方法文章

细菌病原体在细胞和有机水平宿主反应探针中的应用

DOI：

10.3791/58775

⸱

2019年2月22日

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1Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois College of Medicine

本文内容

摘要

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我们描述了可用于分析主机编码因子活性的体外和体内感染检测。

摘要

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细菌病原体有多种策略, 一旦在真核细胞中存活和增殖。所谓的 "细胞增生李斯特菌" 病原体(单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、假克氏菌、杜拉伦斯法郎和环结节) 可进入受感染的细胞溶胶。物理和酶降解的主要空泡膜。一旦进入细胞溶胶, 这些病原体既会增殖, 又会产生足够的机械力, 穿透宿主细胞的质膜, 从而感染新的细胞。在这里, 我们展示了 l . 单核细胞基因 (lm) 细胞感染周期的这一结束步骤如何通过成菌性系和流式细胞术来量化, 并举例说明病因和宿主编码因素是如何影响这一点的。过程。我们还显示了体外感染的培养细胞的 lm 感染动力学与体内感染小鼠的肝细胞的lm感染动力学的密切对应关系。这些基于功能的检测相对简单, 可以很容易地扩展到基于发现的高通量屏幕的真核细胞功能的调制器。

引言

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基于感染的实验模型具有内在的挑战性, 因为它们依赖于宿主和病原体的起始状态条件、各种病原体感染策略以及难以归因病原和宿主驱动的过程基于结果。单核细胞增生李斯特菌(lm) 由于其遗传和微生物的可追踪性、快速和持续的细胞感染策略以及相对清晰的特性, 已成为一种理想的病原体, 可以探测宿主防御反应。其纤维素和有机水平的感染表型之间的关系。lm的细胞感染通过四个不同的阶段1: (i) 细胞入侵, 结束与lm被封闭在一个液泡内;(二) 以lm为导向溶解液泡膜, 并将lm 释放到细胞溶胶中;(iii) 组织内的复制;(iv) 质膜的物理渗透, 导致直接相邻的细胞 (如上皮细胞) 的感染, 或在单生细胞中, 将lm释放到细胞外环境中。每个阶段都是由特定的 lm编码因素 (称为 "毒力因素") 推动的, 这些因素一旦被删除, 会导致细胞和动物模型的感染缺陷。这种一般的感染策略是由一些所谓的 "细胞质" 病原体2独立进化而来的。

菌落形成单元 (cfu) 检测被广泛用于评估体外 (即细胞) 和体内 (即有机) 感染结果。除了高灵敏度, 特别是对体内感染, cfu 检测提供了一个明确的读数病原体入侵和细胞内存活/增殖。cfu 检测已被广泛用于分析影响感染的

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方案

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根据所有适当的政府关于美国国立卫生研究院实验动物护理和使用的准则, 对老鼠进行了人道的治疗, 迈阿密大学动物护理机构批准了它们的使用和使用委员会 (议定书 16-053)。

1. 准备感染细胞

  1. 在 dmem 组织培养基中传播小鼠巨噬细胞样细胞系 raw 264.7, 辅以10% 的胎儿小牛血清 (以下简称 dmemce/fcs), 使用125ml 瓶和组织培养孵化器保持在 37°c% co2.
  2. 感染前一天, 使用细胞刮刀从膨胀瓶中取出细胞, 并收集在一个15毫升的螺帽锥形管。以 800 x克离心细胞 10分钟, 下液上清液, 并在 dmem/fcs (不含抗生素) 1 毫升中悬浮细胞颗粒, 并使用血细胞仪或自动细胞计数器测定滴度。
  3. 将滴度调整为 2 x10 6 cells/mL, 并在48井组织培养皿的井中加入 0.10 ml (2 x10 5 细胞)。确保细胞悬浮液覆盖了井的整个表面。
    1. 板细胞在另外的井为被适应的媒介的最新来源。此外, 还将 dmem任何 fcs 的 0.10 ml 放入另外三口井中, 作为 "无细胞控制"。
  4. 在 37°c% co-2的组织培养孵化器中孵育一夜。第二天, 在接种细菌准备好并准备使....

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结果

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评估病原体和宿主编码因素对细胞感染的影响
使用上述感染条件, 在与培养的巨噬细胞共同培养1.5 小时后, 将有0.15 的输入野生类型lm恢复 (图 1a)。在随后的1.5 小时共同孵化 (感染后 3小时, hpi) 中, 可行的lm的恢复增加了 4倍, 从 3 hpi 增加了4倍到 6 hpi, 存活可行的lm的恢复又增加了7.5倍。由于细胞不溶于细胞的抗生素庆相in 在 1 hpi 的共培养中被添加, 以消除细胞外的lm, 因此1.5 到 6 hpi 之间的活lm水平增加了 30倍, 这完全代表细胞内的增殖。

lm在真核细胞内化后迅速获得对细胞溶胶的访问 (见导言)。胞嘧啶

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讨论

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由于其快速和持续的细胞感染计划, lm是一个理想的病原体, 探索细胞活动, 影响感染。已经确定了一些对lm细胞感染 11、12、13、14的积极或消极影响的宿主因素。在我们的实验室中表征的两个这样的宿主因子, 即 Perforin-2 和 heme 管制抑制剂 (p2 和 hi), 调节了 lm感染过程的显著特征。如图 3所示, p2 缺乏细胞对lm极易受到影响, 这种增强的敏感性也适用于 p2 敲除小鼠4。对 p2 表达和缺乏 p2 的巨噬细胞进行的详细比较研究表明, 后者形成了高度酸化的含lm的噬菌体, 从而增强了毒力基因的表达。差异毒力基因表达有助于增强 p2 缺乏巨噬细胞易感性的假.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACK 裂解缓冲液Gibco 
ArC 胺反应性补偿微珠 Life TechnologiesA10346
BHI （脑心输液） 肉汤EMD Milipore 110493
细胞过滤器，70 µmVWR10199-656
胶原酶 D罗氏11088858001
DMEM 培养基 Gibco 公司 11965-092
FACS 管 BD Falcon352054
FBS - 热灭活 Sigma-AldrichF4135-500ML
汉克斯平衡盐溶液Sigma-AldrichH6648-6X500ML
LB 琼脂生长细胞 MSMBPE-4040
LIVE/DEAD 可固定黄色死细胞染色试剂盒 Life TechnologiesL349S9
罗丹明鬼笔环肽 Thermo FischerR415
SP6800 光谱分析仪索尼
注射器 28 G 1/2" 1ccBD329461
TPP 组织培养 48 孔板 MIDSCITP92048
TPP 组织培养 6 孔板 MIDSCITP92406
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
Antigen
CD11b Biolegend荧光染料 = PE Cy5，稀释度 = 1/100，克隆 = M1/70
CD11cBiolegend荧光染料 = AF 647，稀释度 = 1/100，克隆 = N418
CD45Biolegend荧光染料 = APC Cy7，稀释度 = 1/100，克隆 = 30-F11
F4/80Biolegend荧光染料 = PE，稀释度 = 1/100，克隆 = BM8
活/死Invitrogen荧光染料 = AmCyN，稀释度 = 1/100
Ly6CBiolegend荧光染料 = PacBlue，稀释度 = 1/200，克隆 = HK1.4
MHC IIBiolegend荧光染料 = AF 700，稀释度 = 1/200，克隆 = M5/114.15.2
NK 1.1Biolegend荧光染料 = BV 605，稀释度 = 1/100，克隆 = PK136
A1049201

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
  2. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular ....

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