方法文章

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

DOI：

10.3791/58788

⸱

2019年1月31日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, 2Sorbonne Université, Paris, France, 3Institut du Fer à Moulin, Paris, France

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，能够迅速响应其环境变化并发生形态学改变。本方案描述了如何利用双光子显微镜研究小鼠急性脑切片中小胶质细胞突起向血清素或三磷酸腺苷（ATP）的趋化反应。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小胶质细胞是大脑中常驻的固有免疫细胞，它们不断利用其长突起扫描周围环境，并在稳态受到干扰时迅速发生形态学改变。例如，激光损伤可在数分钟内诱导小胶质细胞突起朝向损伤部位的定向生长，这一现象也称为"定向运动性"。类似效应也可通过局部递送三磷酸腺苷（ATP）或5-羟色胺（5-羟基色胺[5-HT]）实现。本文描述了一种在幼年和成年小鼠急性脑片中诱导小胶质细胞突起朝向ATP或5-HT局部施加部位定向生长的实验方案，并利用双光子显微镜对这一趋化吸引过程进行时间序列成像。同时提出了一种使用免费开源图像分析软件进行定量分析的简便方法。急性脑片研究仍面临的一个挑战是细胞维持生理状态的时间有限，且该时间随动物年龄增长而缩短。因此，本方案强调了一些旨在提高小胶质细胞在数小时内（尤其是成年小鼠脑片中）存活率的技术改进措施，包括灌流液成分优化、气-液界面式孵育 chamber 以及配备双通道灌流系统的成像 chamber。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小胶质细胞是大脑的常驻巨噬细胞，在生理和病理条件下均发挥重要作用1,2它们具有高度分支的形态，并不断延伸和回缩其突起。3,4。这个 "扫描" 行为被认为与其周围环境的探测相关且必要。小胶质细胞的形态可塑性表现为三种模式。第一，某些化合物可快速调节小胶质细胞形态：添加ATP5,6 或NMDA5,7 在灌注急性脑切片的培养基中，去甲肾上腺素减少小胶质细胞分支的复杂性，而其他因素增加其分支复杂性6这些效应要么由小胶质细胞受体直接介导（如ATP和去甲肾上腺素），要么需要神经元释放ATP（如NMDA）。其次，小胶质细胞突起的生长与回缩速度，称为运动性或 "监测"，可能受到细胞外因素的影响8，稳态失衡9,10，或突变9,10,11第三，除了上述形态和运动性的各向同性变化外，小胶质细胞还能够将突起定向地伸向释放ATP的移液管3,5,12,13,14在培养中、急性脑切片中或在体条件下，或在急性脑切片中递送5-HT15小胶质细胞突起的这种定向生长，也称为方向性运动，最初被描述为对局部激光损伤的一种反应3,4因此，从生理学角度来看，它可能与损伤后的反应有关，或在发育过程中将小胶质细胞突起定向至需要突触修剪或脑区修剪的部位所必需15,16，或在生理条件下17,18,19 或病理情况9,18,19,20 在成年期。这三种形态学变化依赖于不同的细胞内机制11,13,20，且一种给定的化合物不一定能调节所有这些方面（例如，NMDA 间接作用于小胶质细胞，可影响其形态，但不会诱导定向运动）5,7因此，在研究化合物、基因突变或病理状态对小胶质细胞的影响时，对小胶质细胞形态可塑性的三个组成部分进行表征至关重要。本文描述了一种研究小胶质细胞突起向局部化合物源（此处为ATP或5-HT）定向生长的方法。

研究小胶质细胞突起趋化性的模型有多种：三维环境中的原代培养6,18,19、急性脑切片6,13,15 以及活体成像3,13。其中，活体研究方法最能保持小胶质细胞的生理状态。然而，对深层脑区进行活体成像需要复杂的外科手术操作，因此通常仅限于表层皮质区域。使用小胶质细胞原代培养是最简便的技术，可在动物使用数量有限的情况下测试大量实验条件。但该方法无法获得与活体内相同的细胞形态，且细胞会失去与神经元和星形胶质细胞的生理相互作用。急性脑切片则介于上述两种方法之间，是一种折中方案。该模型使研究人员能够研究那些在活体内难以到达或高分辨率成像的脑区结构，并可用于研究新生期阶段的脑组织切片，而经颅显微镜技术通常仅用于成年个体。此外，该方法还可在使用较少动物的前提下，实现实验的重复，并实时观察局部药物应用所产生的效应。然而，急性脑切片的一个问题是细胞存活时间较短（仅数小时），特别是来自出生两周以上小鼠的脑切片，且小胶质细胞形态可能随时间发生改变21,22。

