用奇米蛋白构建功能蛋白区的鉴定

摘要

结构上相关的蛋白质经常发挥不同的生物学功能。交换这些蛋白质的等效区域, 以创造嵌合蛋白是一种创新的方法, 以确定关键的蛋白质区域, 负责其功能分化。

摘要

该协议的目标包括设计嵌合蛋白, 在这种蛋白质的不同区域被结构相似的蛋白质中的相应序列所取代, 以确定这些区域的功能重要性。这种嵌合体是通过嵌套 pcr 协议产生的, 该协议使用重叠的 dna 片段和经过充分设计的引物, 然后在哺乳动物系统中表达, 以确保本地二级结构和翻译后的修饰。

然后, 在适当的读出分析中, 嵌合体的活性丧失表明了不同区域的功能作用。因此, 确定了隐藏一组关键氨基酸的区域, 这些区域可以通过互补技术 (例如位向诱变) 进一步筛选, 以提高分子分辨率。虽然仅限于可以发现功能不同的结构相关蛋白质的情况, 但嵌合蛋白已被成功地用于识别蛋白质 (如细胞因子和细胞因子受体) 中的关键结合区域。这种方法特别适用于蛋白质的功能区域没有得到很好界定的情况, 是定向进化方法的宝贵的第一步, 目的是缩小感兴趣的区域, 减少所涉及的筛选工作。

引言

几种类型的蛋白质, 包括细胞因子和生长因子, 被分组在家庭的成员有相似的三维结构, 但往往发挥不同的生物功能^1,2。这种功能多样性通常是分子活性位点3中氨基酸组成差异小的结果^.确定这些位点和功能决定因素不仅提供了宝贵的进化见解, 而且还设计了更具体的激动剂和抑制剂⁴。然而, 在与结构相关的蛋白质之间经常发现的残留物成分的大量差异使这项任务变得复杂。尽管构建包含数百个突变体的大型库现在是可行的, 但评估每一个残留物的变化和组合仍然是一项具有挑战性和耗时的工作⁵。

因此, 评估大型蛋白质区域的功能重要性的技术对于将可能的残留物数量减少到可管理的第6种是有价值^的.截断蛋白一直是解决这一问题最常用的方法。因此, 如果所研究的蛋白质功能受到特定区域^7、8、9的删除的影响, 则区域在功能上被认为是相关的。然而, 这种方法的一个主要局限性是, 缺失会影响蛋白质的二级结构, 导致错误折叠、聚集和无法研究预期的区域。一个很好的例子是细胞因子在成本蛋白 m (osm) 上的截断版本, 其中一个内部删除大于7个残留物导致一个错误折叠的突变体, 不能进一步研究¹⁰。

嵌合蛋白的产生是一种替代和创新的方法, 允许分析更大的蛋白质区域。这种方法的目的是通过另一种蛋白质中与结构相关的序列交换对蛋白质感兴趣的区域, 以评估被替换的部分对特定生物功能的贡献。在信号受体领域广泛用于识别功能域^11,12, 嵌合蛋白是特别有用的研究蛋白质家族的氨基酸认同少, 但保守的二级结构。在白细胞介素-6 (il-6) 类细胞因子类中可以找到适当的例子, 如白细胞介素-6 和睫毛神经营养因子 (6% 序列识别)¹³或白血病抑制因子 (lif) 和 osm (20% 身份)⁶, 其中下面的协议是基于。

