人脐带（UC）可在早产、足月及过期分娩的围产期获得。本方案中，我们描述了从妊娠19-40周的胎儿/婴儿脐带中分离和鉴定脐带来源的间充质干细胞（UC-MSCs）的方法。
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摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）具有显著的治疗潜力，在生物医学领域受到越来越多的关注。MSCs最初从骨髓（BM）中分离并被鉴定，随后也可从脂肪组织、滑膜、皮肤、牙髓以及胎盘、脐带血（UCB）和脐带（UC）等胎儿附属组织中获取。MSCs是一类异质性细胞群体，根据国际细胞治疗学会（ISCT）目前的定义，其具备以下特征：（1）在标准培养条件下可贴附于塑料表面；（2）表达CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR-表型的表面标志物；（3）具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞三系分化的潜能。尽管骨髓是MSCs最常用的来源，但骨髓穿刺具有侵入性，因此在伦理上限制了其可及性。来源于骨髓的MSCs其增殖和分化能力通常随供体年龄增长而下降。相比之下，来源于脐带（UC）的胎儿MSCs具有增殖和分化能力强等优势。由于脐带通常被视为医疗废弃物，因此采集脐带不存在伦理问题。人类脐带在妊娠4–8周时随着羊膜腔的持续发育而开始形成，并不断生长，直至达到50–60 cm的长度，可在整个新生儿分娩过程中进行分离。为了深入理解难治性疾病的发生机制，我们已利用来自不同妊娠周数分娩婴儿的脐带来源MSCs（UC-MSCs）。在本方案中，我们描述了从妊娠19–40周胎儿/婴儿中分离和鉴定UC-MSCs的方法。
引言
间充质干细胞（MSCs）最初从骨髓（BM）中分离并鉴定1,2，但也可从多种组织中获取，包括脂肪组织、滑膜、皮肤、牙髓以及胎儿附属结构3。MSCs 被认为是一类异质性的细胞群体，能够增殖并分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。此外，MSCs 具有向损伤部位迁移、抑制和调节免疫反应以及重塑和修复损伤的能力。目前，来源于不同组织的 MSCs 作为细胞治疗的来源，已引起越来越多的关注，可用于治疗多种难治性疾病，包括移植物抗宿主病、心肌梗死和脑梗死4,5。
尽管骨髓（BM）是间充质干细胞（MSCs）最明确的来源，但骨髓穿刺具有侵入性，因此在伦理上限制了其可获取性。来源于骨髓的MSCs的增殖和分化能力通常随供体年龄增长而下降。相比之下，来源于胎盘附属物（如胎盘、脐带血（UCB）和脐带（UC））的胎儿MSCs具有诸多优势，包括取样时伦理争议较少，且具有较强的增殖和分化能力6,7。在通常作为医疗废物丢弃的胎儿附属物中，UCB和UC被视为胎儿器官，而胎盘则被视为母胎组织。此外，胎盘和UCB必须在新生儿出生的瞬间立即采样和收集，而胎盘和UC则可在新生儿出生后收集和处理。因此，UC是细胞治疗中一种极具前景的MSC来源8,9。
人类脐带（UC）在妊娠4-8周时随着羊膜腔的逐渐扩张而开始发育，持续生长至长度达50-60 cm，并可在整个新生儿分娩过程中被分离获取10。为了深入了解难治性疾病的病理生理机制，我们采用来自不同妊娠周数分娩婴儿的脐带来源间充质干细胞（UC-MSCs）11,12。在本实验方案中，我们描述了如何从妊娠19-40周的胎儿/婴儿中分离并鉴定UC-MSCs。
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方案
本研究使用人类样本已获神户大学医学研究生院伦理委员会批准（批准号：1370 和 1694），并按照批准的指南进行。
1. 脐带间充质干细胞的分离与培养
注意：采用本方案已成功从200多份脐带组织中分离、培养并扩增了脐带间充质干细胞（UC-MSCs）（传代次数超过4代）。在200多份脐带组织中，100%实现了UC-MSC的成功分离，不到5%出现意外污染，不到15%出现生长停滞，超过80%实现了UC-MSC的成功扩增。
- 收集脐带组织（UC）。
- 准备一个50 mL塑料离心管、一把无菌剪刀和一瓶4 °C预冷的α-修改型伊格尔最低必需培养基（alpha MEM）。
- 使用手术剪在新生儿剖宫产出生后尽快无菌地剪取约5-10 cm长的脐带组织（UC）。
- 立即将脐带组织放入50 mL塑料离心管中，并向管内加入20-30 mL alpha MEM。
- 将脐带组织在室温（RT）下保存，直至运送至实验室。
注意：无菌脐带组织可在无血清培养基中于室温保存最多2天。因此，若邻近医院获取的脐带组织可在2天内送达实验室，则也可用于实验。