本文介绍了一种制备出生至两个月龄的幼年及成年 Cx3cr1GFP/+ 小鼠急性脑切片的方案，可在数小时内保持小胶质细胞的形态和运动能力。随后，我们描述了如何利用这些脑切片研究小胶质细胞突起向三磷酸腺苷（ATP）或5-羟色胺（5-HT）等化合物的趋化性反应。

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方案

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所有实验均获得当地伦理委员会（Darwin 委员会，协议编号 #1170 和 #10921）的批准。

1. 化合物局部施加用玻璃微量移液管的制备

  1. 使用电极拉制仪从硼硅酸盐薄壁玻璃毛细管制备移液管。调整参数，使移液管末端直径达到 4 - 5 µm。图 2D 显示了低倍明场下的一根移液管。

2. 溶液

  1. 确保仅使用经过高压灭菌循环清洁，并用超纯水冲洗 2 至 3 次的玻璃器皿。切勿使用曾接触过甲醛的玻璃器皿。
  2. 通过将 14.7 mg 的 CaCl2·2H2O 溶解于 50 mL 高纯度水（超纯水，电阻率为 18.2 MΩ）中，配制 2 mol·L-1 的 CaCl2 储备液（蒸馏水或自来水中的金属残留物可能因促氧化作用导致脑片质量不佳）。
    1. 该储备液可在室温下保存最多一个月。
  3. 在实验当天，配制 1 L 的胆碱-aCSF（人工脑脊液）溶液，其成分为：110 mmol·L-1 氯化胆碱、25 mmol·L-1 葡萄糖、25 mmol·L-1 NaHCO3、7 mmol·L-1 MgCl2、11.6 mmol·L-1 抗坏血酸、3.1 mmol·L-1 丙酮酸钠、2.5 mmol·L-1 KCl、1.25 mmol·L-1 NaH2PO4 和 0.5 mmol·L-1 CaCl2。
    1. 配制该溶液时，按以下顺序将下列物质加入 1 L 容量瓶中：0.186 g KCl、0.195 g NaH2PO4、2.04 g 抗坏血酸、2.1 g NaHCO3 和 4.5 g 葡萄糖。
    2. 加入约一半最终体积的超纯水，并搅拌至完全溶解。
    3. 加入 0.34 g 丙酮酸钠和 15.36 g 氯化胆碱。
      注：建议先将氯化胆碱用步骤 2.3.2 中配制的溶液 5 至 10 mL 溶解，再加入总体溶液中。
    4. 向溶液中加入 7 mL 的 1 mol·L-1 MgCl2 和 250 µL 的 2 mol·L-1 CaCl2（步骤 2.2 中配制）。
    5. 用超纯水定容至 1 L。
    6. 使用蒸汽压渗透压计检测渗透压，确保其在 300 至 310 mΩ 范围内；若不符合，用葡萄糖调节。
    7. 在通入“碳合气”（即 95% O2/5% CO2 混合气体）后检测 pH 值，并在必要时用 10 M NaOH 调节至 7.3–7.4。
    8. 将溶液转移至玻璃瓶中储存。使用前将瓶子置于冰箱中保存（步骤 3.1）。
      注：建议在实验当天新鲜配制溶液。如有必要，胆碱-aCSF 可在 4 °C 下保存最多两天。
  4. 在实验当天，配制 1 L 的 aCSF 溶液，其成分为：124 mmol·L-1 NaCl、26.2 mmol·L-1 NaHCO3、25 mmol·L-1 葡萄糖、2.5 mmol·L-1 KCl、2 mmol·L-1 CaCl2、1 mmol·L-1 MgCl2 和 1.25 mmol·L-1 NaH2PO4。
    1. 配制该溶液时，按以下顺序将下列物质加入容量瓶中：0.150 g NaH2PO4、0.186 g KCl、2.2 g NaHCO3、4.5 g 葡萄糖和 7.3 g NaCl。用超纯水定容至 1 L，并在搅拌器上剧烈搅拌。
    2. 向溶液中加入 1 mL 的 1 mol·L-1 MgCl2 和 1 mL 的 2 mol·L-1 CaCl2，然后将 aCSF 溶液转移至玻璃瓶中储存。
    3. 检测渗透压是否为 300–310 mΩ·L-1，若不符合，用葡萄糖调节。
    4. 在通入“碳合气”（即用“碳合气”鼓泡）后检测 pH 值，并在必要时用 10 M NaOH 调节至 7.3–7.4。
    5. 将溶液转移至玻璃瓶中储存。使用前将瓶子置于冰箱中保存（步骤 3.1）。
      注：建议在实验当天新鲜配制溶液。作为替代方案，可预先配制含有 NaCl、NaHCO3、KCl 和 NaH2PO4 的 10 倍浓缩储备液（浓度为最终浓度的 10 倍），在 4 °C 下保存不超过一周。实验当天用超纯水稀释 10 倍储备液，并加入葡萄糖、CaCl2 和 MgCl2，配制成最终的 aCSF 溶液。
  5. 在实验当天配制药物溶液。使用 aCSF 溶液将药物稀释至最终浓度，本实验中 ATP 为 500 µmol·L-1，5-HT 为 5 µmol·L-1。
    注：对于 ATP，可预先配制储备液（例如，50 mM ATP 溶于水中），分装后于 -20 °C 保存，并在实验当天用 aCSF 稀释至最终浓度。而 5-HT（5-羟色胺盐酸盐）溶液必须在实验当天从粉末配制，浓度为 1 mg·mL-1 溶于水中，置于 4 °C 保存以避免 5-HT 氧化，并在实验时用 aCSF 稀释。

