小鼠边缘区B细胞剪切流诱导迁移的体外分析

摘要

边缘区B细胞（MZBs）在剪切流的作用力下会重新调整其迁移路径，逆流而上。本实验方案展示了如何利用流体控制单元、泵、显微成像系统及免费软件来记录和分析细胞迁移过程。

摘要

边缘区B细胞（MZBs）是一类存在于小鼠脾脏边缘区的B细胞群体，该区域包绕着淋巴滤泡。为了到达滤泡区域，MZBs必须逆着血流的剪切力迁移。本文介绍了一种在体外分析这种剪切流诱导的MZBs迁移的方法。首先，从小鼠脾脏中分离出MZBs；其次，将MZBs接种于含有整合素配体的流动腔载玻片上，施加剪切流，并在显微镜下观察其迁移过程；第三，利用ImageJ软件中的MTrack2自动细胞追踪插件处理迁移细胞的图像，并使用Ibidi趋化分析工具对所得的细胞轨迹进行量化分析。迁移数据可揭示细胞移动的速度、转向频率、剪切流方向是否影响其迁移方向，以及参与该过程的整合素配体种类。尽管本研究使用的是MZBs，但该方法可轻松适用于任何对剪切力有响应的白细胞迁移分析。

引言

免疫细胞是人体内运动性最强的细胞，通常需要应对来自血液和淋巴流动的剪切力。然而，关于剪切力诱导白细胞迁移的研究相对较少^1,2,3,4,5。本文介绍了一种可靠且定量的体外分析免疫细胞对流动响应的实验方案。该实验无需自行加工组件，所有仪器和耗材均可通过商业途径获得。整个实验流程，包括细胞纯化和迁移分析，可在一天内完成。最后，尽管本文描述的是边缘区B细胞（MZBs）的迁移，但该方案可经调整后用于分析其他类型免疫细胞在逆流条件下的迁移行为。因此，利用该实验可系统性地在多种条件下全面分析各类白细胞的迁移特性。

边缘区B细胞（MZB）是一群B细胞，在小鼠中仅存在于脾脏，并在滤泡内部与边缘区之间穿梭^6,7,8,9。边缘区是一层约5–10个细胞厚度的免疫细胞层，包裹着滤泡，主要由MZB和巨噬细胞组成，同时也包含不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）、树突状细胞（DCs）和中性粒细胞等¹⁰。边缘区的细胞暴露于来自脾动脉的单向血流中，这些动脉终止于围绕滤泡的边缘窦。血液从边缘窦上的孔洞流入边缘区，随后被红髓中的静脉窦收集并返回循环系统¹¹。持续流动的血液冲刷MZB，使其接触血液中携带的抗原。MZB通过在未暴露于血液的滤泡内部与边缘区之间自动穿梭，将抗原带入滤泡内。因此，当MZB向滤泡方向移动时，必须逆着血流的剪切力迁移¹²（图1A）。

在本方案中，我们描述了如何在体外定量测定免疫细胞（如边缘区B细胞）对无流动或高流速条件的响应，以揭示其迁移程序的调控机制 体内第一步，使用商品化试剂盒中偶联有抗体的磁珠从鼠脾脏中纯化边缘区B细胞（MZBs）。将 freshly isolated MZBs 加入流动腔载玻片的孔中，使其沉降并黏附于整合素配体上，随后通过泵系统施加迁移缓冲液的流动刺激。图2A）。使用延时视频显微镜系统对细胞进行成像，随后利用免费的 ImageJ 插件 MTrack2 对图像进行处理和分析。^13,14，以自动追踪细胞。随后可使用免费的 Ibidi 细胞趋化分析工具对轨迹进行定量分析¹⁵ 用于确定包括速度、直线性和迁移指数在内的多种参数。这些数值可用于评估迁移抑制剂、细胞刺激物、趋化因子及其他影响迁移的化学物质对剪切流诱导的细胞迁移所产生的效应，从而帮助理解控制体内免疫细胞运动的力学因素。

