本文介绍了两种实验方案，一种用于通过空斑实验和反转录定量PCR（RT-qPCR）测定轮状病毒的特异性生长速率，另一种用于测定轮状病毒的细胞结合能力。这些方案可用于确认不同轮状病毒株之间的表型差异。
本文内容
摘要
摘要
轮状病毒是婴幼儿腹泻的主要病原学因素。它是一种双链（ds）RNA病毒，由于其高突变率，可形成遗传多样性丰富的群体，称为准种。本文描述了如何测定轮状病毒的比生长速率及其细胞结合能力，作为其表型特征。轮状病毒经胰蛋白酶处理以识别细胞受体，随后接种至MA104细胞培养物中。间歇性收集含有子代病毒的上清液。采用空斑试验测定各上清液中的病毒滴度（空斑形成单位：pfu）。通过将pfu/mL的时间序列数据拟合至修正的Gompertz模型，估算比生长速率。在细胞结合试验中，将24孔板中的MA104细胞接种轮状病毒，在4 °C孵育90分钟，使轮状病毒吸附于细胞受体。低温条件可抑制轮状病毒侵入宿主细胞。洗涤去除未结合的病毒颗粒后，提取附着于细胞受体上的病毒RNA，随后进行cDNA合成及逆转录定量PCR（RT-qPCR）。这些实验方案可用于研究不同病毒株之间的表型差异。
引言
由于RNA病毒的突变率高于以DNA为基础的生物，因此形成了遗传多样性丰富的群体，称为准种1，其突变率也较高2。准种的群体结构受到突变、选择压力和遗传漂变等群体遗传学因素的影响。同一遗传谱系内的毒株可能由于遗传多样性而表现出不同的表型。例如，Rachmadi等人研究表明，在源自噬斑纯化的S7-PP3毒株的鼠诺如病毒毒株中，对游离氯的敏感性存在差异3。
轮状病毒（呼肠孤病毒科轮状病毒属）是无包膜的双链RNA病毒，可形成准种2。除上述种群遗传因素外，基因组重配也影响轮状病毒的遗传多样性，因为该病毒具有11个分段的基因组4。轮状病毒主要引起婴幼儿腹泻，2013年估计导致约25万例婴幼儿死亡5。目前多个国家已投入使用两种疫苗，有效减轻了轮状病毒感染的负担，但一些研究人员正在讨论疫苗逃逸突变株的存在6,7,8,9。对这些突变株的表征对于理解疫苗逃逸机制至关重要。
本文介绍了两种检测轮状病毒特异性生长速率和细胞结合能力的实验方案，旨在理解不同毒株或突变体之间的表型差异。既往研究已报道过轮状病毒的生长曲线10，但通常未测定诸如特异性生长速率等生长参数。此前进行的细胞结合实验涉及免疫荧光染色技术11。本文展示了更为简便的方法，即利用空斑实验（plaque assay）和逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），从而能够对病毒表型差异进行定量分析。这些方法适用于轮状病毒表型的特征鉴定，并可能最终有助于开发针对多种基因型有效的新型疫苗。
方案
1. 培养基制备
- 配制细胞培养基（含血清培养基）时，将 4.7 g Eagle's MEM 粉末加入 500 mL 蒸馏水中，120 °C 高压灭菌 20 分钟，然后让培养基冷却至室温。加入胎牛血清（终浓度：10%）、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素-链霉素（1%）和碳酸氢钠（1.125 g/L）。4 °C 保存一个月。
- 按照步骤 1.1 所述方法配制用于病毒扩增的无血清培养基，但不添加胎牛血清。4 °C 保存一个月。
- 对于蚀斑试验，将 100 mL Eagle's MEM 培养基（不含酚红）高压灭菌。待培养基冷却至室温后，加入 2% 胎牛血清、2% 青霉素-链霉素、4 mM L-谷氨酰胺和 2.25 g/L NaHCO3。4 °C 保存。
- 对于蚀斑试验，将 100 mL 2.5% 琼脂糖凝胶高压灭菌。应在进行蚀斑试验当天配制该凝胶，并将其置于 47 °C 水浴中保存。
2. 细胞培养
- 从液氮容器中取出一支含有 MA104 细胞系的冻存管，将其放入 37 °C 水浴中解冻细胞。将 1 mL 细胞悬液加入含血清的培养基中，转移至 T75 培养瓶（总体积 20 mL）。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 2 至 3 天。
注意：细胞悬液的最终细胞浓度约为 106 个细胞/mL。 - 当细胞单层达到 80% 融合度时，吸除上清液，并用 5 mL 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