3. 急性脑切片的制备

  1. 解剖区域的准备
    1. 在置于冰上的80 mL烧杯中准备70 mL冰冻的胆碱-人工脑脊液（choline-aCSF），用于心脏灌注、快速冷却大脑以及切片。在200 mL结晶皿中准备150 mL choline-aCSF，并将其置于维持在32 °C的加热水浴中。在结晶皿内放置尼龙网筛，以保留切下的脑片。此装置将用于切片后立即恢复10分钟。
    2. 在开始解剖（第3.2节）前至少30分钟，开始用碳合气（carbogen）对上述两种溶液（冰上的70 mL choline-aCSF和32 °C的150 mL choline-aCSF）进行通气。在整个操作过程中保持持续的碳合气通气。
    3. 准备界面室装置（图1C），用于在使用前保存脑片。
      1. 在一个密封的食品盒（10 × 10 cm 或直径10 cm，高8 cm）中，放置于磁力搅拌器上，放入一个带有磁力搅拌子的200 mL结晶皿。
      2. 向该结晶皿中加入200 mL aCSF，并将3D打印的界面式切片架置于其上（该切片架由两个完全契合的部分组成，中间夹有一层拉伸的聚酰胺网，图1A,B）。
      3. 从结晶皿中移除多余的液体，仅保留一层薄液膜覆盖在界面切片架的网格上。这将在后续形成围绕脑片的细小液环（但不淹没脑片）。
      4. 在食品盒底部加入几毫米深的aCSF，并开始用碳合气通气（首次使用时，在密封食品盒的侧壁上打一个小孔，以确保通气管可以进入盒内）。
      5. 在保持持续碳合气通气的同时封闭密封盒。这将形成一个湿润的、富含95% O2/5% CO2的环境，脑片在choline-aCSF中恢复后将被转移至此，并在成像前维持在此环境中。该装置在本文中称为“界面室”（图1C）。
  2. 脑组织解剖与切片
    1. 通过腹腔注射50 mg·mL-1戊巴比妥钠（每20 g小鼠体重注射0.15 mL）麻醉小鼠，固定动物，暴露心脏，并使用蠕动泵以10 mL冰冻、碳合气饱和的choline-aCSF（见步骤3.1.1）进行心脏灌注。观察肝脏变苍白作为灌注良好的指标。灌注过程持续时间少于5分钟。
    2. 断头处死小鼠，剪开皮肤暴露颅骨。使用大剪刀从枕骨大孔处做两个横向切口和一个纵向长切口，再用精细镊子去除颅骨骨板。
    3. 迅速而轻柔地取出脑组织（用时少于1分钟），并将其放入盛有剩余（约60 mL）冰冻choline-aCSF的80 mL烧杯中（仍持续碳合气通气），冷却1分钟。
    4. 将脑组织转移至预先用aCSF润湿的滤纸上。
    5. 根据感兴趣脑区及偏好的切片角度裁剪脑组织。例如，若要在冠状面上成像丘脑或海马，可用手术刀片切除小脑，然后分别从脑组织的前端和后端各切除约2 mm。
      注意：必须去除过于靠前或靠后的脑组织部分，因为修剪至目标区域所需处理的脑组织越小，切片速度越快。建议整个切片过程（步骤3.2.7）在20分钟内完成。
    6. 对于冠状切片，将脑组织的尾侧面向下，用氰基丙烯酸酯胶水粘附于一个10 cm培养皿底部，该培养皿已固定在振动切片机的切块台上，并将整体置于振动切片机的储液室中，而该储液室位于一个装满冰的大容器内。然后，将所有剩余的冰冻choline-aCSF倒入培养皿中。
    7. 在持续对冰冻choline-aCSF通入95% O2/5% CO2混合气体的条件下，以300 µm厚度进行冠状切片（切速：0.08 mm·s-1，刀片振动频率：60 Hz，振幅：1 mm）。
    8. 使用宽口（直径4 mm）一次性移液管，在每次刀片通过后逐一切取脑片，以避免切片边缘释放的毒性物质积累。转移过程中注意避免产生气泡，并将每一片脑组织放入32 °C的choline-aCSF中恢复约10分钟。
    9. 用移液管将脑片转移至滴有choline-aCSF的镜头纸片上。吸除多余的choline-aCSF，然后用刮铲将附着在镜头纸上的脑片转移至含有室温碳合气饱和aCSF的界面室网格上（见3.1.3.5）。让脑片在此环境中恢复至少30分钟。
      注意：此后脑片即已准备好，可用于小胶质细胞成像。从幼年小鼠（小于一个月龄）提取脑组织后，脑片可在6小时内使用；从两个月龄成年小鼠提取脑组织后，脑片可在4小时内使用。

