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方法文章

通过嵌合蛋白构建鉴定功能蛋白区域

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⸱

DOI：

10.3791/58786

⸱

2019年1月8日

 ,  ,  , 
1Department of Cardiac Development and Remodelling, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, 2Partner site Rhein-Main, German Centre for Cardiovascular Research (DZHK)

本文内容

摘要

结构相似的蛋白质通常发挥不同的生物学功能。通过交换这些蛋白质的对应区域以构建嵌合蛋白，是一种鉴定决定其功能差异的关键蛋白区域的创新方法。

摘要

本实验方案的目的是设计嵌合蛋白，通过将一种蛋白的特定区域替换为结构相似蛋白中对应的序列，以确定这些区域的功能重要性。此类嵌合蛋白通过巢式PCR方法结合重叠DNA片段和合理设计的引物进行构建，随后在哺乳动物系统中表达，以确保蛋白具有天然的二级结构和翻译后修饰。

通过在适当的检测实验中观察嵌合体活性的丧失，即可确定特定区域的功能作用。由此可鉴定出包含一组关键氨基酸的区域，并可通过互补技术（例如定点突变）进一步筛选，以提高分子分辨率。尽管该方法仅限于能够找到结构相似但功能不同的蛋白质的情况，但嵌合蛋白已成功用于鉴定细胞因子和细胞因子受体等蛋白质中的关键结合区域。该方法特别适用于蛋白质功能区域尚未明确界定的情况，是在定向进化研究中缩小目标区域范围、减少筛选工作量的有效初步步骤。

引言

包括细胞因子和生长因子在内的多种蛋白质被归为若干家族，其成员具有相似的三维结构，但通常发挥不同的生物学功能1,2。这种功能多样性通常是由于分子活性位点内氨基酸组成存在微小差异所致3。识别这些位点和功能决定因素不仅有助于深入理解进化机制，还可用于设计更具特异性的激动剂和抑制剂4。然而，结构相似的蛋白质之间残基组成通常存在大量差异，这使得上述研究任务变得复杂。尽管目前构建包含数百种突变体的大规模文库已成为可能，但逐一评估每个残基变异及其组合仍是一项具有挑战性且耗时的工作5。

因此，评估大段蛋白质区域功能重要性的技术具有重要价值，可将可能涉及的残基数量减少至可管理的范围6。截短蛋白是解决这一问题最常用的方法。相应地，如果某个特定区域的缺失会影响所研究的蛋白质功能，则认为该区域具有功能相关性7,8,9。然而，该方法的一个主要局限在于，缺失可能影响蛋白质的二级结构，导致错误折叠、聚集，从而无法对目标区域进行研究。一个典型的例子是细胞因子抑瘤素M（oncostatin M, OSM）的截短版本，其中超过7个残基的内部缺失导致突变体发生错误折叠，无法进一步研究10。

嵌合蛋白的构建是一种替代性且创新性的方法，可实现对较大蛋白区域的分析。该方法的目标是利用另一种蛋白中结构相关的序列替换目标蛋白中的特定区域，以评估被替换部分对特定生物学功能的贡献。该方法在信号受体领域被广泛用于鉴定功能结构域11,12，尤其适用于研究氨基酸序列同源性较低但二级结构保守的蛋白家族。典型的例子包括白细胞介素-6（IL-6）类细胞因子家族，如白细胞介素-6与睫状神经营养因子（序列同源性为6%）13，或白血病抑制因子（LIF）与OSM（序列同源性为20%）6，本实验方案即基于此类蛋白建立。

