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方法文章

利用细菌病原体探究宿主在细胞和有机体水平的应答

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DOI：

10.3791/58775

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2019年2月22日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois College of Medicine

本文内容

摘要

我们描述了可用于分析宿主编码因子活性的体外和体内感染实验方法。

摘要

细菌病原体在进入真核细胞后，会采用多种策略以存活并增殖。所谓“胞质内”病原体（如Listeria monocytogenes、Shigella flexneri、Burkholderia pseudomallei、Francisella tularensis 和 Rickettsia spp.）通过物理和酶解方式降解初级液泡膜，从而进入感染细胞的胞质溶胶。一旦进入胞质溶胶，这些病原体不仅能够增殖，还能产生足够的机械力穿透宿主细胞的质膜，以感染新的细胞。本文展示了如何通过菌落形成单位实验和流式细胞术对单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes，Lm）细胞感染周期的这一终末步骤进行定量，并举例说明病原体和宿主编码因子如何影响该过程。我们还展示了体外培养细胞感染中Lm的感染动态与体内感染小鼠来源肝细胞的感染动态之间具有高度一致性。这些基于功能的检测方法相对简单，易于扩展，可用于发现调控真核细胞功能的调节因子的高通量筛选。

引言

基于感染的实验模型本质上具有挑战性，因其依赖于宿主和病原体的初始状态条件、病原体多样的感染策略，以及难以根据结果区分由病原体或宿主驱动的过程。Listeria monocytogenes（Lm）由于其遗传和微生物学上的可操作性、快速且高效的细胞内感染策略，以及其在细胞水平和个体水平上的感染表型之间关系相对清晰，已成为研究宿主防御反应的理想病原体。Lm的细胞感染过程可分为四个明确的阶段1：（i）细胞入侵，最终使Lm被包裹在液泡内；（ii）由Lm介导的液泡膜溶解，并将Lm释放至胞质溶胶中；（iii）在胞质溶胶内的复制；（iv）对质膜的物理穿透，导致邻近细胞的直接感染（如在上皮细胞层中），或在孤立细胞中将Lm释放到细胞外环境。这些阶段均由特定的Lm编码因子（称为“毒力因子”）促进，若这些因子缺失，会在细胞和动物模型中均导致感染缺陷。这种通用的感染策略已被多种所谓的“胞质内”病原体独立演化出来2。

菌落形成单位（CFU）实验被广泛用于评估体外（即细胞水平）和体内（即生物体水平）的感染结果。除了具有高灵敏度（尤其是对体内感染）外，CFU实验还能明确反映病原体的侵袭能力以及其在细胞内的存活与增殖情况。CFU实验已被广泛用于分析影响感染过程的单核细胞增生李斯特菌（Lm）和宿主细胞的相关因子。尽管以往的研究利用CFU实验深入揭示了细胞侵袭和胞质内复制过程，但据我们所知，CFU实验尚未被用于追踪Lm感染过程的第四阶段：细胞逃逸。本文介绍了一种相对简便的方法，可通过CFU实验（以及流式细胞术）监测细胞逃逸过程（下文简称为“逸出”），并举例说明病原体和宿主编码的因子如何调控Lm感染周期的这一阶段。对细胞内Lm感染周期终末阶段的分析，可能有助于发现更多与病原体及宿主细胞感染特异性相关的因子和生物学活动。

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方案

小鼠的处理遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的所有适当政府规定，符合人道主义原则，且本研究中动物使用已获得迈阿密大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 16-053）。

1. 准备细胞以进行感染

  1. 在含有10%胎牛血清的DMEM培养基（以下简称DMEM/FCS）中，使用125 mL细胞培养瓶和维持在37 °C、5% CO2条件下的细胞培养箱，培养小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7。
  2. 感染前一天，使用细胞刮刀从扩增用培养瓶中收集细胞，并转移至15 mL带螺帽的锥形离心管中。以800 × g 离心10分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL不含抗生素的DMEM/FCS中，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞滴度。
  3. 将细胞滴度调整至2 × 106 个细胞/mL，取0.10 mL（含2 × 105 个细胞）接种至48孔细胞培养板的各孔中。确保细胞悬液完全覆盖每个孔的表面。
    1. 在额外的孔中接种细胞，以备后续制备条件培养基使用。另在三个额外的孔中各加入0.10 mL DMEM/FCS，作为“无细胞对照”。
  4. 在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中过夜培养。次日，在细菌接种物配制完成并可使用前，不要将培养板从培养箱中取出。

