = 3,275 g/mol，“3k MD”）溶于DMSO中，浓度为10 mg/mL，配制足够体积以完成所需次数的FNP实验。
      注意：其他溶剂也可使用，但需符合讨论部分所述的限制条件。
    3. 将麦芽糊精溶液用涡旋混合器混合至溶解。如有必要，将溶液置于超声波清洗仪中1-2分钟，以促进固体溶解。
    4. 制备嵌段共聚物稳定剂（即聚苯乙烯-b-聚丙烯酸, PS5k-b-PAA4.8k) 将THF中的储备溶液配制成约11.1 mg/mL的浓度，体积与2.1.2步骤大致相同，以形成聚合物溶液。
      注意：也可使用其他溶剂和稳定剂浓度。DMSO 可 readily 作为溶剂替代 THF。
    5. 将聚合物溶液用涡旋混合器混合至溶解。如有必要，将溶液置于超声浴中1-2分钟，以促进固体溶解。
      注意：聚合物输入不能处于胶束形态。可使用动态光散射（DLS）来确定新的流体组成是否符合此标准。
    6. 在1.5 mL离心管中，依次加入以下组分以制备溶剂流输入液（0.5 mL）：0.250 mL的3k MD溶液、0.225 mL聚合物溶液和0.025 mL去离子水。
      注意：该液流中的水含量对纳米颗粒的尺寸和多分散性有显著影响。通常，最佳操作范围为2.5–10 vol%。20范围较高值可能有助于大分子量化合物的包封。
    7. 在涡旋混合器上充分混匀5-10秒。
    8. 可选步骤：将离心管在1000 × g下离心5–10秒，以回收附着在管盖上的液体，这有助于提高连续进样喷射（CIJ）实验之间的重复性。
    9. 配制氯化钙（CaCl₂）交联剂溶液2) 二水合物，溶于甲醇，浓度为25.0 mg/mL。
      注意：交联剂将以1:1的电荷比例加入到PAA嵌段的酸基团中。若使用不同的交联剂、不同大小的PAA嵌段或不同的聚合物浓度，需相应调整其浓度20,21.
    10. 用移液器将0.5 mL氯仿和0.05 mL交联剂溶液（共0.55 mL）加入微量离心管中，制备反溶剂流。
      注意：其他合适的反溶剂取决于嵌段共聚物的选择，通常包括二氯甲烷或丙酮。交联剂也可加入淬灭浴中，并对纳米颗粒分散液进行额外老化，以促进交联结构的形成20.
    11. 在涡旋振荡器上充分混匀5-10秒。
    12. 可选步骤：将离心管在1000 × g下离心5–10秒，以回收附着在管盖上的液体，这有助于提高连续进样喷射（CIJ）运行之间的重复性。
    13. 加入4 mL抗溶剂（即，氯仿）加入20 mL 闪烁瓶中以配制淬灭浴。将一小段磁力搅拌子放入瓶中。
      注意：该体积可根据工艺限制进行调整。
  2. 按照步骤1.3所述完成NP形成的实验方案。
  3. 进行纳米颗粒分散体的分析与后续处理。
    1. 使用动态光散射法（DLS）表征纳米颗粒尺寸时，将100 μL纳米颗粒分散液移入玻璃比色皿中，并加入900 μL用于淬灭浴的溶剂。
    2. 用移液器反复吹打或轻轻振荡比色皿以充分混匀。按照软件说明分析样品。
      注意：可通过动态光散射（DLS）使用良溶剂（如DMSO或二甲基甲酰胺（DMF））作为DLS稀释液，对纳米颗粒（NPs）的交联进行定性评估。20稳定交联的颗粒在溶剂中表现出自相关函数，且粒径变化极小。交联不良的颗粒会发生溶胀，表现出较弱的自相关函数和散射强度。21.
    3. 可选地，加入碱（如氨水）以促进离子络合，并增强颗粒核心的交联。
      1. 可选地，使用氨水溶液（通常为30 wt%氨）通过重量法在甲醇中配制3.48 mg/mL的氨溶液。加入50 μL（即，相对于聚合物上的酸性基团为0.6当量）在搅拌下逐滴加入。
        注意：可通过调整浓度或添加体积来灵活改变相应的等效量25.
      2. 可选步骤：室温下轻轻搅拌孵育至少30分钟，以促进交联反应。
    4. 按照文献所述方法处理NP分散液，以制备微粒或包被的纳米颗粒19,20,21.