- 解剖脐带组织（UC）。
- 准备一个塑料托盘、灭菌剪刀和镊子、10 mL移液管、25 mL移液管、两个60 mm组织培养皿、磷酸盐缓冲液（PBS）、纯化的酶混合物（见材料表，用无菌PBS重悬至浓度为13 Wünsch单位/mL，并于-80 °C保存）以及一瓶500 mL低血清培养基（见材料表）。
- 将PBS、纯化酶混合物、低血清培养基和培养基[含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液（AA），4 °C保存]恢复至室温（RT）。
- 从离心管中取出脐带组织并置于塑料托盘中。
- 用灭菌剪刀称取并解剖5 g脐带组织。
- 使用10 mL移液管将10 mL 70%乙醇覆盖于脐带组织表面进行消毒。
- 使用10 mL移液管用PBS洗涤脐带组织两次，每次10 mL。
- 将脐带组织放入一个灭菌的60 mm组织培养皿中（见图1，步骤1）。
- 向培养皿中加入10 mL低血清培养基。
- 加入0.5 mL纯化酶混合物，使终浓度约为0.62 Wünsch单位/mL。
注意：使用纯化酶混合物替代传统胶原酶已被证明可提高从脐带组织中分离的脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的得率和存活率。 - 用灭菌剪刀和镊子将脐带组织剪成2-3 mm大小的组织块（见图1，步骤2）。
注意：此过程约需30分钟。 - 将组织块置于5% CO2培养箱中，37 °C孵育30分钟。
- 将部分消化的组织块进一步剪切成更小的碎片，使其能顺利通过25 mL移液管。
注意：此过程约需30分钟。 - 将更小的组织块继续在5% CO2培养箱中，37 °C孵育15-45分钟。
注意：孵育需持续至匀浆液变得黏稠，总消化时间约为120分钟。然而，若使用早产儿的脐带组织，则因组织更易剪切和消化，消化时间可适当缩短。
- 分离脐带间充质干细胞（UC-MSCs）。
- 准备四个50 mL塑料离心管和一瓶500 mL培养基。
- 使用25 mL移液管将脐带组织匀浆液分装至两个50 mL塑料离心管中，每管约7.5 mL。
- 向每管中加入20 mL培养基并充分混匀。
- 使用25 mL移液管将每份脐带组织匀浆液通过置于新的50 mL收集管上方的100 µm细胞滤网进行过滤，以收集来源于脐带的细胞。
注意：由于消化后的脐带溶液具有黏性，每份过滤过程约需15分钟。 - 将两管样品在1,000 × g条件下离心5分钟。
- 小心吸除上清液并弃去。
- 用5 mL培养基重悬两个离心管中的细胞沉淀。
- 将细胞悬液转移至一个新的60 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2培养箱中培养（见图1，步骤3）。
- 培养脐带间充质干细胞（UC-MSCs）。
- 将PBS、胰蛋白酶-EDTA（0.25 w/v%）和培养基（含10% FBS和1% AA的alpha MEM）恢复至室温（RT）。
- 当细胞贴附于60 mm培养皿时，移除培养基，并用5 mL PBS洗涤两次，以去除碎片和红细胞。
注意：贴壁细胞通常在初次接种后3-5天出现（见图1，步骤4）。 - 每周更换培养基两次，并在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养，直至细胞融合度达到90-100%。
注意：此过程通常在初次接种后7-14天完成。 - 用5 mL PBS洗涤细胞两次，加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育5-10分钟。
- 当细胞变圆并脱落时，加入9 mL培养基并充分混匀以中和胰蛋白酶活性。
- 将细胞悬液转移至一个新的100 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2培养箱中培养（见图1，步骤5）。
- 每周更换培养基两次，并在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养，直至细胞融合度达到90-100%。
注意：此过程通常在初次接种后4-8天完成。 - 用10 mL PBS洗涤细胞两次，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育5-10分钟。
- 当细胞变圆并脱落时，加入9 mL培养基并充分混匀以中和胰蛋白酶活性。
- 将细胞悬液分装至两个新的100 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2培养箱中培养（见图1，步骤5）。
- 以1:2比例传代，直至第十代（见图1，步骤5）。