4. 双光子显微镜

  1. 参数设置
    1. 打开多光子系统（混合探测器、激光器、扫描器、电光调制器、显微镜）。
    2. 将激光器调谐至920 nm，检查激光器是否处于锁模状态，并将功率设置为5%–15%，增益设置为10%。这相当于物镜下的功率为3–5 mW。确保使用非扫描探测器，并安装适当的发射和激发滤光片。
    3. 设置成像软件参数如下：帧尺寸为1024 × 1024像素，对应成像区域为295.07 × 295.07 µm；放大倍数设为2。若信号噪声较高，应用2次线平均。像素动态范围设置为12位或更高。
      注意： 较高位数的图像比低位数的图像能更清晰地区分荧光强度的微小差异：在8位图像中1个灰度值的变化，相当于12位图像中的16个灰度值变化，以及16位图像中的256个灰度值变化。因此，高位数图像更适合进行定量分析，但由于图像文件大小随位深度增加而增大，存储空间和计算能力可能成为限制因素。
    4. 选择扫描模式XYZT，Z轴间隔范围为2 µm，T轴间隔为2 min。
      注意： x、y 和 z 方向的分辨率由奈奎斯特采样定理确定。Z 轴步长约为 0.8 时，最适合分辨小胶质细胞突起（直径为 <1 µm），但多光子显微镜的光学分辨率存在限制（在920 nm波长下使用数值孔径为0.95的物镜时，轴向分辨率约为1 µm）。除了这一物理限制外，在活体成像实验中，灵敏度或信噪比、分辨率、成像速度以及总观察时间同样至关重要。综合考虑上述各项参数，许多研究中采用2 µm的z轴步进（z-step）3,11,14)，选择1024 × 1024像素的图像尺寸，并使用配备HyD探测器的共振扫描器进行高速采集（采集50个z层约需15秒）。采集频率为每2分钟获取一次XYZT序列，总时长为30分钟。若设备速度或灵敏度不足，可降低横向分辨率（低至512 × 512）或减少z切片数量（仅对荧光信号最强的z深度进行成像）[即， 而非荧光较弱的最深层z切片]，或降低扫描速度。也可通过增大z步进至3 µm来降低轴向分辨率，但由于这可能影响定量结果，所有需相互比较的实验应采用相同的z步进设置。
      注意： 可在CX3CR1creER-YFP小鼠的脑片上进行类似的实验18，一种仅用于在小胶质细胞中诱导基因删除的小鼠品系，其小胶质细胞组成性表达黄色荧光蛋白（YFP）。然而，与CX3CR1中绿色荧光蛋白（GFP）相比，YFP的表达水平非常低GFP/+ 小鼠；因此，成像可行但具有挑战性，需要优化采集参数。建议按如下方式调整。
    5. 将激光器调至 970 nm（相较于 920 nm 更适合 YFP 激发），功率设为 50%，增益设为 50%，此时物镜下的激光功率为 5 - 6 mW。
    6. 将线平均值设为4（或更高）以提高信噪比。
  2. 切片与玻璃微电极的定位及化合物的局部施加
    1. 在开始记录前30分钟，将蠕动泵连接至记录室。用50 mL超纯水清洗整个灌流系统后，开始向记录室灌流盛于玻璃烧杯中的aCSF（50 mL），并持续通入碳合气（carbogen）以保持恒定氧合。实验过程中，使用管路式微型加热器或帕尔贴加热器将循环的aCSF温度维持在32 °C。
      注意： 设计了一种具有顶部和底部灌流的特制灌流 chamber，以优化脑片两侧的氧合。该灌流 chamber 由两个完全匹配的部分组成，其间夹有一层拉伸的聚酰胺网膜（图2A、B与其他类型的腔室相比，该腔室可减少脑片底部神经元的死亡，提高脑片存活率，并减轻因脑片肿胀引起的移动。
    2. 使用宽口一次性移液管将待成像的脑片转移至aCSF烧杯中，以去除滤纸片，待其自然下沉（以确认无气泡附着），随后将其转移至记录（灌流）室。