3. 使用μMIVM将卵清蛋白封装于倒置纳米颗粒中

  1. 配制溶剂和反溶剂溶液。
    1. 在去离子水中配制50 mg/mL的卵清蛋白溶液（“OVA”）。
    2. 在1.5 mL离心管中，将75 μL OVA溶液用0.675 mL DMSO稀释，配制0.75 mL溶液A，得到含10%（体积分数）水的5 mg/mL OVA DMSO溶液。充分混匀，并按前述方法短暂离心。
      注意：有关水的影响，请参见步骤 2.1.6。与之前各节相同，溶液的体积可根据材料需求按比例放大或缩小。
    3. 通过溶解嵌段共聚物稳定剂来配制溶液B（即聚苯乙烯-b-聚丙烯酸, PS5k-b聚丙烯酸（PAA）4.8k) 溶于 DMSO 中，浓度为 6 mg/mL。充分混匀，必要时超声溶解。取 0.75 mL 移入 1.5 mL 离心管中。
    4. 将0.75 mL THF（溶液C）移液至1.5 mL离心管中。
    5. 将1.85 mL氯仿（溶液D）移液至玻璃闪烁小瓶中。
    6. 在甲醇中配制60.0 mg/mL的二水合氯化钙交联剂溶液，使用涡旋混合器混匀。
    7. 按照步骤 2.3.4 中所述，用甲醇配制浓度为 4.17 mg/mL 的氨溶液。
    8. 向15 mL离心管中加入5.25 mL氯仿作为淬灭浴。
  2. 准备混合器组件和支架。
    1. 收集底部接收器、混合几何圆盘、顶部圆盘、扳手和一个O形圈。参见 图2 有关组件和混匀仪支架术语的示意图。
      注：有关MIVM构建的详细信息可参见 补充信息 （第1节）及文献中22CAD 文件可获取为 补充信息 同样。
    2. 将O形圈放入凹槽中，确保其安装到位，且无磨损或损坏迹象。
      注意：正常操作会导致O形圈磨损或被溶剂溶胀。若O形圈出现拉伸或变形，请在使用前将其置于空气中干燥过夜。若过夜后仍未恢复原状，请丢弃该O形圈。O形圈为耗材部件，建议大量备货。
    3. 将混匀盘上的孔与顶盘上的销钉仔细对齐，然后压合。通过检查两个部件是否完全贴合，确保O型圈未发生移位。
    4. 将两个部件翻转并手动与底部接收器组装。确保出液管接头已松开，以免影响圆盘的完全紧固。
      注意：如果在组装过程中螺纹卡住，请小心拆卸，并在螺纹处涂抹食品级或药用级防咬合剂，以防止螺纹咬合。
    5. 手动拧紧后，将扳手安装到上部圆盘的销钉上，进一步牢固地拧紧组件。然后拧紧出口管路接头，使其紧贴混合结构的底面。确保上部圆盘上的注射器接头紧密无松动。
    6. 将组装好的混合器放置在混合器支架上，使出口管路位于支撑板下方。支撑移动板，使其悬空，避免妨碍工作区域。
    7. 可选地，为检查机械限位对齐情况，首先将空玻璃注射器连接至混合器入口。
      注意：由于所有注射器以相同的线性速度同时被推动，因此通过使用不同筒径的注射器来调节体积流量。所有注射器的初始和最终垂直高度必须保持一致，并可通过插入推杆轴的调节螺钉进行调整。22机械限位器可确保玻璃注射器不会受到过度损坏。
      1. 可选择性地降低移动板，使其落在机械限位上。确保这些限位对齐，使移动板在即将接触空注射器之前即停止（如图所示）。 图2).
      2. 如有需要，可松开机械限位装置并重新定位。取下玻璃注射器，并将移动板复位至不妨碍操作的位置。
        注意：使用塑料注射器操作时，无需机械限位装置。
    8. 将敞口的淬灭浴置于出口管路下方，以收集流出液。
    9. 用平头针将溶液A吸入1 mL气密注射器中。去除所有气泡，并丢弃针头。将溶液排至注射器鲁尔接头末端进行预灌注。对溶液B和溶液C重复此操作。
    10. 使用平头针将溶液D吸入一支2.5 mL气密注射器中。彻底排除所有气泡，并丢弃针头。将溶液预灌注至注射器鲁尔接头末端。
      注意：已选择这些体积，以确保初始注射器推杆高度相同。如果改变体积，仍必须满足此高度要求。
    11. 将四个注射器按顺时针方向以字母顺序安装到混合器上。见 图1B 最终外观及注射器方向示意图。
      注意：检查各注射器高度是否无明显差异，必要时进行故障排查。
  3. 执行混合器操作及清洗。
    1. 握住移动板两侧的轴承座。切勿将手指放在轴承座的底面，因为此处与机械限位接触时存在夹伤风险。缓慢降低移动板，使其均匀地轻轻接触注射器。
    2. 平稳而缓慢地压下平板，目标是在约0.5–1秒内完成此操作，适用于这些流体体积。22.
      1. 取出并盖上淬灭浴试管的盖子，该试管现含有纳米颗粒分散液。
    3. 将仍连接着注射器的混合器移至废液容器上方。取下注射器，使滞留体积的液体排入容器中。将混合组件倒置，使用扳手拆卸混合器。
    4. 使用喷瓶，用数毫升溶剂冲洗出口管路（例如， 丙酮）并用空气或氮气吹干。
    5. 用良好的溶剂冲洗混合装置例如， 去离子水或DMSO）处理，然后用喷瓶中的数毫升丙酮冲洗。用空气或氮气流吹干。
    6. 用去离子水冲洗O形圈，然后吸干。
    7. 用溶剂瓶取数毫升丙酮彻底冲洗顶部圆盘，直至肉眼观察干净。用空气或氮气气流吹干表面和注射器接头。
    8. 用数毫升的良好溶剂冲洗每支注射器（例如， 去离子水或丙酮）从溶剂瓶中取出。使用数毫升丙酮进行最后一次冲洗，然后在下次使用前晾干。
  4. 进行后期处理与分析。
    1. 在约最大速度的75%下搅拌的同时，逐滴加入50 μL二水合氯化钙交联剂溶液。
    2. 在75%最大转速下搅拌，同时逐滴加入50 μL氨溶液。静置老化至少30分钟。
    3. 按照步骤 2.3.1 和 2.3.2 所述表征纳米颗粒的尺寸。
    4. 按照文献所述方法处理纳米颗粒分散液，以制备微粒或包被的纳米颗粒19,20,21.