方案

所有涉及动物使用的实验均已按照马格德堡大学医学部的各项指南，事先获得德国哈勒（萨克森-安哈尔特州）州行政管理局的批准。

1. MZB 细胞纯化

1. 分离白细胞。
   1. 处死一只8 至16周龄的小鼠，取出脾脏¹⁶。将脾脏置于5 mL冰浴细胞缓冲液[磷酸盐缓冲液（PBS）+ 0.5%无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）]中，使用组织解离仪或将脾脏用5 mL注射器的推杆轻轻研磨通过6孔板中的70 µm细胞筛网，进行组织解离。
   2. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。向组织解离管或6孔板中的尼龙筛网中再加入5 mL冰浴细胞缓冲液，收集残留细胞，并将此额外的5 mL细胞缓冲液连同细胞一并转移至同一锥形管中。在室温（RT，20 °C）下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。
2. 进行红细胞裂解。
   1. 将细胞沉淀重悬于1 mL已预热至室温的红细胞（RBC）裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl，10 mM KHCO₃，0.1 mM EDTA）中。再加入1.5 mL RBC裂解缓冲液，轻轻涡旋混匀。在室温（20 °C）下孵育总共2分钟（包括重悬沉淀所需时间）。
   2. 向细胞悬液中加入7.5 mL冰浴细胞缓冲液以终止裂解反应。在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。
   3. 将细胞沉淀重悬于1 mL细胞缓冲液中，再加入9 mL细胞缓冲液。用移液器将10 mL细胞悬液通过30 µm预分离滤器转移至新的15 mL锥形管中，以去除细胞碎片。
   4. 在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于500 µL细胞缓冲液中。在后续所有操作步骤中保持细胞低温，直至进入流式迁移腔载玻片孵育。
3. 纯化边缘区B细胞（MZBs）。
   1. 向锥形管中的细胞悬液中加入50 µL商品化试剂盒提供的生物素偶联抗体（针对所有非目标细胞，包括CD43（非B细胞）、CD4（T细胞）、CD93（未成熟B细胞）和Ter119（红细胞））。轻轻振荡或轻弹管壁混匀，切勿涡旋。将锥形管平放于冰上呈近水平角度，在25 rpm条件下轻轻摇动15分钟。
   2. 向细胞悬液中加入100 µL抗生物素抗体偶联的磁珠。继续在冰上以25 rpm摇动20分钟。加入5 mL细胞缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。将细胞重悬于1 mL细胞缓冲液中。
   3. 将细胞悬液通过磁性柱保留磁珠偶联的细胞，从而去除目标外细胞。弃去被标记的细胞（所有非B细胞和未成熟B细胞）。收集未被标记的细胞（成熟B细胞），收集至已用5 mL细胞缓冲液短暂润洗预包被的15 mL锥形管中，以防止MZBs发生非特异性黏附。
   4. 用5 mL细胞缓冲液洗涤细胞悬液，在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。将细胞重悬于90 µL细胞缓冲液中，加入10 µL抗CD23偶联磁珠。在冰上以25 rpm轻柔摇动20分钟。
   5. 用5 mL细胞缓冲液洗涤细胞悬液，在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。将细胞重悬于1 mL细胞缓冲液中。
   6. 将细胞悬液通过磁性柱保留磁珠偶联的细胞，从而去除目标外细胞。弃去被标记的细胞（滤泡B细胞）。收集未被标记的细胞（MZBs），收集至已用5 mL细胞缓冲液短暂润洗预包被的15 mL锥形管中。取出50 µL细胞用于计数和纯度检测。
4. 对分选后的MZBs染色以检测纯度。
   1. 在50 µL体积中含有10,000个细胞的样本中加入10%体积（5 µL）的Fc阻断剂，在4 °C孵育5分钟。加入105 µL含以下抗体的细胞缓冲液：B220-FITC（0.15 µg，0.3 µL）、CD21-PE（0.06 µg，0.3 µL）和CD23-APC（0.06 µg，0.3 µL）（每种抗体稀释比例为1:350），或使用其他荧光染料组合以区分滤泡B细胞与MZBs。在4 °C避光条件下染色15分钟。
   2. 用1 mL细胞缓冲液洗涤染色后的细胞一次，在4 °C下以300 x g离心5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于300 µL细胞缓冲液中，使用流式细胞仪及标准方法获取数据。设门策略依次为活淋巴细胞、B220⁺细胞，最终为CD23^low CD21^high细胞（图1B）。
      注：该方法通常可从一只C57B/6小鼠脾脏中获得约500,000个MZBs。
5. 准备MZBs用于流式迁移实验。
   1. 用1–2 mL冷迁移缓冲液[含阳离子的Hanks平衡盐溶液（HBSS）、10 mM Hepes、0.2%无脂肪酸BSA]洗涤纯化的MZBs一次，以确保含阳离子的迁移缓冲液不会被残留的无阳离子PBS稀释。在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。将MZBs重悬于冷迁移缓冲液中，调整浓度为每30 µL含50,000个MZBs（相当于一个流式迁移腔载玻片单孔的加样量）。
      注：新鲜分离的MZBs应尽快使用。然而，只要保持在冰上，这些细胞在实验开始后仍可持续迁移8小时或更长时间。其他细胞类型的最适温度需另行测试。例如，培养的T细胞在迁移开始前可能更适合维持在37 °C。