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方案

1. 嵌合蛋白设计

  1. 选择一种合适的蛋白质（供体）与目标蛋白质（受体）进行区域交换。供体蛋白质应具有相似的结构，理想情况下属于同一蛋白质家族，但缺乏可用于检测读数的生物学活性。若未知任何结构相关的蛋白质，可使用自动化工具（如向量比对搜索工具 VAST）来鉴定潜在候选蛋白。14,15
    1. 访问蛋白质数据库（PDB）16 欧洲网站（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/）右上角的搜索框中输入目标蛋白名称，然后点击“搜索”。如果存在可用的晶体结构，请记下 PDB 标识符（PDB ID； 例如 1evs 对于 OSM。
      注意：如果PDB中无该蛋白的结构数据，可使用SWISS-MODEL等工具生成其同源建模结构17 而是使用现有的分步实验方案18.
    2. 访问 VAST 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml）。若有可用的 PDB ID，向下滚动至“Retrieve pre-computed results”部分，在“Show Similar Structures for”框中输入 PDB ID，然后点击“Go”。在接下来的页面中，点击“Original VAST”，然后选择“Entire Chain”，以查看潜在结构相似候选分子的 PDB ID 列表。
      1. 如果无法获得PDB ID，但已生成同源建模结构，请向下滚动至“使用新结构搜索”部分，点击“VAST搜索”链接。通过点击“提交PDB文件”旁边的“浏览”按钮，选择模型的PDB文件并点击“提交”以上传该文件。
      2. PDB 文件上传后，点击“开始”按钮以启动 VAST 计算。计算完成后，点击“结构域”下的“完整链”，查看结构相似蛋白质的 PDB ID。
    3. 评估感兴趣的生物学功能（例如 受体激活、酶活性、转录因子活性）进行实验验证（在选定的检测系统中）或通过文献检索加以确认。选择一个在功能上与目标蛋白不同的供体蛋白。
  2. 从参考序列（RefSeq）数据库中获取受体蛋白和供体蛋白的氨基酸序列19 .
    1. 进入 RefSeq 网站的基因板块（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene），在搜索框中输入目标蛋白的名称，然后点击“搜索”。在结果列表中，点击所需物种对应的基因名称。 
    2. 向下滚动至 RefSeq 部分以查看所有已记录的同工型。点击您感兴趣的同工型序列编号（以 NM 开头），向下滚动并点击“CDS”以高亮显示该基因的蛋白质编码区。在屏幕右下方，点击“FASTA”并复制基因序列。
    3. 使用合适的DNA编辑软件保存DNA序列。当使用免费的ApE软件时20，打开程序，将复制的序列粘贴到空白框中，选择序列名称，然后点击“Save”。
      ​注意：针对所选的一个或多个供体蛋白，重复步骤 1.2.1 至 1.2.3。
  3. 选择不同嵌合体构建物中需要替换的蛋白质区域。
    1. 将目标蛋白序列划分为不同的结构区域。理想情况下，该蛋白的不同结构域已在文献中被描述。若缺乏相关文献，应在步骤1.3.1.1至1.3.1.4中评估是否存在明显的保守结构特征（如螺旋、环等）。
      1. 从 PDB 网站下载目标蛋白的结构数据（参见步骤 1.1.1）。访问该蛋白的 PDB 页面，点击屏幕右侧的“下载”按钮以获取 PDB 文件。
      2. 在 PyMOL（https://pymol.org/）等分子可视化系统中打开 PDB 文件。在 PyMOL 中，显示核苷酸序列（通过点击 Display） > 序列比对开启后，隐藏默认的结构数据（点击PDB ID旁边的H，然后选择“everything”），并选择“cartoon”视图以清晰显示蛋白质的结构特征（点击PDB ID旁边的S，然后选择“cartoon”）。
      3. 点击屏幕顶部的核苷酸序列，以高亮显示分子的不同部分，并记录下每个独特结构特征所对应的氨基酸。
    2. 在 ApE 中对 DNA 序列上的不同结构区域进行注释。操作时，打开 1.2.3 步骤中的 DNA 序列，选中编码某一区域氨基酸的核苷酸，右键点击所选区域，选择“New Feature”以命名并赋予颜色。对先前步骤中识别出的每个结构区域重复此过程。
      注意：可通过点击ORF来再次核对核苷酸选择 > 翻译后，点击“确定”，以确保它们编码正确的氨基酸序列。
    3. 使用蛋白质序列比对工具对两种蛋白质的残基序列进行比对（例如 Clustal Omega21).
      注意：由于嵌合体将在哺乳动物表达系统中产生，这些序列应包含蛋白质的信号肽。
      1. 通过打开步骤 1.2.3 中的 DNA 序列，选中后点击 ORFs，以在 ApE 中获取供体和受体蛋白的完整氨基酸序列 > 翻译。
      2. 访问 Clustal Omega 网页（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），输入两种蛋白质的氨基酸序列，然后向下滚动并点击“提交”。每条序列前应添加以“>ProteinName”开头的文本行，以便正确识别。
      3. 单击“下载比对文件”标签以获取比对文件并保存。该文件可用任意文本编辑程序打开。
      4. 以比对文件为参考，标注供体蛋白在DNA序列中对应的结构区域（参见步骤1.3.2）。
    4. 确定嵌合蛋白中需要交换的蛋白区域，并设计嵌合体相应的核苷酸序列。
      注意：在缺乏关于不同区域功能重要性的详细信息时，建议选择较大的替换片段（如完整的环区或螺旋区），以评估哪些区域对蛋白质功能具有影响。在完成这一初步探索性实验后，可进一步开展第二轮嵌合蛋白设计，针对相关区域内的较小片段进行替换。
      1. 复制步骤1.3.2中已注释的受体蛋白DNA序列，将其重命名为嵌合蛋白。在ApE中打开重命名后的DNA序列，选择并删除编码待替换区域的核苷酸序列，用供体蛋白中相应区域的序列（从步骤1.3.3创建的已注释序列中复制）进行替换，然后保存修改。
        注意：为每种设计的不同嵌合体创建一个新副本，并重复此步骤。