4. 制剂放大生产的改进措施

  1. 按照步骤1、2或3所述，配制所需组成的溶剂和反溶剂溶液，并确保体积足以满足所需制剂规模。
  2. 必要时，可在纳米颗粒制备前，按照适当的方案对混合器进行原位清洗和灭菌。
    注意：过去曾采用 CIP 100、水（至中性 pH）、CIP 200、水（至中性 pH）以及适当溶剂进行依次冲洗。此外，当最终粒径无法通过过滤方式进行灭菌时，可在混合器入口处连接无菌过滤器。
  3. 将溶液装入适当体积的气密注射器中，并连接带有鲁尔接头的聚四氟乙烯（PTFE）管。手动将溶液预充至管路末端。
    1. 将注射器装入注射泵，并根据需要将其连接至CIJ或MIVM的混合器入口。
      注意：也可在实验室或中试规模下使用流量控制器，以提供比注射泵更大的体积处理能力。成功运行需要稳定的流速和足够的压降，这意味着带出口流量计量的加压容器是大规模生产的最合适选择。
  4. 在出口管下方放置一个收集容器，必要时容器内装有足量的淬灭浴液。
  5. 设定体积流量速率，以匹配手动操作时达到的数值（例如， 约30-60 mL/min 每股流
    注意：若使用CIJ，泵的流速必须相同；若使用MIVM，不同的入口可以设置不同的流速。
  6. 同时启动泵。用一个小瓶收集约5-10 mL流出液作为废液（此为“启动体积”），然后开始在淬灭浴中收集。
  7. 按照上述相应配方部分所述进行表征和处理。