    3. 将切片固定器（由铂金制成的发夹状结构，两端通过平行的尼龙线连接）放置在切片上，以尽量减少灌流液流动引起的切片移动。
    4. 使用明场照明，结合低倍物镜（5X 或 10X），定位目标脑区（曝光时间：50 至 80 ms）。切换至高倍水浸物镜（25X 配合 0.35X 镜头），并调整位置。
      注意： 避免对靠近切片夹持器尼龙线的区域进行成像，因为这些尼龙线可能遮挡光线并对切片局部造成形变。确保目标区域平整。必要时，可取出切片夹持器以重新调整切片和/或夹持器的位置。
    5. 使用荧光照明在视野中定位待成像的荧光小胶质细胞（曝光时间：250 - 500 ms）。
      注意： 此步骤可使研究人员检测目标区域中细胞的存在情况及其荧光强度，并控制细胞碎片的数量。
    6. 用含有ATP、5-HT或目标药物（终浓度）的aCSF回填移液管，体积为10 µL。将移液管尖端朝下，轻轻晃动，以去除尖端内残留的气泡。
      注意： 如果待注射溶液容易产生气泡，可考虑使用带内部细丝的硼硅酸盐移液管。三磷酸腺苷（ATP）从移液管中泄漏可能在注射前即吸引小胶质细胞突起（若发生此情况，在分析步骤中可见）。尽管在所用ATP浓度（500 µmol·L⁻¹）下该现象应较为轻微，-1），如果存在问题，可在步骤 4.2.6 添加 ATP（或其他化合物）溶液之前，先用 2 mL aCSF 预填充微量移液器。
    7. 将装满溶液的移液管安装在移液管架上，通过透明管路连接至一支5 mL注射器，注射器推杆置于5 mL刻度位置。移液管架本身则固定在三轴显微操作器上。
    8. 在明场照明下，使用显微操作器将移液管置于视野中央。为实现可重复且最佳的居中效果，应显示并利用图像上的标尺进行定位。
    9. 轻轻将移液管向切片方向移动，同时控制并调整物镜位置，直至移液管尖端轻微接触切片表面。一旦观察到移液管接触到切片即停止下降，可使移液管尖端穿透切片表面约80 - 100 µm（参见 图3B).
    10. 调节激光器（参见上述参数），并将显微镜切换至多光子模式。确保成像腔室屏蔽所有光源（例如计算机屏幕发出的光）。打开非扫描探测器并设置增益。使用带有颜色编码上限的查找表（LUT），以避免图像中像素饱和。
    11. 确定待成像切片的厚度（即荧光可检测到的上下 z 轴位置，通常总厚度在 220 至 290 µm 之间）。
      注意： 在脑片表面，与内部相比，突起的密度增加，小胶质细胞密度也可能增加，且常具有不寻常的形态。这种聚集现象会随着时间推移而更加明显（即.，这在最后一张脑片中比在第一张中更明显。因此，前约30 µm的z平面不应用于分析，甚至可在采集时跳过。
    12. 开始记录，总时长为30分钟（或根据需要更长时间），在5分钟基线期后，局部施加待测化合物（无需中断成像过程）。操作时，缓慢推动连接至微移液管的注射器活塞，从5 mL位置推至1 mL位置（约5秒内完成）。按压活塞时应立即感受到阻力；若无阻力，提示可能尖端已损坏。
      注意： 对于有经验的操作者，采用该方法进行注射具有可重复性；但除了手动操作移液器外，也可将移液器连接至自动压力喷射系统，以更精确地控制注射体积。注射会在注射部位引起脑片的物理形变。这种形变在注射后前两到三张图像中可见，但在第四张图像（即注射后8分钟）中应已不可见。若形变持续存在，请考虑调整移液器制备的相关参数。
    13. 采集结束（30 分钟）后，弃去微量移液管并取出脑片。如需要，可对脑片进行固定以进行后续免疫标记。例如，SNAPSHOT 方法已针对厚脑片的固定和染色进行了优化23.
    14. 在开始对新切片进行成像之前，先制作二维视频（第5.1节），以检查小胶质细胞是否具有正常形态并处于运动状态，从而确认切片处于健康状态。