方案

1. 奇美蛋白设计

1. 选择合适的蛋白质 (供体) 与感兴趣的蛋白质 (接受者) 交换区域捐献者蛋白应该在结构上相似, 理想的情况下属于同一个蛋白质家族, 但缺乏生物活性作为读出。如果不知道与结构相关的蛋白质, 则可以使用自动工具 (如矢量对齐搜索工具 (vast)^14、15)来识别潜在的候选元素
   1. 访问蛋白质数据库 (pdb)¹⁶欧洲网站 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), 在右上角的搜索框中介绍感兴趣的蛋白质名称, 然后单击 "搜索"。只要有晶体结构, 而不是向下的 pdb 标识符 (pdb id;例如, osm 的 1evs)。
      注: 如果 pdb 中没有结构数据, 则可能会使用可用的分步协议 18, 由 swiss-model¹⁷等工具生成蛋白质的同源模型^.
   2. 访问 fast 网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml)。如果 pdb id 可用, 请向下滚动到 "检索预先计算的结果" 部分, 将 pdb id 输入到 "显示类似结构" 框中, 然后单击 "go"。在下面的屏幕中, 点击 "原始 fast", 然后点击 "整个链", 查看潜在的结构相似的候选项的 pdb id 列表。
      1. 如果 pdb id 不可用, 但生成了同源模型, 请向下滚动到 "使用新结构搜索" 部分, 然后单击 "vast 搜索" 链接。通过单击 "提交 pdb 文件" 旁边的 "浏览", 选择该文件并单击 "提交", 上传模型的 pdb 文件。
      2. 上传 pdb 文件后, 单击 "开始" 按钮开始 "viast 计算"。一旦进行计算, 点击 "整个链" 下的域, 以查看 pdb id 的结构相似的蛋白质。
   3. 评估顶级候选的生物功能 (例如受体激活、酶活性、转录因子活性), 或者在选择的读出系统中进行实验, 或者通过文献搜索。选择具有发散功能的供体蛋白, 与感兴趣的蛋白质进行比较。
2. 从参考序列 (refseq) 数据库¹⁹中获取受体和供体蛋白的蛋白质氨基酸序列。
   1. 访问 refseq 网页 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) 中的基因部分, 在搜索框中键入感兴趣的蛋白质的名称, 然后单击 "搜索"。单击生成列表中所需物种的基因名称。
   2. 向下滚动到 refseq 部分, 查看所有记录的异形。单击感兴趣的异形的序列标识符 (从 nm 开始), 向下滚动并单击 "cds" 以突出显示该基因的蛋白质编码区域。在屏幕右下角, 点击 "fasta" 并复制基因序列。
   3. 使用合适的 dna 编辑软件保存 dna 序列。使用免费提供的 ape²⁰时, 打开程序, 将复制的序列粘贴到空白框中, 选择序列名称, 然后单击 "保存"。
      注: 重复步骤1.2.1。1.2.3。为选择的一个或多个供体蛋白。
3. 选择要在不同嵌合结构中替换的蛋白质区域。
   1. 在不同的结构区域划分感兴趣的蛋白质序列。理想情况下, 有关蛋白质的不同领域将在文献中描述。如果不是这样, 则应1.3.1.1 的步骤来评估是否存在明显的保守结构特征 (螺旋、循环)。1.3.1.4。
      1. 从 pdb 网站下载感兴趣的蛋白质的结构数据 (参见步骤 1.1.1)。访问蛋白质的 pdb 页面, 并通过单击屏幕右侧的 "下载" 下载 pdb 文件。
      2. 在像 pymol (https://pymol.org/) 这样的分子可视化系统中打开 pdb 文件。在 pymol 中, 显示核苷酸序列 (通过单击 "显示 > 序列"), 隐藏默认结构数据 (通过单击 pdb id 旁边的 h, 然后选择 "所有内容"), 然后选择 "卡通" 视图以清晰地显示蛋白质的结构功能 (单击 pdb id 旁边的 s, 然后选择 "卡通")。
      3. 点击屏幕顶部的核苷酸序列, 突出显示分子的不同部分, 记下与每个独特的结构特征相对应的氨基酸。
   2. 在 ape 的 dna 序列上注释不同的结构区域。为此, 请从步骤 1.2.3. 中打开 dna 序列, 选择区域中氨基酸的核苷酸编码, 右键单击所选内容, 然后选择 "新功能" 以为其命名和颜色。对上一步中确定的每个结构区域重复此过程。
      注: 可以通过单击 orf > 翻译, 然后单击 "确定" 来重复检查核苷酸的选择, 以确保它们编码正确的氨基酸序列。
   3. 使用蛋白质对齐工具 (例如簇欧米茄²¹) 对齐这两种蛋白质的残留序列。
      注: 由于嵌合体是在哺乳动物表达系统中产生的, 这些序列应包括蛋白质的信号肽。
      1. 通过打开步骤1.2.3 的 dna 序列, 选择它们并单击 orf > 翻译, 获得出整个器官蛋白和受体蛋白序列。
      2. 访问集群欧米茄网页 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) 并输入这两种蛋白质的氨基酸序列, 然后向下滚动并单击 "提交"。每个序列都应该用一个文本行进行处理, 并有 "> 的" 蛋白名称 ", 以便正确识别。
      3. 通过单击 "下载对齐文件" 选项卡并将其保存来检索对齐文件。此文件可以由任何文本编辑程序打开。
      4. 使用对齐文件作为参考, 在其 dna 序列中注释供体蛋白的相应结构区域 (参见步骤 1.3.2.)。
   4. 确定在嵌合蛋白中交换哪些蛋白质区域, 并为嵌合体设计适当的核苷酸序列。
      注: 在没有关于不同区域的功能重要性的详细信息的情况下, 建议选择较大的替代品, 如整个循环或螺旋, 以评估其中哪些替换对蛋白质功能有影响。第一次探索性实验之后, 可以进行第二轮嵌合蛋白设计, 重点是相关区域内的较小替代。
      1. 创建从步骤1.3.2 的受体蛋白的注释 dna 序列的副本。并将其重命名为嵌合体蛋白。在 ape 中打开重命名的 dna 序列, 选择并删除要交换的区域的核苷酸序列编码, 并将其替换为供体蛋白中的相应区域 (从步骤1.3.3 中创建的注释序列复制), 然后保存更改。
         注: 创建一个新副本, 并对设计的每个不同的嵌合体重复此步骤。