结果

使用FNP对纳米颗粒（NP）制剂进行筛选快速且所需材料量少（约为1-10 mg）。通过FNP方案包载疏水性化合物（如维生素E）（步骤1）可形成稳定、澄清或轻微乳光的纳米颗粒分散液。动态光散射（DLS）是一种可靠的粒径表征方法。如图3所示，该工艺可重复地制备出低多分散性的纳米颗粒。典型的多分散系数（PDI）小于0.20，表明颗粒群体相对均一。PDI由自相关函数计算获得，通常由仪器软件自动提供。它是二阶矩与一阶矩的比值，对于单分散颗粒，其值通常约为0.126。在所报道的四组维生素E/PS-b-PEG制剂重复实验中，PDI为0.12 ± 0.02，平均粒径为107 ± 7 nm。一种典型的“失效”情况（由注射器推压不均或推压速度过慢引起）也在图3中进行了报道。该情况下多分散性未受影响，但粒径略大（135 nm）。若包含此样本，粒径的新统计结果为113 ± 14 nm。发生“失效”时，混合腔内会出现仅有一种流体单独存在的时段。确保整个流体经历相同的加工历史以及在混合器内有机相与水相的相对体积一致至关重要。若无稳定剂存在，则会形成含有可见聚集体的不透明溶液。该样品的DLS自相关函数呈非单调性，且衰减不平滑，如图3插图所示。

通过FNP控制粒子尺寸的效果如图4所示，在此实验中，通过改变核心材料（此处为聚苯乙烯1.8k）与PS-b-PEG稳定剂的相对用量，所得粒子尺寸在49–152 nm范围内变化。这些粒子由含有核心材料和稳定剂总质量浓度为20 mg/mL的THF流体制备而成，其中聚苯乙烯核心材料占总质量的25%、50%或75%。所制备纳米粒子的多分散性始终低于0.15。关于FNP过程中参数对粒子尺寸影响的详细讨论可参见文献10。通过保持溶剂体积恒定，并调节核心材料与稳定剂储备液的相对体积，可调节载药量。同样，通过配制浓度不同于10 mg/mL的储备液，也可调节总质量浓度。在某些条件下，可通过动态光散射（DLS）观察到空 micelle 的群体27，这除了导致测得的粒子尺寸分布变宽外，并无其他不利影响。当两类粒子尺寸相近时，该现象可能表现为单一的宽峰，而非两个分离的峰。

相同的CIJ混合器也可用于通过iFNP封装亲水性化合物，如方案步骤2所示。在所报道的配方中制备的颗粒粒径约为65 nm，多分散系数为0.08。粒径分布如图5A（虚线）所示。通过DLS分析在强溶剂（如DMSO）中交联PAA羧酸残基对颗粒稳定性的影响，如图5B所示。充分交联颗粒的自相关函数应起始于接近1的值，并在与颗粒尺寸相关的特征时间迅速下降至0（实线）。发生显著溶胀或溶解的颗粒未充分交联，其自相关信号极弱（点线）。iFNP实验失败的表现与上述FNP类似，可能观察到可见的聚集体或DLS自相关函数曲线形状不佳。当由于溶解度或化学不相容性等系统限制需要超过两个进样流路时，可使用MIVM进行FNP或iFNP。带有混合器支架的小型MIVM（即μMIVM）如图2所示。与CIJ类似，该混合器也可用于封装疏水性或亲水性化合物22。在步骤3中，描述了通过iFNP封装亲水性蛋白OVA的实验方案。颗粒粒径分布如图5A（实线）所示，粒径约为125 nm，PDI为0.16。步骤4提供了在更大规模下使用注射泵操作的一般性方案。