- 向培养瓶中加入 4 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，于 37 °C 孵育 5 分钟以使细胞从瓶壁脱落。将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 190 × g 条件下离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀细胞（106 个细胞）重悬于 1.1 步骤中配制的 1 mL 含血清培养基中。用培养基将重悬的细胞稀释 100 倍。
- 分别向 6 孔板（用于蚀斑实验）或 24 孔板（用于细胞结合实验）的每孔中加入 3 mL 稀释后的细胞悬液。将培养板置于 37 °C、5% CO2、饱和水蒸气环境的培养箱中培养 2 至 3 天。
注意：T75 培养瓶适用于采集时间序列样本，因为上清液取样体积（1 mL）相对于总上清液体积（30 mL）可忽略不计。同时，各上清液中病毒的感染滴度通过蚀斑实验测定，该实验通常使用 6 孔板进行。细胞结合实验则使用 24 孔板。
3. 轮状病毒的特异性生长速率
注意：本实验方案使用恒河猴轮状病毒（RRV，基因型：G3P[3]），因为RRV能够快速且易于在MA104细胞上形成蚀斑。
- 将含有1 mL病毒悬液（107 pfu/mL）置于无血清培养基中，于-80 °C保存，在37 °C水浴中解冻。向1 mL病毒悬液中加入来自猪胰腺的1 µg/µL胰蛋白酶（终浓度为4 µg/mL），然后涡旋混匀。将病毒悬液在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 在饱和蒸汽下处理30分钟。
注意： 可使用其他来源的胰蛋白酶，但需预先检测其对轮状病毒感染性的影响。 - 用无血清培养基稀释活化的病毒悬液，将感染复数（MOI）调整至0.1 pfu/细胞。
- 在细胞接种后第3天（2.1），向T75培养瓶中80%汇合度的MA104细胞系加入1 mL稀释后的病毒悬液，于37 °C孵育1小时，每15分钟轻轻摇动培养瓶一次。
- 然后，向培养瓶中加入30 mL含有0.13 µg/mL猪胰蛋白酶的无血清培养基。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 在饱和蒸气下
- 在感染后0、6、12、18、24和36（和/或48）小时（hpi）分别从烧瓶中收集1 mL上清液，并使用移液器更换1.5 mL离心管中的上清液。
- 在-80 °C条件下冷冻，随后在37 °C水浴中融化，重复此冻融循环三次。然后在12,600 x g 4 °C下离心10分钟。收集上清液。
- 用经蒸馏的0.2 µm滤器过滤上清液，以去除细胞组分。将上清液于-80 °C冰箱中保存，直至用于空斑实验以测定病毒滴度。
- 将含有收集上清液的离心管（步骤 3.5）置于 37 °C 水浴中。向 1 mL 十倍稀释的样品中加入 4 µg/mL 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 30 分钟。
- 在步骤3.8的30分钟孵育期间，为开始进行空斑试验以测定时间进程样品（步骤3.5）获得的病毒滴度，移除含血清培养基后，用2 mL 1×PBS将6孔板中的MA104细胞洗涤两次。
- 将孵育后的样品用无血清培养基进行系列稀释，并将1 mL稀释后的样品接种至每个孔中。将培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育90分钟。2 在饱和蒸汽下，每15分钟轻轻摇动平板一次。
- 孵育后，从6孔板中移除接种物。向步骤1.3中制备的培养基中加入4 µg/mL胰蛋白酶。立即将3 mL与琼脂糖凝胶混合的培养基（比例为1:1）轻轻加入每孔中。
- 将培养板在室温下放置10分钟以上（直至琼脂糖凝胶完全凝固），随后在37 °C、5% CO₂条件下孵育2天。2 在饱和蒸气下。
注意： 从孔的边缘倒入混有琼脂的培养基。 - 向每个孔中加入 1 mL 用 1x PBS 稀释的 0.015% 中性红溶液，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 在饱和蒸汽下孵育。3小时后去除染料，在37 °C、5% CO₂条件下继续培养1天。2 在饱和蒸气下
- 第二天，计数每个孔中的噬斑数量，并计算 pfu/mL。进行噬斑实验前，需仔细检查细胞汇合度，以确保噬斑数量的准确性。
4. 细胞结合实验
注意：本实验方案基于 Gilling 的研究报告13。
- 向1 mL病毒悬液中加入来自猪胰腺的1 µg/µL胰蛋白酶（最终胰蛋白酶浓度为4 µg/mL），然后涡旋振荡（操作方式同2.1步骤）。用无血清培养基稀释病毒悬液，调整感染复数（MOI）至1 pfu/细胞。