2. 分子克隆的制备

1. 选择适合于表达系统选择的质粒载体。对于哺乳动物的表达, 推荐一种高表达载体, 如 pCAGGS²²或 pCAGGS 载体系列。
   1. 对于本协议中显示的基于酶的限制性克隆, 请确保载体的多个克隆位点 (mcs) 中存在的唯一限制位点与感兴趣的蛋白质兼容。为此, 请使用 ape 打开嵌合结构的 dna 序列, 单击 "酶 > 酶选择器", 并验证 mcs 中至少有两个限制站点不存在于序列中 (在其名称旁边显示零)。
2. 使用 dna 编辑器 (如 ape) 设计终端引物。
   1. 创建一个新的 dna 文件 (文件 > 新), 并启动 n 终端引物与引线序列 (3-9 额外的碱基对,如aagggaaa), 然后是在矢量的 mcs 中选择的第一个限制站点 (6-8 碱基对,例如ttaattaa 为 paci),可选的间隔器 (例如, 示例中使用的 pCAGGS 载体中的 gcaggcaccccac) 和感兴趣基因的初始18-27 碱基对 (例如, 用于 osm 的 agggggtctcacagaggagac)。
   2. 在一个新的 dna 文件中, c 端引物序列从感兴趣基因的最后18-27 碱基对开始 (例如,对于带有 6xhistidine c 端标记的基因), 然后是一个可选的间隔器 (例如, taccggccc 中的一个选择的第二个限制站点 (例如, 用于 asci 的 ggcccgccc) 和引线序列 (例如aagggaaa)。突出显示整个序列, 右键单击并选择 "反向补货" 以获得反向底漆。
3. 为嵌合构造中的每个边框区域设计引物。
   1. 打开嵌合体的 dna 序列 (在步骤1.3.4.1 中创建), 并突出显示原始序列和插入序列接触区域中的30个碱基对区域, 包括每个序列的15个碱基对。复制区域 (右键单击并选择 "复制"), 并将其粘贴到新的 dna 文件中;这个序列将是正向引物。
   2. 制作上一步中生成的正向引物的副本, 并将其重命名为反向引物。突出显示引物序列, 右键单击并选择 "反向补全" 以生成反向引物序列。
   3. 重复步骤2.3.1。和2.3.2。嵌合体 dna 序列中的每个接触区。通常, 需要两组正向反向引物来生成一个嵌合体, 除非更换发生在 n 端子或 c 端子区域。
4. 从寡核苷酸合成提供商处订购端子和内部引物。
   备注:使用高度纯化的终端引物 (例如hplc 纯化) 可对协议的成功率产生积极影响。脱盐的内引物通常能提供良好的效果。
5. 获取供体和受体基因的模板序列。
   注: 使用包含这些序列的开放读取帧 (orf) 的质粒作为模板, 极大地简化了过程, 建议使用。或者, 从已知表达这些基因的细胞系生成的互补 dna (cdna) 可以作为后续步骤的模板。