溶剂-反溶剂淬灭装置；示意图、实验装置、纳米颗粒形成。
图1：混合器组件及内部流型示意图。（A）受限撞击射流（CIJ）混合器连接注射器后置于淬灭浴上方。图中未显示淬灭浴小瓶中的搅拌子和搅拌板。放大图展示了混合结构，显示两股流体入口在腔室中心对撞。（B）多入口涡旋混合器（μMIVM）配有玻璃注射器，并安装在支架上，位于淬灭浴上方。图中已裁剪掉移动板和机械限位装置。放大图示意性地展示了涡旋腔室和入口通道。（C）通过FNP法制备的核-壳纳米颗粒的示意图。红色球体代表治疗剂，与蓝色的塌缩聚合物链段共同构成纳米颗粒的核心。黄色聚合物链段形成刷状层，为纳米颗粒提供空间稳定作用。请点击此处查看该图的放大版本。

压缩测试装置示意图，标注了可移动板、机械止挡、支撑板等组件。
图2：μMIVM的术语说明及组装组件。 μMIVM需要使用混合支架，以实现对四个注射器的均匀按压。在此情况下，必须确保所有注射器推杆的高度一致，以保证混合的均一性。该装置也可选择使用注射泵进行操作。图中左侧展示了带有标注组件的混合支架。右侧为已拆解的混合装置，其中O型圈已安装在混合几何盘上。请点击此处查看该图的放大版本。

归一化强度图显示纳米颗粒尺寸分布，内嵌图为相关时间与强度关系。
图3：由维生素E核心及PS-b-PEG稳定的聚合物纳米颗粒的粒径分布。 动态光散射（DLS）提供基于强度加权的粒径分布，反映纳米颗粒（NP）直径分布情况。曲线为每次实验三次重复分析的平均值，并已重新调整比例以使各峰值最大高度一致。四次重复实验（实线）表明该方法具有高度可重复性（标准偏差 = 7 nm）。图中还包含一次代表性异常结果（虚线），由注射器推进速度过慢或两个注射器按压不均所致，导致颗粒直径增大。若计入异常结果，纳米颗粒尺寸的标准偏差为14 nm。（内嵌图） 在无PS-b-PEG稳定剂的情况下，会形成较大的微米级聚集体（或对于维生素E等油类而言为液滴）。图中显示了未加稳定剂实验组的DLS自相关函数（虚线），以及一次纳米颗粒重复实验的代表性自相关曲线（实线）。自相关函数显示出对照样品存在多个特征时间尺度，表明其为多分散体系。请点击此处查看该图的放大版本。

纳米颗粒尺寸分布图；不同核心百分比，归一化强度与直径的关系。
图 4：通过调节核心材料与稳定剂的相对比例，利用 FNP 控制颗粒尺寸。 图中显示了三种以聚苯乙烯为核、PS-b-PEG 为稳定剂的配方的强度加权尺寸分布。THF 中的总质量浓度为 20 mg/mL，反溶剂为水。配方在 CIJ 混合器中制备。图例中列出了核心材料所占的质量分数。例如，25% 核心样品含有 5 mg/mL 聚苯乙烯和 15 mg/mL PS-b-PEG。25%（实线）、50%（虚线）和 75%（点划线）核心含量样品的平均粒径分别为 49 nm、96 nm 和 152 nm。所有样品的 PDI 值均小于 0.15。请点击此处查看该图的放大版本。

纳米颗粒尺寸分布与相关函数图；动态光散射分析。
图 5：在 CIJ 混合器或 μMIVM 中制备的倒置纳米颗粒的表征。 (A) DLS 曲线为每种配方三次重复分析的平均值。虚线表示在 CIJ 混合器中制备的 3k MD 颗粒的尺寸分布，实线表示在 μMIVM 中制备的 OVA 颗粒的尺寸分布。(B) 可使用 DMSO 作为稀释剂，通过 DLS 评估交联强度。DLS 自相关函数通过初始自相关值以及观察到向零值的清晰转变来反映交联强度。虚线描绘了无交联剂颗粒的自相关函数，显示初始信号较弱且衰减时间较宽。实线描绘了添加强交联剂（本例中为四乙烯五胺）后的自相关函数，显示初始信号较强且衰减时间尺度明确。 请点击此处查看该图的放大版本。