2. 流动实验

1. 用整合素配体包被载玻片。
   1. 实验前一天，解冻一份ICAM-1（400 µg/mL）。用PBS将ICAM-1按1:80稀释，使其终浓度为5 µg/mL。每个流动腔室中加入30 µL ICAM-1，用于每段迁移视频的录制。将载玻片置于湿盒中，4 °C孵育过夜。
      注：每张载玻片包含6个腔室，单次实验最多可轻松记录8段视频。
2. 封闭包被后的孔。
   1. 实验当天，通过向腔室的一个孔加入100 µL PBS，并从另一孔吸出100 µL，清洗腔室。向腔室中加入100 µL封闭缓冲液（含2%无脂肪酸BSA的PBS），将载玻片置于湿盒中，室温孵育1.5小时。
   2. 向腔室的一个孔加入100 µL PBS，从另一孔吸出，然后向腔室中加入100 µL迁移缓冲液。将载玻片置于湿盒中，室温保存直至实验开始。
3. 准备流体系统。
   1. 接通流体泵电源，连接流体装置，启动泵软件。用5–10 mL迁移缓冲液冲洗管路一次，然后向两个储液器中各加入5.85 mL迁移缓冲液（共11.7 mL），并去除气泡。
   2. 在距连接件约10 cm处夹住管路。将流体装置放入显微镜的加热培养箱中。
   3. 在软件中将载玻片类型设置为“µ-slide VI 0.4”，管路类型设置为“white”。设定所需剪切应力（例如4 dyn cm^-2），成像时间为30分钟。
   4. 通过测定管路中液体流速（mL/min）来设定管路校准因子。测量2 mL缓冲液从一个储液器流至另一个所需时间，再除以2。为保证准确性，至少进行4次测量。将实际测得的流速输入泵软件，以设定所需的流速和剪切应力。
4. 准备成像系统。
   1. 将显微镜培养箱、流体装置及迁移缓冲液预温至37 °C（图2B）。通过观察迁移缓冲液在储液器中往复流动且系统内无气泡，测试流体泵是否正常工作。
5. 将细胞加载到载玻片上。
   1. 用蘸有乙醇的纸巾清洁载玻片底部。向腔室的一个孔中加入30 µL细胞悬液，并从另一孔吸出30 µL。盖上盖片，37 °C孵育30分钟，防止蒸发，使细胞贴附。
   2. 缓慢向流动腔室载玻片的每个孔中加入预温的迁移缓冲液，直至液面形成正弯月面，并用移液枪头去除任何气泡。
6. 将载玻片连接至流体装置。
   1. 将载玻片固定在显微镜载物台上。将流体管路未标记的一端从连接件上取下，用迁移缓冲液充满管路末端，直至无气泡的正弯月面从末端升起。
   2. 将管路末端翻转，插入流动腔室的上孔中，用纸巾吸去溢出的缓冲液。保持管路夹闭状态，对管路的标记端重复上述操作。
7. 对细胞进行成像。
   1. 将成像系统切换至“Live”模式，对细胞进行聚焦。选择位于载玻片中央的视野。轻微失焦，以增强细胞黑色轮廓并形成白色内部，便于在自动追踪程序中将图像阈值化为白背景上的圆形黑细胞。
   2. 启动成像序列程序，使用10倍干镜每5秒采集1张图像，持续30分钟。松开管路夹，开启泵，非贴壁细胞将被冲走，贴壁细胞则开始迁移。根据需要，使用10倍或更高倍物镜继续成像30分钟或更长时间。为视频命名并保存。
8. 将流体装置从载玻片上拆下。
   1. 成像程序结束后，重置泵以准备下一次实验：重新夹住管路，将管路从载玻片上取下，重新连接连接件，打开夹子，使用泵的手动控制功能将数毫升缓冲液从一个储液器推至另一个，以去除气泡。重新夹住管路，并将夹闭的管路放置在显微镜载物台上，以备下一段视频使用。
      注：此步骤可无限期暂停。若使用细胞迁移抑制剂或调节剂，根据其作用机制，可在细胞沉降前将其加入细胞悬液，或加入流体装置的迁移缓冲液中。

