方法文章

早产儿与足月儿来源的人脐带间充质干细胞的分离与鉴定

DOI：

10.3791/58806

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2019年1月26日

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1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

本文内容

摘要

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人脐带（UC）可在早产、足月及过期分娩的围产期获得。本方案中，我们描述了从妊娠19-40周的胎儿/婴儿脐带中分离和鉴定脐带来源的间充质干细胞（UC-MSCs）的方法。

摘要

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间充质干细胞（MSCs）具有显著的治疗潜力，在生物医学领域受到越来越多的关注。MSCs最初从骨髓（BM）中分离并被鉴定，随后也可从脂肪组织、滑膜、皮肤、牙髓以及胎盘、脐带血（UCB）和脐带（UC）等胎儿附属组织中获取。MSCs是一类异质性细胞群体，根据国际细胞治疗学会（ISCT）目前的定义，其具备以下特征：（1）在标准培养条件下可贴附于塑料表面；（2）表达CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR-表型的表面标志物；（3）具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞三系分化的潜能。尽管骨髓是MSCs最常用的来源，但骨髓穿刺具有侵入性，因此在伦理上限制了其可及性。来源于骨髓的MSCs其增殖和分化能力通常随供体年龄增长而下降。相比之下，来源于脐带（UC）的胎儿MSCs具有增殖和分化能力强等优势。由于脐带通常被视为医疗废弃物，因此采集脐带不存在伦理问题。人类脐带在妊娠4–8周时随着羊膜腔的持续发育而开始形成，并不断生长，直至达到50–60 cm的长度，可在整个新生儿分娩过程中进行分离。为了深入理解难治性疾病的发生机制，我们已利用来自不同妊娠周数分娩婴儿的脐带来源MSCs（UC-MSCs）。在本方案中，我们描述了从妊娠19–40周胎儿/婴儿中分离和鉴定UC-MSCs的方法。

引言

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间充质干细胞（MSCs）最初从骨髓（BM）中分离并鉴定1,2，但也可从多种组织中获取，包括脂肪组织、滑膜、皮肤、牙髓以及胎儿附属结构3。MSCs 被认为是一类异质性的细胞群体，能够增殖并分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。此外，MSCs 具有向损伤部位迁移、抑制和调节免疫反应以及重塑和修复损伤的能力。目前，来源于不同组织的 MSCs 作为细胞治疗的来源，已引起越来越多的关注，可用于治疗多种难治性疾病，包括移植物抗宿主病、心肌梗死和脑梗死4,5。

尽管骨髓（BM）是间充质干细胞（MSCs）最明确的来源，但骨髓穿刺具有侵入性，因此在伦理上限制了其可获取性。来源于骨髓的MSCs的增殖和分化能力通常随供体年龄增长而下降。相比之下，来源于胎盘附属物（如胎盘、脐带血（UCB）和脐带（UC））的胎儿MSCs具有诸多优势，包括取样时伦理争议较少，且具有较强的增殖和分化能力6,7。在通常作为医疗废物丢弃的胎儿附属物中，UCB和UC被视为胎儿器官，而胎盘则被视为母胎组织。此外，胎盘和UCB必须在新生儿....

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方案

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本研究使用人类样本已获神户大学医学研究生院伦理委员会批准（批准号：1370 和 1694），并按照批准的指南进行。

1. 脐带间充质干细胞的分离与培养

注意：采用本方案已成功从200多份脐带组织中分离、培养并扩增了脐带间充质干细胞（UC-MSCs）（传代次数超过4代）。在200多份脐带组织中，100%实现了UC-MSC的成功分离，不到5%出现意外污染，不到15%出现生长停滞，超过80%实现了UC-MSC的成功扩增。

  1. 收集脐带组织（UC）。
    1. 准备一个50 mL塑料离心管、一把无菌剪刀和一瓶4 °C预冷的α-修改型伊格尔最低必需培养基（alpha MEM）。
    2. 使用手术剪在新生儿剖宫产出生后尽快无菌地剪取约5-10 cm长的脐带组织（UC）。
    3. 立即将脐带组织放入50 mL塑料离心管中，并向管内加入20-30 mL alpha MEM。
    4. 将脐带组织在室温（RT）下保存，直至运送至实验室。
      注意：无菌脐带组织可在无血清培养基中于室温保存最多2天。因此，若邻近医院获取的脐带组织可在2天内送达实验室，则也可用于实验。
  2. 解剖脐带组织（UC）。

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结果

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从脐带采集到间充质干细胞培养的流程概述如下 图1可从所有剖宫产新生儿中收集长约5-10 cm的脐带。脐带自妊娠4-8周开始发育，并持续生长至长度达50-60 cm，如图所示。 图2脐带（UC）中有两条动脉（A）、一条静脉（V）、脐带外膜（CL）和华通胶（WJ），如图所示。 图 3 和 图 4. 可从脐带的所有区域或整条脐带中分离出UC-MSCs13由于早产儿的脐带组织较为脆弱，难以分离出单一的脐带区域，因此从整段脐带中分离培养脐带间充质干细胞（UC-MSCs）11,12. 分离脐带间充质干细胞（MSCs）的方法有多种，包括组织块贴壁法14.......