2. 分子克隆的准备工作

  1. 选择适合目标表达系统的质粒载体。对于哺乳动物表达，推荐使用高表达载体，如 pCAGGS22 或 pcDNA 载体系列。
    1. 针对本实验方案中所演示的基于限制性内切酶的克隆方法，需确保载体多克隆位点（MCS）中的独特限制性酶切位点与目标蛋白相容。为此，使用 ApE 打开嵌合体构建物的 DNA 序列，点击“Enzymes > Enzyme selector”，并确认 MCS 中至少有两个限制性酶切位点在序列中不存在（其名称旁显示数字为零）。
  2. 使用 ApE 等 DNA 编辑软件设计末端引物。
    1. 创建一个新的 DNA 文件（File > New），以一段前导序列（3–9 个额外碱基对，例如 AAAGGGAAA）开始设计 N 端引物，随后加入载体 MCS 中选定的第一个限制性酶切位点（6–8 个碱基对，例如 PacI 的 TTAATTAA）、一个可选的间隔序列（例如 示例中使用的 pCAGGS 载体中的 GCTAGCGCATCGCCACC），以及目标基因的起始 18–27 个碱基对（例如 OSM 基因的 ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG）。
    2. 在另一个新的 DNA 文件中，C 端引物序列以目标基因的最后 18–27 个碱基对开始（例如 带有 6×His 标签的基因的 C 端序列为 CTCGAGCACCACCACCACCACCTGA），随后为可选的间隔序列（例如 pCAGGS 载体中的 TAGCGGCCGC）、选定的第二个限制性酶切位点（例如 AscI 的 GGCGCGCC），以及一段前导序列（例如 AAAGGGAAA）。选中整个序列，右键并选择“Reverse-Complement”，以获得反向引物。
  3. 为嵌合体构建物中的每个边界区域设计引物。
    1. 打开嵌合体的 DNA 序列（在步骤 1.3.4.1 中创建），选中原始序列与插入序列交界区域的 30 个碱基对，其中各包含 15 个碱基对的原始序列和插入序列。复制该区域（右键选择“Copy”），粘贴至一个新的 DNA 文件中；该序列即为正向引物。
    2. 复制上一步生成的正向引物，并将其重命名为反向引物。选中引物序列，右键并选择“Reverse-Complement”，以生成反向引物序列。
    3. 对嵌合 DNA 序列中的每个连接区域重复步骤 2.3.1 和 2.3.2。通常，生成一个嵌合体需要两组正向/反向引物，除非替换发生在 N 端或 C 端区域。
  4. 向寡核苷酸合成供应商订购末端引物和内部引物。
    注意事项： 使用高纯度的末端引物（例如 HPLC 纯化的引物）可提高本实验方案的成功率。内部引物通常使用脱盐纯化即可获得良好结果。
  5. 获取供体基因和受体基因的模板序列。
    注意：建议使用含有这些序列开放阅读框（ORFs）的质粒作为模板，这将极大简化实验流程。或者，也可使用已知表达这些基因的细胞系所制备的互补 DNA（cDNA）作为后续步骤的模板。