5. 小胶质细胞突起趋化性的分析

  1. 二维投影与漂移校正
    1. 使用 Fiji24 打开文件（.LIF）。
    2. 如有必要，仅保留感兴趣的 z 平面，创建一个子堆栈（Image/Stacks/Tools/Make Substack）。例如，如果采集了切片表面对应的 z 平面但不用于分析（见步骤 4.2.11 后的 NOTE），以及最深层无荧光信号的 z 平面，应予以排除。最终的堆栈通常包含 90 - 110 个 z 切片（180 - 220 µm）。
    3. 启动 Z 投影 功能（Image/Stacks/Z Project），选择 最大强度投影 模式，对每个时间点采集的 z 堆栈进行投影。
    4. 启动 MultiStackReg 插件（Plugin/Registration/MultiStackReg），选择 Action 1: Align 和 Transformation: Rigid Body，以校正在采集过程中可能出现的轻微漂移。将校正后的二维视频另存为新文件（.tiff）。
  2. 数据处理
    1. 使用 Icy25 打开该新文件。
    2. 在注射位点中心绘制一个直径为 35 µm 的圆形 R1 �感兴区（ROI），注射位点可通过移液管的阴影及注射时造成的组织形变来识别。
    3. 使用插件 ROI intensity evolution，测量 R1 区域随时间变化的平均强度。
    4. 将结果保存为 .XLS 文件。
  3. 结果的量化与呈现
    1. 为量化小胶质细胞随时间的反应，需在每个时间点计算以下比值：
      静态平衡公式；比率分析；数学表达式；教学示意图。
      其中，R1(0) 表示注射前 R1(t) 值的平均值。随后，可将结果绘制成小胶质细胞反应的动力学曲线，或在特定时间点进行展示（见 图 7）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种在幼年或成年（至少两个月龄以内）小鼠的急性脑切片中，诱导、观察和量化小胶质细胞突起朝向局部施加的化合物（例如ATP或5-HT）定向生长的方法。为了使成年动物的脑切片在数小时内保持健康状态，本方案采用了两种工具，分别在两个步骤中优化细胞存活。首先，界面式切片槽（图1）中的界面切片架可在切片完成后改善切片的保存状态。其次，记录槽（图2）配备灌流系统，可在成像过程中使人工脑脊液（aCSF）同时从切片的上方和下方流过。此处使用的记录槽尺寸设计为适配标准显微镜，其外形与传统的浴槽插件相似（外径为62 mm）；但由于其模型可从补充材料中下载，因此设计可根据需要调整，以适配其他尺寸的切片槽。需要注意的是，每个槽均由两个完全匹配的部件组装而成，无需使用胶水，中间夹有一层拉伸的聚酰胺网。

为了在小范围内递送AT...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过保持脑组织的结构完整性并仅进行有限的网络调整，与解离培养或器官型脑片培养不同，急性脑片使研究人员能够在接近生理环境的条件下研究小胶质细胞。然而，其主要局限性之一在于切片过程本身会造成损伤，这些损伤可能迅速影响神经元的存活，尤其是在成年脑组织中。由于小胶质细胞对细胞损伤具有高度反应性，因此尽可能减少神经元死亡对于维持小胶质细胞接近其生理状态至关重要。这也进一步有助于 通过 良性循环，有助于切片整体状态的改善。

本文所述方案结合了文献中报道的多项电生理实验改进措施，旨在提高脑片在数小时内的存活率，尤其是成年小鼠脑片的存活率。为克服与年龄相关的脑片存活能力差异，我们在心脏灌注、脑片切割及恢复阶段均以胆碱替代钠离子，并使用胆碱-aCSF溶液，从而将细胞兴奋性毒性降至最低29,30需要注意的是，除了胆碱型人工脑脊液（choline-aCSF）之外，还有许多其他高效用于神经元保护的人工脑脊液配方，例如N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）-aCSF