3. 迁移轨迹分析

注意：可使用 MTrack2 插件自动追踪细胞，或使用手动追踪插件进行人工追踪¹⁷。自动追踪方法适用于 MZB 细胞，因为这些细胞主要呈圆形，并在迁移过程中保持圆形，因此容易对图像进行阈值处理，使细胞在白色背景上呈现为黑色目标。若使用其他类型的细胞（例如培养的活化 CD8+ T 细胞），自动追踪则更为困难，因为这些细胞在迁移过程中会伸展并变得部分透明，难以界定其边缘。在此情况下，可采取以下任一方法：（1）用活体荧光染料对细胞染色，以获得可进行阈值处理的图像，使细胞在白色背景上显示为黑色目标；或（2）使用其他程序对细胞进行轮廓勾画，例如图像分割和/或边缘检测。当无法获得高对比度的细胞轮廓图像时，手动追踪是一种有效的替代方案。

1. 使用插件进行手动追踪。
   1. 在 ImageJ 中安装“手动追踪”插件，并在 ImageJ 中打开视频。在“手动追踪”菜单下选择“添加新轨迹”。当视频自动逐帧播放时，点击细胞的中心位置。当该细胞在每一帧中均被选中后，选择“添加新轨迹”以开始追踪另一个新细胞。
   2. 记录完轨迹后，将输出结果复制到数据电子表格中。将所有电子表格单元格的小数位数格式更改为小数点后零位。将文件另存为“制表符分隔”的 .txt 文件，用于后续分析。
      注意：通常追踪 50–100 个细胞，对于约 240 帧的 20 分钟视频，完成该过程大约需要 1 小时。
2. 使用 MTrack2 插件进行自动追踪。根据文件中的说明下载并安装 MTrack2 kt 插件（参见补充编码文件）。
   1. 对细胞迁移视频中的图像进行阈值处理。在 ImageJ 中打开图像堆栈。在 ImageJ 中处理图像，将视频从彩色图像转换为高对比度图像，使细胞以黑色物体的形式显示在白色背景上（图 3A）。
      1. 将图像锐化两次，去斑点，并将图像转换为 8 位。选择“图像 | 调整亮度/对比度”子菜单，将对比度滑块调至最大对比度，此时细胞将显示为黑色背景上的白色物体。然后选择“图像 | 调整阈值”子菜单，确保细胞以黑色物体的形式显示在白色背景上。
   2. 运行自动细胞追踪插件“MTrack2 kt”（参见补充编码文件）。在选项界面中设置以下参数。
      1. 对于 MZB 细胞，将粒子大小的最小值设为 1 像素，最大值设为 30 像素。
      2. 对于速度（视频连续帧中两个粒子之间的最大距离），如果载玻片上的细胞密度较高，应将此值设得较低，以避免轨迹从一个细胞“跳跃”到另一个细胞。对于 MZB 细胞，为捕获异常值，可将此值设为 10 像素，尽管 MZB 细胞在相隔 5 秒的连续帧中通常移动不超过 2 像素。
      3. 对于粒子必须存在的最少帧数（以进行追踪），对于 MZB 细胞，应将其设为视频的总帧数（例如，240），对应于每分钟 12 帧的 20 分钟视频。但如果细胞移动较快，在成像结束前已离开视野，则应将最少帧数设为小于视频总时长的值。例如，对于快速移动的 T 细胞，可将最少帧数设为相当于 5–10 分钟成像的帧数。
         注意：记录这些步骤（阈值处理和 MTrack2-kt）的宏，以自动化该部分流程并节省时间（参见 补充编码文件）。使用宏在 ImageJ 中自动追踪一段视频耗时不到一分钟。
   3. 将输出结果复制到数据电子表格中。将所有电子表格单元格的小数位数格式更改为小数点后零位。在电子表格中细胞轨迹的顶部添加一个空行，并删除“D”列。将文件另存为“制表符分隔”的 .txt 文件，用于后续在 Ibidi 趋化分析工具中的分析。
      注意：MTrack2 插件以 75 列并行的方式输出细胞轨迹。为了在 Ibidi 趋化分析工具中进行分析，细胞轨迹必须排列为单列。为此，已对 MTrack2 插件进行修改，使其可输出原始格式或单列格式 （图 3B）（参见用 Java 编写的补充编码文件“MTrack2 kt”）。 将 .java 文件复制到 ImageJ 插件文件夹中。在 ImageJ 中选择“插件 > 编译并运行"。重启 ImageJ 后，修改版的 MTrack2 插件将出现在插件菜单中。
3. 使用 Ibidi 趋化分析工具分析细胞轨迹，下载 Ibidi 趋化与迁移分析工具 v2.0（“独立版本”）并打开程序。
   1. 选择“导入数据”，并导航至 .txt 细胞轨迹文件。可同时选择多个文件。导入的文件将以红色显示在“数据集”面板中。选中所有文件，并在下方的“初始化”菜单中输入正确的值，以应用以下设置。
   2. 输入切片的精确数量或范围（即视频的帧数）。
   3. 在“校准”菜单（X/Y 校准）中输入像素大小。该信息可在视频的属性文件中找到。对于 MZB 细胞，使用了 10x 物镜，像素大小为 1.14 µm。在“校准菜单 | 时间间隔”中，输入视频中帧与帧之间的时间长度。
   4. 应用设置。选择“绘制数据”以查看轨迹图，并确认轨迹文件能够正常打开。此后，程序提供了多种可选功能，详见程序文档，包括根据不同的属性用不同颜色标记轨迹，以及显示速度、前向迁移指数、直接性等的个体或平均值（图 3B）。
      注意：MZB 细胞大约需要 10 分钟来检测并响应流动，推测是通过将整合素复合物极化至细胞迎流方向所致。迁移指数随时间变化的曲线图将显示初始阶段低于零的下降，对应于细胞最初暴露于流动的几分钟，随后逐渐上升，直至前向迁移指数变为正值。因此，除非该过程本身是研究重点，否则在最终计算中排除最初几分钟的数据可能是最优选择。