3. 嵌合体中各DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）扩增

  1. 为构成嵌合蛋白的每个片段分别配制独立的PCR反应混合液。典型的嵌合蛋白需要三个独立的片段：N端部分、待插入区域以及C端部分。
    注意：使用高保真DNA聚合酶（例如 Phusion High Fidelity DNA Polymerase），以避免在序列中引入突变。PCR反应可在晚间设置并过夜运行。
    1. 将1.5 mL微量离心管置于冰上，按表1所示顺序加入PCR混合液中的不同试剂，确保每个PCR反应使用正确的引物和模板（见表2）。
    2. 为每个反应标记两根薄壁0.2 mL PCR管，向每根管中转移20 µL相应的PCR混合液。将PCR管放入PCR扩增仪中，并启动表3中详述的程序。
      注意：退火温度应至少比设计引物的熔解温度低5°C。
  2. 在PCR运行期间，配制100 mL含1%琼脂糖的Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液凝胶。具体操作为：称取1 g琼脂糖，加入100 mL TAE缓冲液于玻璃烧瓶中，微波加热至琼脂糖完全溶解，每隔30–40秒摇动烧瓶一次。冷却至约50 °C后，加入2–3 µL溴化乙锭（或等效DNA染料），倒入带有合适加样孔梳子的凝胶模具中。
    注意：溴化乙锭为已知诱变剂，操作时务必使用适当的个人防护装备。
  3. PCR反应完成后，向每根PCR管中加入4 µL 6x DNA上样缓冲液。将1%琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液覆盖凝胶表面，小心地将样品连同样品孔道分子量标记物一起上样至凝胶中。
    注意：上样时建议在样品之间留出空孔道，以便后续更方便地回收DNA。
  4. 以80–120 V电压运行电泳20–45分钟。
    注意：通常小于1,000个碱基对的条带在120 V下约20分钟即可完成电泳，而较大的条带则需要更长的运行时间。
  5. 关闭电泳装置，取出琼脂糖凝胶，在紫外光下观察扩增的DNA条带。使用刀片从凝胶中切下各个DNA片段，并将其转移至已标记的2 mL微量离心管中。
    注意：应尽量减少DNA暴露于紫外光的时间，以避免DNA损伤。
  6. 使用PCR产物纯化试剂盒（见材料表）对不同的DNA片段进行纯化。
    1. 向每个含有凝胶片段的管中加入500 µL试剂盒提供的NTI缓冲液。将管子置于50–55 °C的恒温混匀仪中，以1000 rpm振荡，直至凝胶完全溶解于缓冲液中。
    2. 将每种溶液转移至已标记的试剂盒离心柱中，在微量离心机中离心（30–60秒，11,000 × g），弃去穿流液。加入700 µL试剂盒提供的NT3洗涤缓冲液，在相同条件下再次离心，并弃去穿流液。再以11,000 × g离心1–2分钟，以干燥柱内硅胶膜。
    3. 将离心柱转移至已标记的1.5 mL微量离心管中，向柱中加入30 µL无核酸酶水，静置1分钟，然后以11,000 × g离心30–60秒，以洗脱DNA。
  7. 使用分光光度计（见材料表）测定样品在260 nm和340 nm处的吸光度，以定量回收的DNA量。DNA浓度通过从260 nm读数中减去340 nm读数，再将结果乘以DNA的消光系数（50 µg/mL）计算得出23。
    注意：额外测量230 nm和280 nm处的吸光度可用于评估DNA纯度：通常认为260/280和260/230比值高于1.8时DNA较为纯净。本步骤完成后可暂停实验流程，将洗脱的DNA短期储存于4 °C或长期储存于-20 °C。

4. PCR 扩增以生成嵌合 DNA 序列

  1. 设置一个50 µL的PCR反应，以融合嵌合体的各个独立组分。按照3.1节中详述的相同步骤操作，使用N端和C端引物，并加入在步骤3.7中获得的每种DNA片段各10 ng。
    注意：PCR反应可在晚间设置，并过夜运行。
  2. 重复步骤3.2至3.7，以回收并定量纯化的DNA片段，溶于30 µL无核酸酶的水中。该片段包含嵌合DNA序列，其两端为末端引物中引入的限制性酶切位点。

5. 将嵌合DNA插入表达载体

  1. 标记两个 1.5 mL 微量离心管，并按照 表 4 中所示顺序加入不同的试剂，其中一管加入 1 µg 所选表达载体，另一管加入 1 µg 回收的 DNA 片段。在 37 °C 下孵育 1–4 小时，以完成所选限制性内切酶的消化反应。
    注意事项：确保两种限制性内切酶均与所用缓冲液兼容。若它们需要完全不同的缓冲液，则应先仅使用其中一种酶进行上述步骤，再重复操作。消化所需时间可能因所选限制性内切酶而异：请参考生产商提供的说明书以获取详细信息。
  2. 重复步骤 3.2 至 3.7，以纯化并回收经消化的 DNA 片段和表达载体，最终溶于 30 µL 无核酸酶水中。定量回收的 DNA 量，方法同前。
  3. 根据以下公式计算连接反应中实现 3:1 插入片段/载体摩尔比所需的插入 DNA 量。

    插入片段 (ng) = 摩尔比 × 载体 (ng) × 插入片段大小 (bp) / 载体大小 (bp)

