我们描述了可用于分析宿主编码因子活性的体外和体内感染实验方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细菌病原体在进入真核细胞后，会采用多种策略以存活并增殖。所谓“胞质内”病原体（如Listeria monocytogenes、Shigella flexneri、Burkholderia pseudomallei、Francisella tularensis 和 Rickettsia spp.）通过物理和酶解方式降解初级液泡膜，从而进入感染细胞的胞质溶胶。一旦进入胞质溶胶，这些病原体不仅能够增殖，还能产生足够的机械力穿透宿主细胞的质膜，以感染新的细胞。本文展示了如何通过菌落形成单位实验和流式细胞术对单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes，Lm）细胞感染周期的这一终末步骤进行定量，并举例说明病原体和宿主编码因子如何影响该过程。我们还展示了体外培养细胞感染中Lm的感染动态与体内感染小鼠来源肝细胞的感染动态之间具有高度一致性。这些基于功能的检测方法相对简单，易于扩展，可用于发现调控真核细胞功能的调节因子的高通量筛选。
引言
基于感染的实验模型本质上具有挑战性，因其依赖于宿主和病原体的初始状态条件、病原体多样的感染策略，以及难以根据结果区分由病原体或宿主驱动的过程。Listeria monocytogenes（Lm）由于其遗传和微生物学上的可操作性、快速且高效的细胞内感染策略，以及其在细胞水平和个体水平上的感染表型之间关系相对清晰，已成为研究宿主防御反应的理想病原体。Lm的细胞感染过程可分为四个明确的阶段1：（i）细胞入侵，最终使Lm被包裹在液泡内；（ii）由Lm介导的液泡膜溶解，并将Lm释放至胞质溶胶中；（iii）在胞质溶胶内的复制；（iv）对质膜的物理穿透，导致邻近细胞的直接感染（如在上皮细胞层中），或在孤立细胞中将Lm释放到细胞外环境。这些阶段均由特定的Lm编码因子（称为“毒力因子”）促进，若这些因子缺失，会在细胞和动物模型中均导致感染缺陷。这种通用的感染策略已被多种所谓的“胞质内”病原体独立演化出来2。
菌落形成单位（CFU）实验被广泛用于评估体外（即细胞水平）和体内（即生物体水平）的感染结果。除了具有高灵敏度（尤其是对体内感染）外，CFU实验还能明确反映病原体的侵袭能力以及其在细胞内的存活与增殖情况。CFU实验已被广泛用于分析影响感染过程的单核细胞增生....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
小鼠的处理遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的所有适当政府规定，符合人道主义原则，且本研究中动物使用已获得迈阿密大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 16-053）。
1. 准备细胞以进行感染
- 在含有10%胎牛血清的DMEM培养基（以下简称DMEM/FCS）中，使用125 mL细胞培养瓶和维持在37 °C、5% CO2条件下的细胞培养箱，培养小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7。
- 感染前一天，使用细胞刮刀从扩增用培养瓶中收集细胞，并转移至15 mL带螺帽的锥形离心管中。以800 × g 离心10分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL不含抗生素的DMEM/FCS中，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞滴度。
- 将细胞滴度调整至2 × 106 个细胞/mL，取0.10 mL（含2 × 105 个细胞）接种至48孔细胞培养板的各孔中。确保细胞悬液完全覆盖每个孔的表面。
- 在额外的孔中接种细胞，以备后续制备条件培养基使用。另在三个额外的孔中各加入0.10 mL DMEM/FCS，作为“无细胞对照”。
- 在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中过夜培养。次日，在细菌接种物配制完成并可使用前....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
评估病原体和宿主编码因子在细胞感染中的作用
使用上述感染条件，在与培养的巨噬细胞共孵育1.5小时后，可回收0.15%的输入野生型Lm（图1A）。在随后的1.5小时共孵育期间（感染后3小时，hpi），可回收的活Lm增加了4倍；从3小时到6小时（hpi），活Lm的回收量进一步增加了7.5倍。由于在感染后1小时（hpi）向共培养体系中添加了不能穿透细胞的抗生素庆大霉素，以清除细胞外的Lm，因此在1.5至6 hpi期间活Lm水平增加30倍完全代表了其在细胞内的增殖。
Lm 在被真核细胞内化后可迅速进入细胞质（见引言）。进入细胞质的 Lm 会与肌动蛋白聚合机制结合，借此推.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于单核细胞增生李斯特菌（Lm）具有快速且高效的细胞感染程序，因此它是研究影响感染过程的宿主细胞活动的理想病原体。已有大量宿主因子被发现可正向或负向调控Lm的细胞感染11,12,13,14。我们实验室已鉴定出其中两种宿主因子——穿孔素-2（Perforin-2）和血红素调节抑制因子（Heme Regulated Inhibitor，分别简称为P2和hI），它们分别调控Lm感染过程中的不同特征。如图3所示，P2缺陷型细胞对Lm高度易感，P2基因敲除小鼠也表现出增强的易感性4。对表达P2与缺乏P2的巨噬细胞进行的详细比较研究表明，后者会形成高度酸化的含Lm吞噬体，从而导致毒力基因表达增强。进一.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| ArC胺反应性补偿微珠 | Life Technologies | A10346 | |
| BHI（脑心浸液）肉汤 | EMD Milipore | 110493 | |
| 细胞筛，70 µm | VWR | 10199-656 | |
| 胶原酶D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965-092 | |
| FACS管 | BD Falcon | 352054 | |
| FBS－热灭活 | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB琼脂 | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD可固定黄色死细胞染色试剂盒 | Life Technologies | L349S9 | |
| 罗丹明鬼笔环肽 | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800光谱分析仪 | Sony | ||
| 注射器 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP组织培养48孔板 | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP组织培养6孔板 | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| 抗原 | |||
| CD11b | Biolegend | 荧光染料 = PE Cy5，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | 荧光染料 = AF 647，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = N418 | |
| CD45 | Biolegend | 荧光染料 = APC Cy7，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | 荧光染料 = PE，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = BM8 | |
| 活/死细胞染色 | Invitrogen | 荧光染料 = AmCyN，稀释倍数 = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | 荧光染料 = PacBlue，稀释倍数 = 1/200，克隆号 = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | 荧光染料 = AF 700，稀释倍数 = 1/200，克隆号 = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | 荧光染料 = BV 605，稀释倍数 = 1/100，克隆号 = PK136 |
参考文献
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
