头脊髓和薄片体外制备心律失常活性

脑干呼吸神经网络为了解节律神经网络的一般特征提供了一个肥沃的领域。特别是, 兴趣是新生儿啮齿类动物呼吸的发展和了解呼吸节律是如何发展的。这可以使用多级方法, 包括体内整体动物胸腔造影, 体外的群内神经记录, 以及包含呼吸节律发生器的体外切片记录。体外还原法和切片记录是在询问发育中啮齿类动物脑脊髓区呼吸节律发生和神经回路背后的机制时使用的一种有利方法。发育中的呼吸系统包括大约40种细胞类型, 其特点是射击模式, 包括中央呼吸^1,2的细胞类型。中央呼吸网络包括一组有节奏的活跃神经元^,位于南边外侧髓质 1^,3。哺乳动物呼吸节律发生是由一个被称为前 Bötzinger 复合体 (pBC) 的自心律失常网络产生的, 该网络通过新生儿哺乳动物的切片和整体制剂进行了局部实验脑干脊髓 3^{,4,5, 6,7,8}。这个区域的功能类似于心脏的窦房结 (SA), 并产生一个吸气计时系统来驱动呼吸。从 pBC, 吸气节律被带到脑干的其他区域 (包括舌下运动核) 和脊髓运动池 (如驱动隔膜的肾上腺运动神经元)^9.

节律活动可通过脑髓整体制备或切片从各种细胞群, 包括 C3-c5 神经根, 十二神经根, 下运动核 (XII mn), 下腔运动神经元 (XII pMN), 以及pbc^3,10,11,12。虽然这些数据收集方法在少数实验室都是成功的, 但许多协议的提出方式并不能完全再现进入该领域的新研究人员。要获得可行的和有节奏的活跃的整体和切片准备工作, 需要通过解剖和切片方案的所有步骤, 非常注意细节。以前的协议广泛地描述了各种记录程序和电生理学, 但缺乏细节, 在获得一个可行的组织准备最关键的部分: 执行脑干脊髓解剖和切片程序。

有效地获得节奏活跃和可行的整体或切片准备脑干脊髓电生理记录要求正确、仔细和快速地执行所有步骤 (通常情况下, 这里相关的整个过程可以是在大约30分钟内完成)。脑干-脊髓电生理协议的临界点, 以前没有很好地描述包括神经根子的解剖和在振动体上的切片过程。该方案是第一个逐步视觉沟通脑脊髓解剖为新的研究人员和专家在该领域。该协议还详细解释了手术技术、地标和其他程序, 以帮助未来的研究人员标准化切片和整体准备, 以包含每个实验所需的确切电路。这里介绍的程序可以在老鼠和老鼠新生幼崽。

以下协议已被洛玛·琳达大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 接受并批准。在实验室进行的所有动物实验都遵循国家卫生研究院关于动物伦理治疗的准则。执行本协议的个人维护了所有道德标准。

1. 解决方案

1. 准备人工脑脊液 (aCSF)。
   1. 在1升的实验前的晚上, 使用以下配方准备新鲜的 aCSF: 7.250 g Nocl (124 mM), 0.224 g KCl (3 mM), 2.100 g NaHCO₃ (25 mm), 0.069 g nah2 po4·h2 o(0.5 Mm), 0.224 g mgso 4·7h₂ O (1.0 mM) 和5.410 克 d-葡萄糖 (30 mM), 0.221 g Ccl 2·2h2o₍1.5 mm).始终在最后添加 Ccl 2·2h2o_.
   2. 将组分溶解成1升的去离子水。搅拌20-30分钟。
   3. 测量 aCSF 的 pH 值, 并使用稀释 NaOH、KOH 或 HCl 的小体积 (通常和 lt;0.5 毫升) 调整到7.40±0.02。
      请注意:准备好的 aCSF 可存储在冰箱 (4°c, pH 7.40±0.02), 直到三天前细菌生长影响组织的生存能力在实验中。使用0.2μm 过滤器, 以减少实验室中存在的真菌或细菌的污染, 因为实验可以持续长达36小时。为了提高效率, 所描述的 aCSF 配方可以按照相同的协议扩大到4升批次, 这个卷最多可以持续三天的实验。

2. 解剖和振动钻机的制备

1. 设置刀片。
   1. 使用新鲜的双刃剃须刀片切割振动体上的组织。用100% 乙醇清洗刀片, 用去离子水冲洗, 然后将刀片切成两半, 然后将刀片插入振动器上的安装夹具中。
   2. 每次在振动体上安装新的组织制剂进行切片或在切片时切入石蜡板时, 请更换刀片。任何石蜡残留将使它几乎不可能通过新生儿神经组织清洁切割。
2. 设置石蜡板。
   1. 使用任何嵌入式石蜡。将10克介质嵌入耐热玻璃烧杯中, 并使用低热量将石蜡珠融化为液体。
   2. 加入约0.5 克石墨粉, 将溶液彻底均匀地混合到液体石蜡中。
   3. 使用一个小塑料板作为石蜡的基板。切割一块小的 (0.5-1 厘米厚, 大约 2 x 2厘米2宽) 的塑料片 (也可以使用聚碳酸酯或铝)。使用机械师的文件将凹槽划入塑料, 这将确保石蜡粘附在塑料上。
      请注意:或者, 使用加热的18G 皮下注射针, 在片板上放置有角度的孔, 以确保石蜡石墨混合物粘附在塑料上。
   4. 使用棉尖施药器的背面, 将石蜡石墨混合物反复浸入熔融的石蜡-石墨混合物中, 将浆料滴入塑料块, 并将石蜡石墨固定在塑料上, 从而将石蜡石墨混合物滴入塑料上。在塑料的顶部的厚度约为1.5 厘米。
   5. 一旦在块上沉积了足够厚的石蜡-石墨混合物层, 将块放在一边冷却, 然后形成以适应脑脊髓。