2. 准备用于感染的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）

  1. 从新鲜划线的琼脂平板（<2天）上挑取单个单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌落，接种于2 mL脑心浸液（BHI）培养基中，于37 °C、130 转/分钟振荡条件下过夜培养。
  2. 次日，取0.10 mL过夜培养物加入2 mL预热的BHI培养基中，继续在37 °C、振荡条件下培养，直至其在600 nm处的光密度（OD600）达到0.4至0.6之间。
  3. 使用经验推导的换算公式估算细菌滴度。在本实验室中，处于对数生长期的Lm在BHI培养基中的浓度约为1.3 × 109菌落形成单位（CFU）/OD600。应尽量减少细菌培养物在室温下的暴露时间。
  4. 感染前，使用预热的DMEM/FCS培养基作为稀释液，将菌液滴度调整至5 × 107 CFU/mL。

3. 感染

  1. 迅速而精确地操作，将20 µL（1 × 106 CFU；感染复数，MOI = 5）新鲜制备的 Lm 接种液（见上述步骤2.4）加入孔中，方法为轻微倾斜培养皿，并将移液枪头小心插入上层培养基中；
    注意： 避免移液枪头接触孔壁。
  2. 轻柔吹打各孔内容物以确保充分混匀；切勿振荡或大幅倾斜培养板，以免将 Lm 扩散至孔壁。将细胞培养皿放回37 °C/5% CO2 培养箱中。
  3. 使用未感染孔中的条件培养基作为稀释液，配制10 µg/mL的庆大霉素溶液。
  4. 感染后30分钟（mpi），小心向每孔加入30 µL庆大霉素溶液（终浓度为2.5 µg/mL），并像之前一样轻柔吹打孔内液体，随后将细胞培养皿放回37 °C/5% CO2 培养箱中。
  5. 在60 mpi时，收获相应孔中的样本，用于CFU检测（60 mpi时间点）或流式细胞术（FCM）分析（分别见下文第4和第5节）。
  6. 对于其余孔，在此后不同时间点，可按前述方法收获细胞；或在进行 Lm 释放检测时，完全移除孔内培养基，并更换为150 µL不含庆大霉素的条件培养基。

4. 通过菌落形成单位（CFU）测定法对细胞内及释放的单核细胞增生李斯特菌（Lm）进行取样处理与分析

  1. 收获时，轻轻倾斜培养皿，小心移除孔中的全部培养基。向孔中加入 0.50 mL 无菌蒸馏水（dsH2O）。30 秒后，将所得的水裂解液（100）转移至 1.5 mL 微量离心管中，剧烈涡旋振荡 10 秒。
  2. 通过将 4.5 µL 或 50 µL 水裂解液分别加入 450 µL 的 dsH2O 中，制备 10-1 和 10-2 稀释液，并短暂涡旋以确保充分混匀。
  3. 取 50 µL 的 100、10-1 和/或 10-2 样品，涂布于 LB（Luria-Bertani）琼脂平板上。
  4. 为检测释放出的 Lm（见上述步骤 3.6），取出 10 µL 上层培养基，均分为两个 5 µL 的等分试样：向其中一个试样加入 5 µL DMEM/FCS，向另一个试样加入含 5 µg/mL 庆大霉素的 5 µL DMEM/FCS。后者作为对照，用于在后续的菌落形成单位（CFU）检测中区分细胞外 Lm（对庆大霉素敏感）与细胞内 Lm（对庆大霉素耐药）。
  5. 室温孵育 5 分钟后，加入 90 µL 的 dsH2O，剧烈涡旋振荡 10 秒，然后取 50 µL 涂布于 LB 琼脂平板上。
  6. 在 37 °C 条件下培养 2 天后，计数 LB 琼脂平板上的 Lm 菌落。