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢巴黎铁匠研究所的细胞与组织成像中心，所有图像的采集与分析均在此完成。本研究部分得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（Inserm）、索邦大学科学部以及索邦大学—皮埃尔与玛丽·居里大学（Emergence-UPMC 2011/2014 计划）、脑科学研究基金会、法国基金会、法国医学研究基金会"FRM 团队项目 DEQ2014039529"、法国科研部（法国国家科研署 ANR-17-CE16-0008 及“未来投资”计划"Bio-Psy Labex" ANR-11-IDEX-0004-02）以及计算神经科学合作研究项目（美国国家科学基金会/法国国家科研署，编号：1515686）的资助。所有作者均隶属于巴黎神经科学学院（ENP）和 Bio-Psy Labex 的成员研究团队。F.E. 是法国巴黎索邦大学博士学院（F-75005）的博士研究生，由 Bio-Psy Labex 提供经费支持。V.M. 是计算神经科学合作研究项目（美国国家科学基金会/法国国家科研署，编号：1515686）资助的博士后研究员。作者感谢 Marta Kolodziejczak 对本项目启动阶段的参与。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>用于移液器准备
克拉克硼硅酸盐薄壁毛细管哈佛仪器30-0065硼硅酸盐薄壁毛细管（无细丝），外径1.5 mm，内径1.17 mm，长度75 mm，每包225支
DMZ 通用拉马Zeitz Instruments
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>用于溶液
二水合氯化钙（CaCl₂）2)SigmaC5080
氯化胆碱SigmaC7527
D-(+)-葡萄糖SigmaG8270
L-抗坏血酸SigmaA5960
1 M 氯化镁溶液（MgCl₂）2)Sigma63020
氯化钾 SigmaUltra >99.0%（KCl）SigmaP9333
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)SigmaS5761
氯化钠（NaCl）SigmaS5886
磷酸二氢钠SigmaS5011
丙酮酸钠SigmaP2256
超纯水MilliQ所有溶液
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>用于切片制备
2个200 mL结晶皿
80 mL Pyrex烧杯
Antlia-3C 数字蠕动泵DD Biolab178961小鼠灌注与双光子成像腔室灌注（aCSF）
Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France Industrie
DolethalVetoquinolDolethal 50 mg/mL
滤纸（Whatman）SigmaWHA1001042Whatman 定性滤纸，1 级（孔径：11µM
精细剪刀 - 锐利Fine Science Tools14060-60
食品盒，直径10 cm，高8 cm
胶水（氰基丙烯酸乙酯）Loctite超级胶水 3 代强力柔韧型
海马体解剖刀（刮匙）Fine Science Tools10099-15最大的肢体必须成90度角°
冰
虹膜镊（弯型）MoriaMC31
镜头清洁纸THOR LABS
尼龙网筛直径7厘米
剃刀刀片电子显微镜科学公司72000对于切片机
手术刀片
切片界面固定装置自制，3D打印文件见补充材料
手术剪 - 锐头精细科学工具14002-14