- 用1 mL Tris缓冲盐水（TBS；2.53 g/L Tris碱，6.54 g/L NaCl，0.3 g/L KCl，0.046 g/L Na2HPO4，加蒸馏水定容至1 L）在24孔板上洗涤MA104细胞两次。
- 向含细胞的24孔板每孔接种100 µL稀释后的病毒悬液，在4 °C孵育90分钟，每隔15分钟轻轻摇动一次。
- 移除病毒接种液，并用1 mL TBS洗涤细胞两次。为提取轮状病毒的双链（ds）RNA，向每孔加入140 µL 1× PBS和560 µL RNA提取缓冲液（见材料表）。用移液器充分混匀（约10次，直至缓冲液中细胞残留物或浑浊不可见）。
- 按照试剂盒说明书提取双链RNA（dsRNA）后，将含有dsRNA提取物的1.5 mL离心管置于95 °C金属浴中加热5分钟以变性dsRNA，随后立即置于冰上孵育至少2分钟。
- 使用逆转录试剂盒合成cDNA（见材料表）。向含有16 µL混合液（表1）的PCR管中加入4 µL变性的病毒RNA溶液，用移液器小心混匀，避免产生气泡。短暂离心收集液体。
- 在热循环仪中按照表2所示条件进行逆转录反应。若cDNA不立即使用，可将含cDNA的PCR管于-20 °C保存，最长可达1年。
- 使用定量PCR引物（正向引物：5’-ACCATCTACACATGACCCTC-3’，反向引物：5’-GGTCACATAACGCCCC-3’）14以及插入淬灭基团的探针（qPCR探针：5’-/FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/-3’），靶向轮状病毒NSP3基因片段的963–1049区域（ST3株，GenBank: X81436）。
注：该探针由Zeng等14设计，其中插入了淬灭基团。 - 用PCR级水将标准质粒进行系列稀释（101至106拷贝/mL），加入qPCR反应混合液（表3），并根据表4配制qPCR主混合液（20 µL/样本）。
- 向96孔PCR板每孔加入20 µL主混合液，再加入5 µL cDNA样本或5 µL标准质粒，用移液器吹打混匀10次。按照表4所示条件启动qPCR反应系统。
- 为计算结合于MA104细胞表面的轮状病毒基因组数量，以Ct值与已知拷贝数的标准质粒进行线性回归，估算样本的基因组拷贝数，然后计算结合到细胞上的病毒粒子数（Gt）与初始接种病毒数（G0）的比值。
结果
特异性生长速率和斑块纯化RRV毒株的细胞结合实验的两种方案概述分别如图1A和2A所示。
在比生长速率测定中，当在T75培养瓶上扩增时，最终病毒滴度可达到超过107 pfu/mL。如果最大浓度低于107 pfu/mL，则MA104细胞可能尚未达到汇合状态，或RRV未被胰蛋白酶充分激活。目前已有若干生长模型可用于基于感染单位数据估算比生长速率。在本方案中，以修正的Gompertz模型12为例；
其中，N0（本研究中为 104 pfu/mL）和 Nt（104 至 108 pfu/mL）分别表示病毒在 0 和 t（例如：0、6、12、18、24、36）小时时的感染性滴度（pfu/mL），A 为渐近值 [log(N∞/N0)]（例如：3 至 4），µ 为比生长速率 [1/h]，e 为纳皮尔常数，λ 为延迟期 [h]。模型参数通过分析软件的求解器函数获得，该函数最小化观测值与模型预测值之间差异的平方和。在 图 1B 的示例中，通过将最小二乘法应用于修正的 Gompertz 模型，估计比生长速率（µ）为 0.197 [1/h]，延迟期（λ）为 6.61 [h]，稳态期相对于初始病毒滴度的相对病毒滴度（对数尺度）（A）为 3.15 [log (N∞/N0)]。我们共测试了 6 株轮状病毒克隆株，估计的比生长速率值范围为 0.19 至 0.27 [1/h]。这些估计值是可靠的，因为模型拟合的决定系数大于 0.98。
使用24孔板进行细胞结合实验时，RRV病毒颗粒结合到细胞表面的数量约为103 拷贝/mL（结合效率约为1%）（图2B）。每个样本通常需重复实验三次，若某样本的拷贝数出现较大差异，可能存在过度洗涤或胰蛋白酶对RRV激活不充分等问题。在本研究的qPCR条件下，qPCR的Ct值超过约36.0时结果不理想，被视为低于检测限。
| 体积/每反应 | |
| 5 x PrimeScript Buffer | 4.0 µL |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0 µL |
| Oligo dT 引物 | 1.0 µL |
| 随机六聚体引物（Random 6 mers） | 4.0 µL |