    注意：可尝试不同的插入片段/载体摩尔比，但通常 3:1 的比例已足以获得理想结果。
  4. 在 1.5 mL 微量离心管中配制 20 µL 连接反应体系，依次加入 40 ng 表达载体、步骤 5.3 计算所得的嵌合 DNA 量、缓冲液及 T4 DNA 连接酶，顺序见 表 5，然后在 16 °C 下过夜孵育。
    注意：通常在 16 °C 下过夜孵育可提高连接效率，但也可选择在室温下孵育 2 小时作为替代方案。
  5. 将 5–10 µL 连接产物转化至按标准方案制备的化学感受态 Escherichia coli（E. coli）中24，在筛选平板上培养后挑取单克隆进行扩增，并根据既定方案提取质粒 DNA25。
    注意：本实验采用 E. coli XL1-Blue 菌株，但也可使用其他 E. coli 变体。
  6. 取 1 µg 提取的质粒，按照步骤 5.1 的说明使用适当的限制性内切酶进行消化，并通过琼脂糖凝胶电泳检测是否存在大小与嵌合序列相符的 DNA 条带（参见步骤 3.2–3.5）。
    注意：建议通过 DNA 测序服务对插入序列进行验证。
  7. 在成功完成序列验证后，可按照成熟方案大量制备质粒，并将其用于哺乳动物表达系统26,27。

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结果

嵌合蛋白的构建与制备图1) 将以白细胞介素-6细胞因子家族的两个成员OSM和LIF为例进行说明，这两者是近期发表的一项研究的主题6. 图2 展示了这些蛋白质的三维结构。两个分子均采用Ⅰ类细胞因子的特征性二级结构，包含四段螺旋（称为A至D螺旋），以束状排列并由环状结构连接。28人类蛋白质的比对氨基酸结构如图所示 图3A在此示例中，OSM 的 BC 环区域被相应的 LIF 序列替换，以构建一个 OSM-LIF 嵌合体，其氨基酸序列如下所示 图3B.

为此，获取...

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讨论

嵌合蛋白的构建是一种多功能技术，能够突破截短蛋白的局限，用于研究细胞因子-受体结合域的模块性等问题13。嵌合体的设计是此类研究中的关键步骤，需要仔细考量。初步确定功能域的研究通常在第一阶段需要替换较大的区域，而对单个区域进行更精细的研究则更适合采用不同长度的小片段替换。在此过程中应特别注意蛋白质家族中是否存在小型保守基序，因为这些基序通常提示功能位点的存在31,32。根据个人经验，可能需要多轮嵌合蛋白设计才能精确定位关键功能区域，每一轮设计从初始构建到功能检测通常都需要耗费大量时间（数周至数月）。

只要存在与目标蛋白结构相似但生物学功能不同的蛋白，该方法即可适用于任何目标序列，尽管由于依赖PCR扩增，需针对每个特定基因进行优化。特别是富含GC区域的基因可能构成较具挑战性的扩增目标，因为这类序列已知会降低扩增效率33。这些问题通常可通过多种方法解决，例如在反应体系中添加不同...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由马克斯·普朗克学会和许特尔曼诊所（德国巴特罗滕费尔德）资助。部分研究最初发表于《生物化学杂志》。Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. 人肿瘤抑制素M（OSM）结合位点III中的AB环和D螺旋对OSM受体激活至关重要。J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029。© 作者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Labcycler 梯度 PCR 仪Sensoquest011-103任何常规 PCR 仪器均可用于执行本方案
NanoDrop 2000c 紫外-可见分光光度计ThermoFisher ScientificND-2000C DNA 定量
GeneRuler 100 bp DNA 标准品ThermoFisher ScientificSM0241
GeneRuler DNA 标准品混合液ThermoFisher ScientificSM0331
AscI 限制性内切酶New England BiolabsR0558
PacI 限制性内切酶New England BiolabsR0547
Phusion Hot Start II DNA 聚合酶ThermoFisher ScientificF-549S
dNTP 混合物（100 mM）Invitrogen10297018
T4 DNA 连接酶PromegaM1804
NucleoSpin Gel and PCR 纯化试剂盒Macherey-Nagel740609
MGC 人 LIF 序列验证 cDNA（克隆编号：7939578），甘油菌种ThermoFisher ScientificMHS6278-202857165
LE 琼脂糖Biozym840004
引物Sigma-Aldrich定制订购
人抑瘤素 M cDNA由德国维尔茨堡大学医院肝病科 Heike Hermanns 博士惠赠ü 
含 PacI 和 AscI 限制性酶切位点的 pCAGGS 载体由德国巴特瑙海姆马克斯·普朗克心肺研究所 André Schneider 博士惠赠

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