振动切片机赛默飞世尔科技720-2709型号：HM 650V（振动切片机）
水浴锅设定为32 °C（第一次回收步骤）
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>用于切片成像
× 25倍，数值孔径0.95，水浸物镜徕卡显微系统（德国）HCX Irapo
配备共振扫描器（8 kHz）和两个HyD混合探测器的2光子MP5直立显微镜徕卡显微系统（德国）
Antlia-3C 数字蠕动泵DD Biolab178961用于2光子成像室的aCSF灌流
Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France IndustrieI1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 钛宝石激光器Coherent（德国）
一次性移液管，宽口ThermoFischer scientific例如：232-115.8 mL，带鳍状尖端，但我们将其截短（约7 cm），使口径为4 mm
发射滤光片 SP680徕卡显微系统（德国）
含525/50发射滤光片和560二向色滤光片的荧光立方体（用于荧光收集）徕卡显微系统公司（德国）
装有50 mL ACSF的玻璃烧杯，用于维持脑片的持续灌流
加热系统Warner Instrument Corporation自动加热控制器 TC-324B以保持灌注液温度在32 °C
灌流室自制，3D打印文件见补充材料
切片架（"竖琴")自制：由铂金制成的发夹，两个分支通过平行的尼龙线连接
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>用于切片刺激
腺苷5′′三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP）SigmaA-26209现配：实验当天配制 1 mg/mL (3 mM) 储存液，4 ℃ 保存 °C（数小时）并在使用前立即稀释
荧光素（可选）SigmaF-6377使用于 1 µM 终浓度
显微操作仪Luigs and NeumannSM7连接至微移液器支架
微量移液器架与电生理学相同
盐酸血清素SigmaH-952350 mM 储存液的等分试样（溶于 H）20 保存在 -20 °C. 500 µ实验当天配制的 M 溶液。
5 mL 注射器（无针头）泰尔茂医疗产品SS+05S1
透明管Fischer Scientific11750105圣戈班高性能塑料™ Tygon™ E-3603 非DEHP管路
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>用于图像分析
Fijihttps://fiji.scSchindelin, J. 等, Nat. Methods (2012) doi 10.1038
冰冷巴斯德研究所http://icy.bioimageanalysis.orgde Chaumont, F. 等. Nat. Methods (2012)
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>小鼠
CX3CR1-GFP 小鼠Jung 等，2000雄性或雌性，P3至2月龄；我们已将这些小鼠回交至129sv背景。
CX3CR1creER-YFP 小鼠Parkhurst 等，2013雄性或雌性，出生后第3天至2月龄；我们已将这些小鼠在129sv遗传背景下进行了回交。

参考文献

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ATP 5 chamber

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