结果

我们采用上述方案比较了MZB细胞在无流动（0 dyn/cm²）和受剪切流作用（4 dyn/cm²）条件下于ICAM-1包被的载玻片上的迁移情况。细胞运动轨迹由MTrack2软件自动追踪，并将生成的轨迹文件叠加到无流动（0 dyn/cm²）和有流动（4 dyn/cm²）条件下的细胞迁移视频上，以显示轨迹的分布与形态（图4A）。随后将细胞轨迹导入Ibidi趋化分析工具（ICT）中，生成每段视频的轨迹图（图4B）。利用Chemotaxis工具中的“measured values”命令，分别计算两种条件下各4段视频中细胞轨迹的平均迁移指数（ICT中称为“FMIy”）、速度、直线性（ICT中称为“directness”）以及直线距离（ICT中称为“Euclidean distance”）。这些平均值随后被复制至GraphPad Prism软件中用于作图并计算统计学显著性（

讨论

本文介绍了一种分析细胞迁移的方法，这些细胞能够感知剪切流的力并响应性地改变其迁移行为。对边缘区B细胞（MZB）的分析显示，MZB可在ICAM-1上自发迁移，并在流动存在时逆流迁移。在我们之前的研究中，我们发现MZB在VCAM-1上不会逆流迁移，而是保持固定位置。小鼠脾脏边缘区主要表达ICAM-1，而红髓区域则同时含有ICAM-1和VCAM-1。根据这些数据可以推断，MZB在边缘区会逆流迁移，但在红髓中则不会。该结论通过体内实验得到了验证：具有黏附缺陷的MZB因流动的作用被错误地定位至脾脏红髓¹²。基于上述原因，即使本系统用于研究其他类型的细胞，MZB仍可作为测试本研究所述流动迁移系统的良好阳性对照。

该实验操作中最关键的环节是确保在载玻片上对细胞的处理保持一致性。由于细胞迁移的可量化特征取决于细胞与载玻片的黏附程度，任何导致细胞黏附性下降的因素都会使结果难以重复。细胞黏附性降低可能源于多个因素的不一致，包括迁移缓冲液或加热培养箱的温度（低温会降低黏附性）、细胞悬液中阳离子的浓度（阳离子影响整合素结合）、载玻片的操作方式（敲击或弯曲载玻...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
VWR 细胞筛，70 µm	VWR	10199-656
预分离滤器，30 µm	Miltenyi	130-095-823
MZB 和 FOB 细胞分离试剂盒	Miltenyi	130-100-366
B220 CD45R，克隆 RA3-6B2，FITC	Biolegend	103206
CD21 / CD35，克隆 7G6，APC	BD Biosciences	558658
CD23，克隆 B3B4，PE	Biolegend	101608
HBSS	Biochrom	L2035
D-PBS 1x	Gibco by Life Technologies	14190-094
BSA 白蛋白第 V 组分，无脂肪酸	Roth	"0052.3"
ICAM-1	R&D Systems	796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4，疏水性，未包被	Ibidi	80601
灌注套装，白色，50 cm，0.8 mm	Ibidi	10963
Ibidi 泵系统	Ibidi	10902