3. 聚合酶链反应 (pcr) 单个 dna 片段的扩增形成的 chimera

1. 为构成嵌合蛋白的每个片段准备一个单独的 pcr 反应混合物。一个典型的嵌合蛋白将需要三个单独的片段: n 末端部分、要插入的区域和 c 末端部分。
   备注:使用高保真 dna 聚合酶 (例如, 普辛高保真 dna 聚合酶), 以避免在序列中引入突变。pcr 反应可以在晚上建立, 一夜运行。
   1. 按照表 1所示的顺序在冰上设置 1.5 ml 微泡管, 并将 pcr 混合物的不同试剂进行移液, 确保每个 pcr 反应都采用正确的引物和模板 (见表 2)。
   2. 为每个反应标记两个薄壁 0.2 ml pcr 管, 并在每个管中传输相应 pcr 混合物的20μl。将 pcr 管转移到 pcr 热环素中, 并启动表 3中详述的协议。
      注: 退火温度应至少低于设计引物的熔融温度5度。
2. 在 pcr 运行时, 在醋酸酯-edta (tae) 缓冲液中制备1% 琼脂糖凝胶的100毫升。为此, 称重1克琼脂糖, 在玻璃烧瓶中与100毫升的 tae 缓冲液混合, 然后用微波炉搅拌, 直到琼脂糖完全溶解, 每30-40秒旋转一次烧瓶。允许冷却到大约 50°c, 加入2-3 微米的溴化乙酯 (或等效的 dna 染料), 然后用所需的井梳子倒在凝胶托盘中。
   注意:溴化乙酯是一种已知的诱变剂, 确保使用适当的防护设备。
3. pcr 反应完成后, 在每个管中加入4μl 的 6x dna 加载缓冲液。将1% 琼脂糖凝胶插入电泳单元中, 盖上 tae 缓冲液, 并小心地将样品与分子量阶梯一起加载到凝胶中。
   注: 在装载时, 最好在样品之间留出空道, 以方便 dna 恢复之后。
4. 在 80-120 v 的情况下运行凝胶20-45。
   注: 1, 000个基对以下的波段通常可以在 120 v 的20分钟左右进行电泳, 而较大的波段将需要更长的运行时间。
5. 关闭电泳装置, 取出琼脂糖凝胶, 并在紫外线下显示放大的 dna 带。使用剃须刀片, 从凝胶中切下单个 dna 片段, 并将其转移到标记为2毫升的微泡管。
   注: 最大限度地减少紫外线照射时间, 以避免 dna 损坏。
6. 使用 pcr 清理试剂盒 (参见材料表) 纯化不同的 dna 片段。
   1. 在装有凝胶片段的每个管中加入试剂盒提供的 nti 缓冲液500μl。转移到50-55°c 的热敏化体, 在1000转/分处晃动, 直到凝胶完全溶解到缓冲液中。
   2. 将每个溶液转移到标记的试剂盒列中, 在微型离心机 (30-60s, 11, 000 x g) 中旋转, 并丢弃流经。加入700μl 的试剂盒的 nt3 洗涤缓冲液, 在相同的设置下再次离心, 并丢弃流量。在 11, 000 x g 的情况下再次离心柱 1-2分钟, 以干燥色谱柱内的硅膜。
   3. 将柱转移到标记的 1.5 ml 微泡管, 将30μl 的无核酸酶水输送到柱中, 让其站立 1分钟, 离心机30-60s 英寸, 以 11, 000 x g 的速度清除 dna。
7. 通过在分光光度计中测量样品在260纳米和340纳米的吸收率 (见材料表), 定量测量回收的 dna 量。dna 浓度是通过从260纳米图中减去 340 nm 读数, 然后将结果乘以 dna 的消光系数 (50μg/ml)²³来计算的。
   备注:在230纳米和280纳米的额外测量允许评估 dna 纯度: 在1.8 以上的26/280 和26-230 比率一般被认为是 dna 的纯。该协议可以在这一步骤之后暂停, 将洗脱的 dna 存储在 4°c (短期) 或-20°c (长期)。

4. pcr 扩增生成倍体 dna 序列

1. 建立50μl 的 pcr 反应, 以融合嵌合体的单独成分。按照3.1 中详述的相同步骤操作, 使用 n-端子和 c 端引物以及步骤3.7 中获得的每个 dna 片段中的 10 ng。
   注: pcr 反应可以设置在晚上, 并运行一夜。
2. 重复步骤3.2 至 3.7, 在30μl 无核酸酶水中恢复和量化纯化的 dna 片段。这个片段包含嵌合 dna 序列, 两侧是末端引物中包含的限制位点。

5. 将奇美耳 dna 插入表达载体

1. 按照表 4所示的顺序标记两个 1.5 ml 微泡管和管道不同的试剂, 在一个管中添加所选表达载体的 1μg, 在另一个管中添加1微克的回收 dna 片段。在37°c 下孵化 1-4, 用所选择的限制性酶进行消化。
   备注:确保两种限制性酶与所使用的缓冲液兼容。如果他们需要完全不同的缓冲液, 首先执行这些步骤, 只有一个酶, 并重复。消化所需的时间可能因选择的限制性酶而异: 有关详细信息, 请参阅制造商的说明。
2. 重复步骤3.2 至 3.7, 在30μl 无核酸酶水中纯化和恢复被消化的 dna 片段和表达载体。像以前一样量化回收的 dna 量。
3. 使用下面的公式计算结扎反应中3:1 插入载体摩尔比所需的插入 dna 量。
   
