小鼠边缘区B细胞剪切流诱导迁移的体外分析

摘要

边缘区B细胞（MZBs）在剪切流的作用力下会重新调整其迁移路径，逆流而上。本实验方案展示了如何利用流体控制单元、泵、显微成像系统及免费软件来记录和分析细胞迁移过程。

摘要

边缘区B细胞（MZBs）是一类存在于小鼠脾脏边缘区的B细胞群体，该区域包绕着淋巴滤泡。为了到达滤泡区域，MZBs必须逆着血流的剪切力迁移。本文介绍了一种在体外分析这种剪切流诱导的MZBs迁移的方法。首先，从小鼠脾脏中分离出MZBs；其次，将MZBs接种于含有整合素配体的流动腔载玻片上，施加剪切流，并在显微镜下观察其迁移过程；第三，利用ImageJ软件中的MTrack2自动细胞追踪插件处理迁移细胞的图像，并使用Ibidi趋化分析工具对所得的细胞轨迹进行量化分析。迁移数据可揭示细胞移动的速度、转向频率、剪切流方向是否影响其迁移方向，以及参与该过程的整合素配体种类。尽管本研究使用的是MZBs，但该方法可轻松适用于任何对剪切力有响应的白细胞迁移分析。

引言

免疫细胞是人体内运动性最强的细胞，通常需要应对来自血液和淋巴流动的剪切力。然而，关于剪切力诱导白细胞迁移的研究相对较少^1,2,3,4,5。本文介绍了一种可靠且定量的体外分析免疫细胞对流动响应的实验方案。该实验无需自行加工组件，所有仪器和耗材均可通过商业途径获得。整个实验流程，包括细胞纯化和迁移分析，可在一天内完成。最后，尽管本文描述的是边缘区B细胞（MZBs）的迁移，但该方案可经调整后用于分析其他类型免疫细胞在逆流条件下的迁移行为。因此，利用该实验可系统性地在多种条件下全面分析各类白细胞的迁移特性。

边缘区B细胞（MZB）是一群B细胞，在小鼠中仅存在于脾脏，并在滤泡内部与边缘区之间穿梭^6,7,8,9。边缘区是一层约5–10个细胞厚度的免疫细胞层，包裹着滤泡，主要由MZB和巨噬细胞组成，同时也包含不变的....

方案

所有涉及动物使用的实验均已按照马格德堡大学医学部的各项指南，事先获得德国哈勒（萨克森-安哈尔特州）州行政管理局的批准。

1. MZB 细胞纯化

1. 分离白细胞。
   1. 处死一只8 至16周龄的小鼠，取出脾脏¹⁶。将脾脏置于5 mL冰浴细胞缓冲液[磷酸盐缓冲液（PBS）+ 0.5%无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）]中，使用组织解离仪或将脾脏用5 mL注射器的推杆轻轻研磨通过6孔板中的70 µm细胞筛网，进行组织解离。
   2. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。向组织解离管或6孔板中的尼龙筛网中再加入5 mL冰浴细胞缓冲液，收集残留细胞，并将此额外的5 mL细胞缓冲液连同细胞一并转移至同一锥形管中。在室温（RT，20 °C）下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。
2. 进行红细胞裂解。
   1. 将细胞沉淀重悬于1 mL已预热至室温的红细胞（RBC）裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl，10 mM KHCO₃，0.1 mM EDTA）中。再加入1.5 mL RBC裂解缓冲液，轻轻涡旋混匀。在室温（20 °C）下孵育总共2分钟（包括重悬沉淀所需时间）。
   2. 向细胞悬液....

结果

我们采用上述方案比较了MZB细胞在无流动（0 dyn/cm²）和剪切流（4 dyn/cm²）条件下于ICAM-1包被的载玻片上的迁移情况。使用MTrack2软件自动追踪细胞，并将生成的轨迹文件叠加到无流动（0 dyn/cm²）和有流动（4 dyn/cm²）条件下的细胞迁移视频上，以显示轨迹的分布和形态（图4A）。随后将细胞轨迹导入Ibidi趋化分析工具（ICT）中，生成每段视频的轨迹图（图4B）。利用ICT中的“测量值”命令，分别计算两种条件下各4段视频中细胞轨迹的平均迁移指数（ICT中称为“FMIy”）、速度、直线性（ICT中称为“directness”）以及直线距离（ICT中称为“Euclidean distance”）。然后将这些平均值复制到GraphPad Prism软件中用于作图并计算统计学显著性（图4C

讨论

本文介绍了一种分析细胞迁移的方法，这些细胞能够感知剪切流的力并响应性地改变其迁移行为。对边缘区B细胞（MZB）的分析显示，MZB可在ICAM-1上自发迁移，并在流动存在时逆流迁移。在我们之前的研究中，我们发现MZB在VCAM-1上不会逆流迁移，而是保持固定位置。小鼠脾脏边缘区主要表达ICAM-1，而红髓区域则同时含有ICAM-1和VCAM-1。根据这些数据可以推断，MZB在边缘区会逆流迁移，但在红髓中则不会。该结论通过体内实验得到了验证：具有黏附缺陷的MZB因流动的作用被错误地定位至脾脏红髓¹²。基于上述原因，即使本系统用于研究其他类型的细胞，MZB仍可作为测试本研究所述流动迁移系统的良好阳性对照。

该实验操作中最关键的环节是确保在载玻片上对细胞的处理保持一致性。由于细胞迁移的可量化特征取决于细胞与载玻片的黏附程度，任何导致细胞黏附性下降的因素都会使结果难以重复。细胞黏附性降低可能源于多个因素的不一致，包括迁移缓冲液或加热培养箱的温度（低温会降低黏附性）、细胞悬液中阳离子的浓度（阳离子影响整合素结合）、载玻片的操作方式（敲击或弯曲载玻.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
VWR 细胞筛，70 µm	VWR	10199-656
预分离滤器，30 µm	Miltenyi	130-095-823
MZB 和 FOB 细胞分离试剂盒	Miltenyi	130-100-366
B220 CD45R，克隆 RA3-6B2，FITC	Biolegend	103206
CD21 / CD35，克隆 7G6，APC	BD Biosciences	558658
CD23，克隆 B3B4，PE	Biolegend	101608
HBSS	Biochrom	L2035
D-PBS 1x	Gibco by Life Technologies	14190-094
BSA 白蛋白第 V 组分，无脂肪酸	Roth	"0052.3"
ICAM-1	R&D Systems	796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4，疏水性，未包被	Ibidi	80601
灌注套装，白色，50 cm，0.8 mm	Ibidi	10963
Ibidi 泵系统	Ibidi	10902