结构相似的蛋白质通常发挥不同的生物学功能。通过交换这些蛋白质的对应区域以构建嵌合蛋白，是一种鉴定决定其功能差异的关键蛋白区域的创新方法。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案的目的是设计嵌合蛋白，通过将一种蛋白的特定区域替换为结构相似蛋白中对应的序列，以确定这些区域的功能重要性。此类嵌合蛋白通过巢式PCR方法结合重叠DNA片段和合理设计的引物进行构建，随后在哺乳动物系统中表达，以确保蛋白具有天然的二级结构和翻译后修饰。
通过在适当的检测实验中观察嵌合体活性的丧失，即可确定特定区域的功能作用。由此可鉴定出包含一组关键氨基酸的区域，并可通过互补技术（例如定点突变）进一步筛选，以提高分子分辨率。尽管该方法仅限于能够找到结构相似但功能不同的蛋白质的情况，但嵌合蛋白已成功用于鉴定细胞因子和细胞因子受体等蛋白质中的关键结合区域。该方法特别适用于蛋白质功能区域尚未明确界定的情况，是在定向进化研究中缩小目标区域范围、减少筛选工作量的有效初步步骤。
引言
包括细胞因子和生长因子在内的多种蛋白质被归为若干家族，其成员具有相似的三维结构，但通常发挥不同的生物学功能1,2。这种功能多样性通常是由于分子活性位点内氨基酸组成存在微小差异所致3。识别这些位点和功能决定因素不仅有助于深入理解进化机制，还可用于设计更具特异性的激动剂和抑制剂4。然而，结构相似的蛋白质之间残基组成通常存在大量差异，这使得上述研究任务变得复杂。尽管目前构建包含数百种突变体的大规模文库已成为可能，但逐一评估每个残基变异及其组合仍是一项具有挑战性且耗时的工作5。
因此，评估大段蛋白质区域功能重要性的技术具有重要价值，可将可能涉及的残基数量减少至可管理的范围6。截短蛋白是解决这一问题最常用的方法。相应地，如果某个特定区域的缺失会影响所研究的蛋白质功能，则认为该区域具有功能相关性7,8,9。然而，该方法的一个主要局限在于，缺失可能影响蛋白质的二级结构，导致错误折叠、聚集，从而无法对目....
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方案
1. 嵌合蛋白设计
- 选择一种合适的蛋白质（供体）与目标蛋白质（受体）进行区域交换。供体蛋白质应具有相似的结构，理想情况下属于同一蛋白质家族，但缺乏可用于检测读数的生物学活性。若未知任何结构相关的蛋白质，可使用自动化工具（如向量比对搜索工具 VAST）来鉴定潜在候选蛋白。14,15
- 访问蛋白质数据库（PDB）16 欧洲网站（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/）右上角的搜索框中输入目标蛋白名称，然后点击“搜索”。如果存在可用的晶体结构，请记下 PDB 标识符（PDB ID； 例如 1evs 对于 OSM。
注意：如果PDB中无该蛋白的结构数据，可使用SWISS-MODEL等工具生成其同源建模结构17 而是使用现有的分步实验方案18. - 访问 VAST 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml）。若有可用的 PDB ID，向下滚动至“Retrieve pre-computed results”部分，在“Show Similar Structures for”框中输入 PDB I....
- 访问蛋白质数据库（PDB）16 欧洲网站（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/）右上角的搜索框中输入目标蛋白名称，然后点击“搜索”。如果存在可用的晶体结构，请记下 PDB 标识符（PDB ID； 例如 1evs 对于 OSM。
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结果
嵌合蛋白的构建与制备图1) 将以白细胞介素-6细胞因子家族的两个成员OSM和LIF为例进行说明，这两者是近期发表的一项研究的主题6. 图2 展示了这些蛋白质的三维结构。两个分子均采用Ⅰ类细胞因子的特征性二级结构，包含四段螺旋（称为A至D螺旋），以束状排列并由环状结构连接。28人类蛋白质的比对氨基酸结构如图所示 图3A在此示例中，OSM 的 BC 环区域被相应的 LIF 序列替换，以构建一个 OSM-LIF 嵌合体，其氨基酸序列如下所示 图3B.
为此，获取.......
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讨论
嵌合蛋白的构建是一种多功能技术，能够突破截短蛋白的局限，用于研究细胞因子-受体结合域的模块性等问题13。嵌合体的设计是此类研究中的关键步骤，需要仔细考量。初步确定功能域的研究通常在第一阶段需要替换较大的区域，而对单个区域进行更精细的研究则更适合采用不同长度的小片段替换。在此过程中应特别注意蛋白质家族中是否存在小型保守基序，因为这些基序通常提示功能位点的存在31,32。根据个人经验，可能需要多轮嵌合蛋白设计才能精确定位关键功能区域，每一轮设计从初始构建到功能检测通常都需要耗费大量时间（数周至数月）。
只要存在与目标蛋白结构相似但生物学功能不同的蛋白，该方法即可适用于任何目标序列，尽管由于依赖PCR扩增，需针对每个特定基因进行优化。特别是富含GC区域的基因可能构成较具挑战性的扩增目标，因为这类序列已知会降低扩增效率33。这些问题通常可通过多种方法解决，例如在反应体系中添加不同.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由马克斯·普朗克学会和许特尔曼诊所（德国巴特罗滕费尔德）资助。部分研究最初发表于《生物化学杂志》。Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. 人肿瘤抑制素M（OSM）结合位点III中的AB环和D螺旋对OSM受体激活至关重要。J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029。© 作者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Labcycler 梯度 PCR 仪 | Sensoquest | 011-103 | 任何常规 PCR 仪器均可用于执行本方案 |
| NanoDrop 2000c 紫外-可见分光光度计 | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA 定量 |
| GeneRuler 100 bp DNA 标准品 | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA 标准品混合液 | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI 限制性内切酶 | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI 限制性内切酶 | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA 聚合酶 | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP 混合物（100 mM） | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA 连接酶 | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR 纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC 人 LIF 序列验证 cDNA（克隆编号：7939578），甘油菌种 | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE 琼脂糖 | Biozym | 840004 | |
| 引物 | Sigma-Aldrich | 定制订购 | |
| 人抑瘤素 M cDNA | 由德国维尔茨堡大学医院肝病科 Heike Hermanns 博士惠赠ü | ||
| 含 PacI 和 AscI 限制性酶切位点的 pCAGGS 载体 | 由德国巴特瑙海姆马克斯·普朗克心肺研究所 André Schneider 博士惠赠 |
参考文献
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the ....
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