注意：由于在较低融合度条件下培养的细胞更容易提前进入增殖停滞，因此以1:2的传代比例进行传代至关重要。 - 使用第五至第八代细胞进行细胞表面标志物分析、细胞分化实验及其他相关实验。
注意：为尽可能延长细胞的旺盛增殖能力，通常应在细胞融合度超过70-80%的条件下进行培养。
2. 脐带间充质干细胞表面标志物表达
- 在100 mm培养皿中培养细胞，并加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育5–10分钟以消化细胞。
- 加入9 mL培养基终止消化，然后在1,000 × g离心5分钟。
- 吸除上清液并弃去。
- 用10 mL PBS重悬细胞沉淀，在1,000 × g离心5分钟。重复此洗涤步骤两次。
- 用流式细胞术（FCM）缓冲液（含2 mM EDTA和10%封闭试剂的PBS）将细胞重悬至浓度约为1 × 106 个细胞/mL。
- 取50–100 µL细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，加入针对CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105或HLA-DR的藻红蛋白（PE）标记抗体，冰上避光孵育45分钟。
- 用FCM缓冲液洗涤细胞两次，然后加入50–100 µL 0.2%活性染料溶液（见材料表）。
- 室温避光孵育15分钟，再用FCM缓冲液洗涤两次，最后通过70 µm细胞滤网过滤。
- 将细胞上机进行流式细胞术检测，并根据仪器制造商的说明使用FCM分析软件处理和分析所得数据。
3. 脐带间充质干细胞的三系分化
- 进行脂肪生成。
- 将细胞悬液用培养基配制为浓度 5 × 103 个细胞/mL。
- 在12孔板中每孔接种1 mL细胞悬液，于37 °C、5% CO2 培养箱中培养约24小时。
- 弃去培养基，更换为脂肪诱导分化培养基（见材料表），于37 °C、5% CO2培养箱中继续培养2-3周，每周更换两次脂肪诱导分化培养基。
- 用PBS洗涤细胞三次。
- 在室温下用4%甲醛溶液固定细胞30分钟。
- 用PBS洗涤细胞三次，再用60%异丙醇洗涤三次。
- 通过将84 mg油红O溶解于10 mL 100%异丙醇中，再加入6.7 mL蒸馏水，配制0.5%油红O溶液。每孔加入1 mL 0.5%油红O溶液，在室温下染色20分钟。
- 用60%异丙醇洗涤细胞三次，显微镜下观察。
- 进行成骨分化。
- 将细胞悬液用培养基配制为浓度 1 × 104 个细胞/mL。
- 在12孔板中每孔接种1 mL细胞悬液，于37 °C、5% CO2培养箱中培养约24小时。
- 弃去培养基，更换为成骨诱导分化培养基（见材料表），于37 °C、5% CO2培养箱中继续培养1-2周，每周更换两次成骨诱导分化培养基。
- 用PBS洗涤细胞三次。
- 在室温下用4%甲醛溶液固定细胞30分钟。
- 用PBS洗涤细胞三次。
- 通过将200 mg茜素红S溶解于10 mL蒸馏水中，配制2%茜素红S溶液。每孔加入1 mL 2%茜素红S溶液，在室温下染色3分钟。
- 用PBS洗涤各孔三次，显微镜下观察。
- 进行软骨生成。
- 将细胞悬液用培养基配制为浓度 1.6 × 107 个细胞/mL。
- 在12孔板的每孔中央滴加5 µL细胞悬液（微团培养），于37 °C、5% CO2培养箱中培养2-3小时。
- 轻轻加入1 mL软骨诱导分化培养基（见材料表），于37 °C、5% CO2培养箱中继续培养4-7天，每周更换两次软骨诱导分化培养基。
- 用PBS洗涤细胞三次。
- 在室温下用4%甲醛溶液固定细胞30分钟。
- 用PBS洗涤细胞三次。
- 通过将250 mg甲苯胺蓝溶解于500 mL pH 4.1的0.1 M醋酸钠缓冲液中，配制0.05%甲苯胺蓝溶液。每孔加入1 mL 0.05%甲苯胺蓝溶液，在室温下染色30分钟。
- 用PBS洗涤细胞三次，显微镜下观察。
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结果
从脐带采集到间充质干细胞培养的流程概述如下 图1可从所有经剖宫产出生的新生儿中采集长约5-10 cm的脐带。脐带自妊娠4-8周开始发育，并持续生长至长达50-60 cm，如图所示。 图2脐带（UC）中有两条动脉（A）、一条静脉（V）、脐带外膜（CL）和华通胶（WJ），如图所示。 图 3 和 图 4. 可从脐带的所有区域或整段脐带中分离出UC-MSCs13由于早产儿的脐带组织较为脆弱，难以分离出单一的脐带区域，因此从整段脐带中分离培养脐带间充质干细胞（UC-MSCs）11,12. 分离脐带间充质干细胞（MSCs）的方法有多种，包括组织块法1...