过饱和度与有机溶剂；比较肽B和啶酰菌胺溶解度水平的图表。
图6：过饱和度 S 随有机溶剂与水相对混合比例的变化关系。（A）对（○）啶酰菌胺（一种农药）和（■）肽B（一种七残基模型肽）所能达到的最高过饱和度的比较。有机相中啶酰菌胺的浓度为 230 mg/mL，肽B为 200 mg/mL，均为其饱和浓度。每种活性药物成分（API）/溶剂体系均存在一个最大过饱和度。（B）当有机相中啶酰菌胺的浓度降低20倍时，实现过饱和和纳米沉淀的条件范围将受到限制。本图经Elsevier许可转载9。请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件。 请点击此处下载文件。

讨论

在方案的第1步中，已对维生素E等疏水性化合物的包封进行了广泛描述9,14,28。由于混合的时间尺度短于颗粒聚集和生长的时间尺度，因此可生成相对单一分散的颗粒。具体而言，混合溶剂/非溶剂体系迅速达到均一状态，从而使成核过程均匀发生。随后，嵌段共聚物在颗粒表面组装，提供空间位阻稳定作用，从而终止颗粒的进一步生长5。由于混合室内的混合时间（湍流）取决于CIJ或MIVM的进样流速，因此在进入湍流混合状态后，存在某一进样速率可使颗粒尺寸基本保持恒定13。这使得该工艺具有更强的稳健性，因为即使进样流速存在一定的批间差异（即，注射器推进速度），对最终纳米颗粒（NP）尺寸的影响也不显著，如图3所示。较慢或不均匀的进样速度可能导致颗粒尺寸增大或粒径分布更宽，如“点火失败”示例所示。FNP技术还通过反向闪速纳米沉淀法（inverse Flash NanoPrecipitation）被拓展用于将亲水性化合物包封于纳米颗粒中。这些反向纳米颗粒随后可用于制备微粒，或通过PEG包覆形成可在水中分散的纳米颗粒25。其基本组装原理保持不变，但需额外对颗粒核心进行交联，以在水性环境中稳定颗粒结构。通常，交联剂与聚酸嵌段的电荷比为1:1即可满足要求，但通过加入碱调节pH值可促进离子相互作用19。在本方案中，仅描述了形成反向纳米颗粒的第一步工艺过程。

除了快速混合外，FNP 或 iFNP 方法成功制备纳米颗粒还受限于多个条件的同时满足9,14。首先，所有进样流必须互溶。尽管乳液已被用于纳米颗粒的制备，但 FNP 要求在混合器中形成均匀的溶液相。其次，核心组分在混合器内的溶剂条件下（对于 CIJ 为体积比 50/50 的混合液）必须几乎不溶，以驱动快速成核。否则，大量物质将保持未包封状态，或在进一步用反溶剂稀释后发生沉淀。MIVM 可在混合腔内实现更高的反溶剂含量，从而缓解核心材料溶解度的限制。通常可通过溶解度数据绘制溶剂组成函数的过饱和曲线，以指导工艺设计9。图6展示了两种化合物的代表性曲线。若混合腔条件下的过饱和度较低，则建议在不同组成条件下运行，通常采用 MIVM。较高的过饱和度有利于核心组分的成核而非颗粒生长，但若核心材料与稳定剂的组装时间不匹配，则可能导致治疗剂形成大尺寸聚集体。D'Addio 和 Prud'homme 已对这类过饱和曲线的应用进行了详细综述9。最后，嵌段共聚物（BCP）必须在溶剂流中以分子状态完全溶解，且反溶剂必须对其中一个嵌段具有选择性。BCP 必须具备足够的两亲性，一方面通过塌缩嵌段产生溶剂疏性驱动力，使稳定剂锚定在颗粒表面，另一方面通过溶剂化嵌段赋予颗粒空间位阻稳定性。只要满足上述条件，也可使用本方案中未提及的其他溶剂。