   插入(ng) =摩尔比 * 矢量(ng) *插入大小(bp) /矢量大小(bp)
   
   注: 可以测试不同的插入/矢量摩尔比, 尽管通常3:1 的比例足以获得足够的结果。
4. 在具有 40 ng 表达载体的 1.5 ml 微泡管中建立20μl 结扎反应, 在步骤 5.3 (缓冲液) 和 t4 dna 连接酶中按表5所示顺序计算的嵌合 dna 量, 并在16°c 下孵育过夜。
   注: 在16°c 下进行夜间反应通常会提高结扎效率, 但也可以在室温下孵育2小时。
5. 将5-10μl 的结扎混合物转化为化学上有能力的大肠杆菌 (大肠杆菌), 按照标准协议²⁴在选择板中生长, 并选择单个菌落进行扩张和质粒 dna根据既定的协议²⁵进行隔离。
   注:此协议使用了大肠杆菌 xl1-蓝色菌株, 但也可以使用其他大肠杆菌变体。
6. 按照步骤5.1 中的说明, 消化分离的质粒, 并按照步骤5.1 中的说明, 评估琼脂糖凝胶中是否存在与嵌合序列相对应的大小的 dna 带 (见步骤 3.2-3.5)。
   注: 建议通过 dna 测序服务验证插入的序列。
7. 在成功的序列验证后, 质粒可以通过遵循既定的协议^26,27 在哺乳动物表达系统中产生更多的数量。

结果

嵌合蛋白的构建和生成 (图 1) 将以白细胞介素-6 细胞因子家族的两名成员 osm 和 lif 为例^,这是最近发表的一项研究的主题6。图 2显示了这些蛋白质的三维结构。这两个分子都采用 i 类细胞因子的特征二级结构, 四个螺旋 (称为 a 到 d) 被捆绑起来, 并由^{循环 28}连接。人类蛋白质的对齐氨基酸结构可以在图 3a 中看到。在本例中, osm 的 bc 环路区域由相应的 lif 序列交换, 以创建一个具有氨基酸序列的 OSM-LIF 嵌合体, 如图 3b 所示。

讨论

嵌合蛋白的产生构成了一种多功能的技术, 它能够超越截断蛋白的限制, 以解决细胞因子受体结合域的模块化等问题¹³。嵌合体的设计是这种研究的关键一步, 需要仔细考虑。建立功能域的初步研究一般需要在第一阶段替换广泛的区域, 而较小的可变长度的替换则更适合于对单一区域的详细研究。在这一步中, 应特别注意蛋白质家族中存在的小的保守图案, 因为这些图案往往表明功能部位^31,32。个人经验表明, 可能需要进行一轮以上的嵌合蛋白设计, 以缩小关键功能区域的范围, 从最初的设计到功能分析测试, 每一轮都需要相当长的时间 (数周到数月)。

只要存在一种结构上与感兴趣的蛋白质相似的蛋白质, 但具有不同的生物功能, 这种方法就适用于任何感兴趣的序列, 尽管由于依赖 pcr, 必须针对每个特定的基因进行优化放大。特别是, 具有 gc 丰富区域的基因可能会被证明是特别具有挑战性的目标, 因为众所周知, 这些类型的序列会降低

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Labcycler 热循环仪	Sensoquest	011-103	任何常规的PCR机器都可以用来执行这个程序
NanoDrop 2000c 紫外-可见分光光度计	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	DNA 定量
GeneRuler 100 bp DNA 分子量标准	ThermoFisher Scientific	SM0241
GeneRuler DNA 分子量标准混合物	ThermoFisher Scientific	SM0331
AscI 限制性内切酶	New England Biolabs	R0558
PacI 限制性内切酶	New England Biolabs	R0547
Phusion 热启动 II DNA 聚合酶	ThermoFisher Scientific	F-549S
dNTP 组 （100 mM）	Invitrogen	10297018
T4 DNA 连接酶	Promega	M1804
NucleoSpin 凝胶和 PCR 纯化试剂盒	Macherey-Nagel	740609
MGC 人 LIF 序列验证的 cDNA（克隆 Id：7939578），甘油储备	液 ThermoFisher Scientific	MHS6278-202857165
LE 琼脂糖	生物酶
引物	Sigma-Aldrich		定制订单
人抑瘤素 M cDNA			由 Heike Hermanns 博士（大学医院肝病科;rzburg， 德国）
具有 PacI 和 AscI 限制性位点			由 André 博士提供;Schneider（马克斯·普朗克心肺研究所，德国巴特瑙海姆）