5. 通过流式细胞术（FCM）对胞内及外排的Lm进行取样处理与分析

  1. 按照步骤 1.1-4 所述方法准备 RAW 264.7 细胞。将细胞调整至 1 × 106 个细胞/mL，每孔加入 1 mL（即 1 × 106 个细胞）至 6 孔组织培养板中。
  2. 按照步骤 2.1-2.3 所述方法制备细菌接种物，并加入相应体积的接种物以达到感染复数（MOI）为 50（即 5 × 107 CFU）。
  3. 感染后 1.5 小时（hpi），收集第一组孔中的培养基，转移至含有 500 µL 4% 多聚甲醛（PFA）的 1.5 mL 微量离心管中，置于冰上，待所有孔处理完毕。
  4. 为收集细胞内 Lm，向孔中加入 1 mL 双蒸水（dsH2O），60 秒后将所得水裂解液转移至含有 500 µL 4% PFA 的 1.5 mL 微量离心管中。剧烈涡旋振荡 10 秒，置于冰上，待所有孔处理完毕。（样品处理详见下文步骤 5.8。）
  5. 对于其余孔，吸除培养基，更换为含 5 µg/mL 庆大霉素的 DMEM/FCS 培养基 1 mL，以杀灭细胞外的 Lm，并立即将细胞放回培养箱中继续培养。
  6. 30 分钟后（即 2 hpi），吸除培养基，更换为不含庆大霉素的 DMEM/FCS 培养基。
  7. 在感染后 2 小时和 4 小时（即 4 hpi 和 6 hpi），分别采集第二和第三个时间点的样品，方法同步骤 5.3 和 5.4，收集培养基和裂解液。
  8. 将离心管在 10,000 × g 条件下离心 7 分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
  9. 将每管沉淀重悬于染色混合液中（含 50 µL 4% PFA 和 15 µL 鬼笔环肽），避光于 4 °C 孵育 20 分钟。
  10. 孵育结束后，向每管加入 1 mL FACS 缓冲液，用移液器反复吹打混匀。
  11. 将离心管在 10,000 × g 条件下离心 7 分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
  12. 将每管沉淀重悬于 400 µL FACS 缓冲液中，用于立即检测；或重悬于 200 µL FACS 缓冲液和 200 µL 4% PFA 中，用于后续分析时保存。
  13. 将样品上流式细胞仪检测，并分析所获得的数据。

6. 样品处理与分析 Lm 肝脏中的定植与宿主反应

  1. 按照步骤 2.1–2.3 所述方法准备用于感染的 Lm。
  2. 计算获得目标滴度为 3 × 106 CFU/mL 所需的亚培养物用量。
  3. 在感染前，将计算量的细菌用预热的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）稀释至终体积为 1 mL。此即注射入小鼠的接种物。
  4. 使用 28 G½ 100U 胰岛素注射器吸取 100 µL（3 × 105 CFU）接种物，并去除任何可见气泡。
  5. 将小鼠（C57BL/6 品系；雄性，6 至 12 周龄）放入固定装置中，用温水（不超过 45 °C）扩张尾静脉，随后将接种物注入静脉。
  6. 将接种物进行 10-2 和 10-3 稀释后涂布于 LB 琼脂 10bcm 平板，37 °C 过夜培养，以确定实际接种剂量。
  7. 在感染后 18 小时（hpi），以人道方式处死小鼠（CO2 窒息后行颈椎脱位），使用无菌剪刀切开小鼠腹膜，分别使用不同的镊子和剪刀处理小鼠体外和体内组织，采集肝脏前叶。将肝脏置于冰上放置的 6 cm 培养皿中。
  8. 将肝脏切成小块，放入含磁力搅拌子的玻璃小瓶中。加入 2 mL 用不含 FCS 的 DMEM 重悬的 2 mg/mL 胶原酶 D。将小瓶置于 37 °C 磁力搅拌器上孵育 30–45 分钟。组织匀浆后，加入 3 mL DMEM/FCS 以灭活胶原酶。
  9. 将细胞通过 70 µm 细胞滤网过滤至锥形管中，必要时补充更多 DMEM/FCS。
  10. 在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 10 分钟使细胞成团，弃上清，用 500 µL ACK 缓冲液重悬细胞沉淀以裂解红细胞。
  11. 在室温下用 ACK 缓冲液孵育细胞 5 分钟，随后用 1 mL DMEM/FCS 重悬细胞。
  12. 在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 10 分钟使细胞成团，弃上清，用 1 mL DMEM/FCS 重悬细胞。然后使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
  13. 将 1 × 106 个细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中，离心成团。然后用 1 mL 去离子水（dsH2O）重悬并涡旋以裂解细胞。取 50 µL 未稀释及 10-2 稀释的样品涂布于 LB 平板，37 °C 培养以进行 CFU 分析并计数 Lm。
  14. 根据细胞计数结果，将 1 × 106 个细胞转移至每个组织样本对应的流式管（FACS 管）中，并用 1 mL FACS 缓冲液洗涤。
  15. 在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 10 分钟使细胞成团，弃上清。
  16. 根据每种抗体的推荐浓度和 FACS 缓冲液配制含有目标抗体的抗体混合液。参见材料表中分析所用的推荐用量。
  17. 用 100 µL 抗体混合液重悬细胞沉淀，在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  18. 孵育结束后，向每管中加入 2 mL FACS 缓冲液并重悬细胞。
  19. 在 4 °C 条件下以 800 × g 离心使细胞成团，弃上清。然后用 400 µL FACS 缓冲液重悬细胞，用于立即检测；或用 200 µL FACS 缓冲液和 200 µL 4% 多聚甲醛（PFA）重悬，用于后续保存。
  20. 通过流式细胞术分析细胞（参见步骤 5.13）。