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讨论
间充质干细胞（MSCs）可从多种组织中分离获得，属于一群异质性细胞群体，其表型标志物的表达并不完全一致。本文介绍了一种从早产儿和足月儿中收集和解剖脐带（UC）的实验方案，并实现了脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的分离与培养。依据该方案，我们已成功从妊娠19至40周出生的胎儿/婴儿中分离出符合国际细胞治疗学会（ISCT）标准的UC-MSCs19，并证实这些细胞在产前发育过程中可反映某些难治性疾病病理生理学的部分特征11,12。
在骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSCs）中，来自年轻供体的BM-MSCs通常比来自年长供体的细胞具有更强的增殖能力和分化潜能，因而更具细胞治疗应用前景20,21。类似地，从妊娠8-12周流产胎儿中分离获得的早产脐带间充质干细胞（UC-MSCs），其增殖与分化能力也较从妊娠37-...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由日本学术振兴会科学研究费补助金（C）（资助编号：25461644）以及青年学者研究费补助金（B）（资助编号：15K19614、26860845、17K16298）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 塑料管 | AS One Coporation, 大阪, 日本 | Violamo 1-3500-22 | |
| 12 孔板 | AGC Techno Glass, 东京, 日本 | Iwaki 3815-012 | |
| 60 mm 培养皿 | AGC Techno Glass, 东京, 日本 | Iwaki 3010-060 | |
| 细胞滤器（100 μm） | Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, MA | Falcon 35-2360 | |
| 细胞滤器（70 μm） | Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | 和光纯药, 大阪, 日本 | 135-15175 | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich, 圣路易斯, MO | 172012 | |
| 低血清培养基 | Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, MA | Gibco 15240-062 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | 和光纯药, 大阪, 日本 | 209-16941 | |
| PBS | 宝生物工程, 滋贺, 日本 | T900 | |
| 纯化的酶混合液 | Roche, 曼海姆, 德国 | Liberase DH 研究级 05401054001 | |
| PE 标记的小鼠抗 CD14 一抗 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 347497 | 批号: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE 标记的小鼠抗 CD19 一抗 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 340364 | 批号: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE 标记的小鼠抗 CD34 一抗 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 555822 | 批号: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE 标记的小鼠抗 CD45 一抗 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 555483 | 批号: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE 标记的小鼠抗 CD73 一抗 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 550257 | 批号: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE 标记的小鼠抗 CD90 一抗 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 555596 | 批号: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE 标记的小鼠抗 CD105 一抗 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 560839 | 批号: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE 标记的小鼠抗 HLA-DR 一抗 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 347367 | 批号: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE 标记的小鼠 IgG1 k 同型对照 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 555749 | 批号: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE 标记的小鼠 IgG2a k 同型对照 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 555574 | 批号: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE 标记的小鼠 IgG2b k 同型对照 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 555743 | 批号: 3098896, RRID: AB_396086 |
| 活率染料 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | 可固定活率染色 450 562247 | |
| 封闭试剂 | 大日本制药, 大阪, 日本 | Block Ace UKB80 | |
| 流式细胞仪 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | BD FACSAria III 细胞分选仪 | |
| 流式细胞仪软件 | BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ | BD FACSDiva | |
| 成脂分化培养基 | Invitrogen, 卡尔斯巴德, CA | StemPro 成脂分化试剂盒 A10070-01 | |
| 成骨分化培养基 | Invitrogen, 卡尔斯巴德, CA | StemPro 成骨分化试剂盒 A10072-01 | |
| 软骨分化培养基 | Invitrogen, 卡尔斯巴德, CA | StemPro 软骨分化试剂盒 A10071-01 | |
| 甲醛 | Polyscience, 沃灵顿, PA | 16% 超纯甲醛 EM 级 #18814 | |
| 油红 O | Sigma Aldrich, 圣路易斯, MO | O0625 | |
| 茜素红 S | Sigma Aldrich, 圣路易斯, MO | A5533 | |
| 甲苯胺蓝 | Sigma Aldrich, 圣路易斯, MO | 198161 | |
| 显微镜 | Keyence, 大阪, 日本 | BZ-X700 |
参考文献
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