手动操作注射器的练习可提高筛选过程的成功率。如上所述，当操作处于从层流到均匀湍流混合条件的转变之上时，流速的微小变化在过程中是可容忍的28。扩大至由泵驱动、计算机控制的流动系统，可因入口流速的可重复性而进一步提高一致性。在颗粒后续处理的任何阶段，通过目视检查或动态光散射（DLS）分析可能发现存在大尺寸聚集体，这可能是由于偶然引入的灰尘或颗粒不稳定所致。必要时，可使用适当孔径的滤膜对流体进行过滤。在无聚集体的情况下，我们发现，若滤膜的标称孔径大于颗粒尺寸分布，过滤聚乙二醇（PEG）包覆的纳米颗粒时通常损失的质量低于5%。当过滤聚集体时，则需通过实验确定该过程中损失的质量。质量损失的定量可通过以下两种方法之一进行。可通过热重分析测定特定体积下的总固含量在过滤前后的变化，以确定改变程度（参见补充信息第2节）。或者，可将颗粒回收（例如， 通过冷冻干燥），并溶解于良溶剂中，随后采用合适的技术（如紫外-可见分光光度法或色谱法）直接测定核心材料的浓度。

对于FNP，残留的10 vol%有机溶剂（例如，四氢呋喃（THF）必须从水相分散液中去除。可通过蒸发蒸馏实现。14,29透析30或切向流过滤31,32每个处理步骤的实际注意事项详见所提供的参考文献。对于透析，常用的膜截留分子量为3.5 kDa或6–8 kDa，尽管也有更大截留值的膜可供选择。当透析时间达到24 h并多次更换透析液时，该分子量截留值足以实现溶剂的去除。使用切向流过滤时需进行一定的工艺开发，必须注意避免因膜表面浓差极化而引发聚集。我们发现，将有机溶剂的体积分数降低至依赖于体系的某一特定值以下（通常为2–10 vol%），可消除膜表面的聚集现象。处理完成后，可通过热重分析（见 补充信息 第2节）。通常希望以高度稳定的形式运输或储存颗粒。水相分散液可直接使用干冰/丙酮混合物快速冷冻，随后于-80 °C保存。或者，可通过冷冻干燥获得干燥粉末。33,34 或喷雾干燥24通常需要添加冷冻保护剂以减少纳米颗粒在冷冻或干燥过程中的聚集。糖类（蔗糖、海藻糖、 等等。），聚乙二醇或环糊精可在不同浓度下通过动态光散射（DLS）监测粒径，以筛选其有效性35,36,37,38常见的纳米颗粒在加工过程中的稳定性问题通常与核心的溶解性或相分离有关，这些因素会导致在流动性增加的条件下，颗粒重排至更低能量状态。使用共核心材料、替代性稳定剂或改性外部溶液组成有助于提高稳定性。14,16,17,39,40,41.

如上所述，当需要实现高过饱和度时，MIVM 能够在混合室中容纳更高的反溶剂含量。当反应性或溶解度限制要求将不同组分物理分离时，该装置还可将物质分隔到两个以上的流路中。一个实例是抗生素氯法齐明（clofazimine）由玉米醇溶蛋白（zein）稳定化的纳米颗粒的制备24。疏水性氯法齐明通过丙酮流引入；zein 通过含60%乙醇的水溶液流引入；与 zein 形成复合物的酪蛋白（casein）通过缓冲水溶液流引入；第四个流路为额外的缓冲液，用于提高水相对于丙酮和乙醇的比例。由于氯法齐明与 zein 无法溶于同一种溶剂，因此需要两个溶剂流。该过程无法在双射流 CIJ 混合器中完成。这种由蛋白质稳定的制剂还表明，FNP 技术并不局限于使用嵌段共聚物（BCP）作为稳定剂。已有研究在无稳定剂条件下制备出 Janus 颗粒42，并展示了多种低成本稳定剂在口服给药中的应用24。值得注意的是，诸如羟丙基甲基纤维素（hydroxypropyl methylcellulose）等共聚物可替代嵌段共聚物使用24。可通过多种技术进一步增强核心材料的疏水性。疏水离子配对法已被用于包载一系列具有中等溶解度的化合物43,44,45。研究人员还设计出极疏水的前药并成功实现包封46。核酸可通过与阳离子脂质形成复合物的方式被包封47。重要的是，这些研究表明，FNP 能够制备出具有多种表面化学性质的纳米颗粒。此外，还可使用含有部分经靶向配体修饰链端的 BCP 的混合稳定剂体系。由于颗粒组成反映了进料流的组成，因此可精确调控颗粒表面的配体含量23,48。类似地，也可将多种核心组分共同引入，包括染料和无机纳米颗粒3,8。