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讨论

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间充质干细胞（MSCs）可从多种组织中分离获得，属于一群异质性细胞群体，其表型标志物的表达并不完全一致。本文介绍了一种从早产儿和足月儿中收集和解剖脐带（UC）的实验方案，并实现了脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的分离与培养。依据该方案，我们已成功从妊娠19至40周出生的胎儿/婴儿中分离出符合国际细胞治疗学会（ISCT）标准的UC-MSCs19，并证实这些细胞在产前发育过程中可反映某些难治性疾病病理生理学的部分特征11,12。

在骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSCs）中，来自年轻供体的BM-MSCs通常比来自年长供体的细胞具有更强的增殖能力和分化潜能，因而更具细胞治疗应用前景20,21。类似地，从妊娠8-12周流产胎儿中分离获得的早产脐带间充质干细胞（UC-MSCs），其增殖与分化能力也较从妊娠37-.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究由日本学术振兴会科学研究费补助金（C）（资助编号：25461644）以及青年学者研究费补助金（B）（资助编号：15K19614、26860845、17K16298）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 塑料管AS One Coporation, 大阪, 日本Violamo 1-3500-22
12 孔板AGC Techno Glass, 东京, 日本Iwaki 3815-012
60 mm 培养皿AGC Techno Glass, 东京, 日本Iwaki 3010-060
细胞滤器（100 μm）Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, MA Falcon 35-2360
细胞滤器（70 μm）Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, MA Falcon 35-2350
Alpha MEM和光纯药, 大阪, 日本135-15175
胎牛血清Sigma Aldrich, 圣路易斯, MO172012
低血清培养基Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, MAOPTI-MEM Gibco 31985-070
抗生素-抗真菌剂Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, MA Gibco 15240-062
胰蛋白酶-EDTA和光纯药, 大阪, 日本209-16941
PBS宝生物工程, 滋贺, 日本T900
纯化的酶混合液Roche, 曼海姆, 德国Liberase DH 研究级 05401054001
PE 标记的小鼠抗 CD14 一抗BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ347497批号: 3220644, RRID: AB_400312
PE 标记的小鼠抗 CD19 一抗BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ340364批号: 3198741, RRID: AB_400018
PE 标记的小鼠抗 CD34 一抗BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ555822批号: 3079912, RRID: AB_396151
PE 标记的小鼠抗 CD45 一抗BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ555483批号: 2300520, RRID: AB_395875
PE 标记的小鼠抗 CD73 一抗BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ550257批号: 3057778, RRID: AB_393561
PE 标记的小鼠抗 CD90 一抗BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ555596批号: 3128616, RRID: AB_395970
PE 标记的小鼠抗 CD105 一抗BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ560839批号: 4339624, RRID: AB_2033932
PE 标记的小鼠抗 HLA-DR 一抗BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ347367批号: 3219843, RRID: AB_400293
PE 标记的小鼠 IgG1 k 同型对照BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ555749批号: 3046675, RRID: AB_396091
PE 标记的小鼠 IgG2a k 同型对照BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ555574批号: 3035934, RRID: AB_395953
PE 标记的小鼠 IgG2b k 同型对照BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ555743批号: 3098896, RRID: AB_396086
活率染料BD Bioscience, 富兰克林湖, NJ可固定活率染色 450 562247
封闭试剂大日本制药, 大阪, 日本Block Ace UKB80
流式细胞仪BD Bioscience, 富兰克林湖, NJBD FACSAria  III 细胞分选仪
流式细胞仪软件BD Bioscience, 富兰克林湖, NJBD FACSDiva
成脂分化培养基Invitrogen, 卡尔斯巴德, CAStemPro 成脂分化试剂盒 A10070-01
成骨分化培养基Invitrogen, 卡尔斯巴德, CAStemPro 成骨分化试剂盒 A10072-01
软骨分化培养基 Invitrogen, 卡尔斯巴德, CAStemPro 软骨分化试剂盒 A10071-01
甲醛Polyscience, 沃灵顿, PA16% 超纯甲醛 EM 级 #18814
油红 OSigma Aldrich, 圣路易斯, MOO0625
茜素红 SSigma Aldrich, 圣路易斯, MOA5533
甲苯胺蓝Sigma Aldrich, 圣路易斯, MO198161
显微镜Keyence, 大阪, 日本BZ-X700

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaed....

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