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结果

评估病原体和宿主编码因子在细胞感染中的作用
使用上述感染条件，在与培养的巨噬细胞共孵育1.5小时后，可回收0.15%的输入野生型Lm（图1A）。在随后的1.5小时共孵育期间（感染后3小时，hpi），可回收的活Lm增加了4倍；从3小时到6小时（hpi），活Lm的回收量进一步增加了7.5倍。由于在感染后1小时（hpi）向共培养体系中添加了不能穿透细胞的抗生素庆大霉素，以清除细胞外的Lm，因此在1.5至6 hpi期间活Lm水平增加30倍完全代表了其在细胞内的增殖。

Lm 在被真核细胞内化后可迅速进入细胞质（见引言）。进入细胞质的 Lm 会与肌动蛋白聚合机制结合，借此推...

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讨论

由于单核细胞增生李斯特菌（Lm）具有快速且高效的细胞感染程序，因此它是研究影响感染过程的宿主细胞活动的理想病原体。已有大量宿主因子被发现可正向或负向调控Lm的细胞感染11,12,13,14。我们实验室已鉴定出其中两种宿主因子——穿孔素-2（Perforin-2）和血红素调节抑制因子（Heme Regulated Inhibitor，分别简称为P2和hI），它们分别调控Lm感染过程中的不同特征。如图3所示，P2缺陷型细胞对Lm高度易感，P2基因敲除小鼠也表现出增强的易感性4。对表达P2与缺乏P2的巨噬细胞进行的详细比较研究表明，后者会形成高度酸化的含Lm吞噬体，从而导致毒力基因表达增强。进一...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACK裂解缓冲液Gibco A1049201
ArC胺反应性补偿微珠 Life TechnologiesA10346
BHI（脑心浸液）肉汤EMD Milipore110493
细胞筛，70 µmVWR10199-656
胶原酶DRoche11088858001
DMEM培养基 Gibco 11965-092
FACS管 BD Falcon352054
FBS－热灭活 Sigma-AldrichF4135-500ML
Hanks’平衡盐溶液Sigma-AldrichH6648-6X500ML
LB琼脂Grow Cells MSMBPE-4040
LIVE/DEAD可固定黄色死细胞染色试剂盒 Life TechnologiesL349S9
罗丹明鬼笔环肽 Thermo FischerR415
SP6800光谱分析仪Sony
注射器 28G 1/2" 1ccBD329461
TPP组织培养48孔板 MIDSCITP92048
TPP组织培养6孔板 MIDSCITP92406
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
抗原
CD11b Biolegend荧光染料 = PE Cy5，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = M1/70
CD11cBiolegend荧光染料 = AF 647，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = N418
CD45Biolegend荧光染料 = APC Cy7，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = 30-F11
F4/80Biolegend荧光染料 = PE，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = BM8
活/死细胞染色Invitrogen荧光染料 = AmCyN，稀释倍数 = 1/100
Ly6CBiolegend荧光染料 = PacBlue，稀释倍数 = 1/200，克隆号 = HK1.4
MHC IIBiolegend荧光染料 = AF 700，稀释倍数 = 1/200，克隆号 = M5/114.15.2
NK 1.1Biolegend荧光染料 = BV 605，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = PK136

参考文献

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