| 去离子蒸馏水 | 6.0 µL |
| ssRNA 样品 | 4.0 µL |
| 总量 | 20.0 µL |
表1：轮状病毒基因组cDNA合成的主混合液组成。
| 温度 [°C] | 时间 |
| 37 | 15 min |
| 42 | 15 min |
| 85 | 5 s |
| 4 | ∞ |
表2：轮状病毒基因组cDNA合成的反应条件。
| 每反应体积 | |
| Premix Taq | 12.5 µL |
| 正向引物 (10 µM) | 0.5 µL |
| 反向引物 (10 µM) | 0.5 µL |
| 探针 (10 µM) | 0.5 µL |
| Reference Dye II | 0.5 µL |
| 去离子蒸馏水 | 5.5 µL |
| cDNA 样品 | 5.0 µL |
| 总计 | 25 µL |
表3：轮状病毒A基因组定量PCR的主混合液组成。
| 温度 [°C] | 时间 | |
| 95 | 5 min | |
| 94 | 20 s | 45 个循环 |
| 60 | 1 min | |
| 72 | 5 min |
表4：轮状病毒A基因组定量PCR的反应条件。
图1：轮状病毒增殖评估及轮状病毒生长曲线的示意图。（A）采用蚀斑法测定轮状病毒的感染单位。（B）根据本实验室的观测数据（白色圆圈），利用修正的Gompertz模型拟合出曲线（蓝色线条）。比生长速率[µ]：0.197 [h-1]，延滞期（λ）：6.61 [h]，稳定期病毒滴度相对于初始滴度的比值（对数尺度）（A）：3.15 [log (N∞/N0)]。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：实验室从空斑中纯化的五种RRV毒株细胞结合实验的示意图及代表性结果。（A）将接种轮状病毒的细胞培养板在4 °C下孵育，以抑制病毒侵入细胞。孵育后去除未与细胞结合的病毒颗粒，通过RT-qPCR定量结合于细胞表面的病毒颗粒所来源的基因组数量。（B）细胞结合实验结果以结合效率（%）表示，即结合的病毒颗粒数与接种物中病毒颗粒总数的比值。粗体条形：中位数，方框末端：四分位距，线条末端：最大值和最小值。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们测量比生长速率的方案比以往的方法更为简便，且可适用于其他病毒，前提是这些病毒已建立细胞培养系统。在本研究中，我们使用了RRV（G3P[3]）毒株，因为该毒株在MA104细胞系中比人轮状病毒更容易形成蚀斑。某些人轮状病毒毒株在此细胞系中无法形成蚀斑。因此，对于许多轮状病毒毒株，可采用焦点形成单位（FFU）检测15或半数组织培养感染剂量（TCID50）检测来替代蚀斑检测16。本文所介绍的比生长速率测定方案可用于其他类型的病毒，但不适用于尚未建立细胞培养系统的病毒。在开始比生长速率实验之前，最好通过预实验预先确定病毒感染滴度何时开始上升并进入稳定期。如果蚀斑数量过多，应在调整病毒样本稀释倍数后重新进行蚀斑检测。采样时间点（感染后小时数，hpi）也至关重要，因为若错过进入稳定期的合适时间点，可能导致指数生长期斜率被低估。在采用修正Gompertz模型进行拟合时，应始终计算并检查决定系数。若修正Gompertz模型的拟合度较低，可考虑改用其他生长模型，例如修正Logistic模型12。
在处理细胞时，当移除培养基或病毒接种物后，必须立即向细胞培养板的每个孔中加入用于洗涤的 PBS 或用于蚀斑试验的琼脂糖凝胶，以防止细胞干燥。同时，加入 PBS 或琼脂糖时应轻柔操作，避免细胞从孔壁上脱落。此步骤在两种实验中均至关重要（步骤 3.9 和 3.11）。若蚀斑试验样本较多，建议将琼脂糖凝胶（建议每瓶不超过 100 mL）分装至多个培养基瓶中，并在使用前保持温热状态，因为琼脂糖凝胶在室温下约 10 分钟内即会凝固。由于胰蛋白酶对高温敏感17，用于蚀斑试验的培养基和琼脂糖应在充分冷却后，再加入胰蛋白酶溶液。
在细胞结合实验中，病毒与细胞结合的孵育步骤必须在4 °C下进行，以防止病毒侵入细胞。根据Gilling的方法13，细胞在低温下容易干燥，因此在孵育期间每15分钟需轻轻振荡一次。此处使用的RNA提取试剂盒可替换为其他同类试剂盒。RT-qPCR中标准曲线的斜率应约为3.3，决定系数应大于0.98。与使用荧光显微镜观察病毒在细胞内的定位相比，该方法更为快速且操作简便，因为无需将荧光物质标记到病毒上。