Flash NanoPrecipitation（快速纳米沉淀法）是一种可放大的制备聚合物纳米颗粒的方法，所得颗粒具有疏水性或亲水性核心。只要满足上述各项条件，通常可将超过95%的核心材料以高质量分数包封于颗粒中。本文展示的三个示例均在实验室规模下进行，每种进料流仅需数毫克材料和约0.5 mL体积。这使得能够快速筛选颗粒制备条件，以优化配方。将优选配方放大至更大批次，只需延长工艺运行时间，通过使用注射泵或流量控制器即可轻松实现。相比之下，传统批量添加纳米沉淀法在放大过程中面临众所周知的挑战，即在添加点维持充分的微混合，并需考虑反应容器几何形状变化带来的影响49。这是一个重大障碍，因为按照美国食品药品监督管理局（FDA）的要求，必须以一致的方式生产颗粒50。微流控技术也可制备均一且可重复的纳米颗粒，但其产量通常仅限于毫克级别。例如，Karnik et al. 在一项药物释放研究中报道的产量为0.25 mg/min51。进一步放大通常需要高成本的并行化设备12。而采用FNP方法，仅需一台注射泵及若干连接混合器入口的接头，即可以600 mg/min的速率轻松生产1克纳米颗粒。因此，FNP既是一种易于实现的实验室规模筛选工具，也是一种适用于转化研究的纳米颗粒可放大生产工艺。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了Optimeos Life Sciences、美国国家科学基金会（CBET 1605816）、比尔及梅琳达·盖茨基金会（BMGF, OPP1150755）以及授予K.D.R.的美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1656466）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
受限撞击射流混合器NANA工程图纸请参见补充信息。有关新型混合器的验证，请查阅正文
鲁尔接头Idex Health & ScienceP-604与CIJ或MIVM混合器入口处的对应螺纹组装
堵头接头Idex Health & ScienceP-309安装于CIJ混合器侧面（密封钻孔后的通路）
出口接头 - CIJIdex Health & ScienceP-205与卡套和管路一起安装在CIJ腔体出口
出口卡套 - CIJIdex Health & ScienceP-200与出口接头配合使用（大端与管路齐平）
出口管路 - CIJIdex Health & Science1517使用管路切割器以获得平整端面。确保多余管路不会伸入混合腔内
四氢呋喃（THF）Fisher ScientificT425-4使用无稳定剂的THF，以避免BHT的溶解度限制。过氧化物可能在某些应用中产生干扰。
诺姆注射器（3 ml）VWR53548-017
维生素E（α-生育酚）Sigma-Aldrich90669-50G-F低温保存
聚（苯乙烯-b-乙二醇），PS1.6k-b-PEG5kPolymer SourceP13141-SEO根据具体应用，其他嵌段尺寸亦可接受
聚（苯乙烯）1.8kPolymer SourceP2275-S示例疏水性核材料
闪烁瓶DWK Lifesciences74504-20
鲁尔滑动塑料注射器，1ml（100支装）NationalS7510-1
麦芽糊精DE 4-7Sigma-Aldrich419672-100G
聚（苯乙烯-b-丙烯酸），PS5k-b-PAA4.8kPolymer SourceP5917-SAA根据具体应用，其他嵌段尺寸亦可接受
二甲基亚砜（DMSO）Fisher ScientificD159-4
二水合氯化钙Sigma-Aldrich223506-25G具有吸湿性。
甲醇Fisher ScientificA452-4
氢氧化铵Fisher ScientificAC423300250
鸡蛋清白蛋白（卵白蛋白，OVA）Sigma-AldrichA5503-1G
多入口涡流混合器NANA工程图纸请参见补充信息。有关新型混合器的验证，请查阅正文
出口接头 - MIVMIdex Health & ScienceP-942与卡套组合使用
出口管路 - MIVMNANA适配卡套内径
O型圈（MIVM）C.E. ConoverMM1.5 35.50 V75批量订购——消耗性部件。若使用其他来源，请确保其与溶剂兼容。
混合器支架NANA设计请参见Markwalter & Prud'homme的研究17

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用于在聚合物纳米颗粒中包载疏水性和亲水性化合物的闪速纳米沉淀法
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