近期，人肠道类器官（HIE）已被成功用于轮状病毒的增殖，其细胞组成和功能与人胃肠道上皮相似18。利用HIE可能使我们能够评估不可培养轮状病毒株的特异性生长速率和细胞结合能力。此外，本文所述的两种实验方法也可用于评估药物对两种表型的影响19。本文提供的实验方案使得在不同条件下定量讨论轮状病毒株表型参数值的变化成为可能。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由“"卫生价值链：将卫生系统设计为生态社区价值体系"”项目资助，人类与自然研究所（RIHN，项目编号：14200107）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 7500 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems | qPCR | |
| Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | 蚀斑实验 |
| 磷酸氢二钠 | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | 细胞结合实验 |
Eagle's MEM "Nissui"  | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | 细胞培养 |
Eagle's MEM "Nissui"  | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | 蚀斑实验 |
| EasYFlask 75 cm² | Thermo Scientific | 156499 | 细胞培养 |
| 胎牛血清，经认证，符合美国农业部批准地区标准 | Gibco | 10437028 | 细胞培养和蚀斑实验 |
| 正向/反向引物 | Eurofins Genomics | qPCR | |
| L-谷氨酰胺，200 mM 溶液 | Gibco | 2530081 | 细胞培养和蚀斑实验 |
| 中性红 | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | 蚀斑实验 |
| PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | 细胞培养和蚀斑实验 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | 15140122 | 细胞培养和蚀斑实验 |
| 氯化钾 | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | 细胞结合实验 |
| Premix ExTaq（完美实时） | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
| PrimeScriptTN 反转录试剂盒（完美实时） | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA 合成 |
| PrimeTime qPCR 探针 | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
| QIAamp 病毒 RNA 小量提取试剂盒 | QIAGEN | 52904 | RNA 提取 |
| 碳酸氢钠 | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | 细胞培养和蚀斑实验 |
| 氯化钠 | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | 细胞结合实验 |
| 组织培养板 24 孔板 | TPP | 92024 | 细胞结合实验 |
| 组织培养板 6 孔板 | TPP | 92006 | 蚀斑实验 |
| Trizma 基础缓冲液 | SIGMA-ALDRICH | T1503 | 细胞结合实验 |
| 猪胰蛋白酶 | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | 轮状病毒活化 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | Gibco | 25300054 | 细胞培养 |
| 96 孔垂直式热循环仪 | Applied Biosystems | cDNA 合成 |
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