3. 神经的解剖和隔离

1. 进行初始解剖和麻醉。
   注:本研究中使用的动物的大小可能从胚胎第18天 (e18) 到产后10-20 天的小鼠, 或从 E18 到产后的第5天的大鼠。根据实验设计, 可以使用任何菌株、治疗或性别的老鼠或小鼠。在烟罩下进行麻醉和初步解剖, 因为使用异氟醚 (在25毫升的房间中0.25 毫升)。
   1. 称重幼犬, 然后将其放置在麻醉室中, 其中含有0.25 毫升的异氟醚, 放置在 2 x 2 英寸²块纱布上。动物到达麻醉的手术平面后 (经脚趾捏, 没有退气反射验证), 将动物固定在充满石蜡或有机硅弹性体的培养皿上。
      请注意:新生啮齿类动物也可通过冷冻麻醉^13,14, 异氟烷汽化15或注射¹⁶与氧气平衡麻醉^.
   2. 将动物腹侧向下放置, 并使用10或11刀刀片或手术剪刀从眼睛后面的左上腰中部进行中行切口。反射皮肤, 在枕部缝合层对动物进行脱面 (见图 1), 并去除横过隔膜下的动物的皮肤。然后用剪刀或手术刀在肩关节上切割, 以消除手臂。
   3. 一旦皮肤被移除, 转移到输液室与有机硅弹性体在底部进一步解剖和准备脑脊髓。
   4. 用冷冻 (4°c, ph 7.40±0.02) aCSF 和含氧物, 混合 95% o2 和 5% co 2 (也称为 "碳原"), 连续泡泡 aCSF 储罐 ( 500 毫升侧口瓶).在解剖过程中, 使用冷冻的 Csf 定期冲洗腔内, 在整个脑干脊髓的分离过程中提供新鲜的含氧 aCSF。
      请注意:在剩余的动脉和静脉中可以看到红血球, 当有足够的氧气时, 这些都是鲜红的。
   5. 使用重力流灌注通过油管和塞子, 间歇性地或连续地灌注组织与氧化 aCSF (丸体积或通过缓慢滴水使用塞盘, 约 0.5-1.0 mL/min)。这对组织的氧化, 并保持一个清晰的手术领域。
   6. 根据真空吸气过滤系统的需要, 去除多余的液体。
   7. 使用解剖显微镜进行解剖。首选连续缩放模型, 以允许对放大倍率进行微调, 并在解剖的每一步中对感兴趣的区域进行最佳可视化。
      请注意:建议的显微手术工具包括一系列齿形组织钳、钝器钳、#5 钳、角度组织钳、一系列微解剖剪刀 (弹簧剪刀) 以及普通的昆虫和微解剖销。
   8. 通过头骨的中线沿着矢状缝合线暴露大脑, 然后用 27 g 将反射的皮瓣用微解剖的别针固定在一起, 并将脊柱固定在解剖室的远端针。
      请注意:解剖的其余部分需要解剖显微镜, 以提供最清晰的组织和地标的看法, 用于确保获得有节奏的输出在脑干和脊椎根牙的最大可能性。使用中弹簧剪刀或虹膜剪刀和精细钳执行这些步骤。
2. 迅速将动物的孤立的树干转移到加气的解剖室。将组织背侧向上放置, 将左端 (大脑) 面向腔的前部。将组织固定在肩部和脊髓的大部分尾端。
   1. 在顶叶缝合后, 在颅骨上做一个中间矢状切口, 以避免损坏颅骨下面的皮层和脑干。
      请注意:新生儿骨组织没有完全钙化, 非常脆弱。骨/组织将在一定程度上是灵活的, 但比周围的结缔组织和肌肉组织更硬。
   2. 使用中等弹簧或虹膜剪刀剪断头骨的枕骨缝合线, 从矢状缝合线开始, 侧向工作。这将创建头骨的 "皮瓣", 可以反射和固定锚定头骨的左部分, 并提供一些稳定性的组织 (见图 2a)。
   3. 反射颅骨皮瓣后, 切断大脑皮层的其余部分, 使小脑 (vermis) 的尾端部分相对完整 (图 2b)。
3. 进行背侧椎板切除术。
   1. 使用微型弹簧剪刀和钳子去除头骨和脊柱周围的肌肉组织。取下肋骨的背侧的组织, 保持肋骨保持完整, 因为这将被固定在以后锚定组织在腹侧椎板切除术期间, 最大限度地减少损害脊髓的机会。
   2. 使用中弹簧剪刀或细虹膜剪刀小心地剪断椎板的外侧过程。切掉任何覆盖在神经元和髓质上的组织。脊髓的垂直、小脑、小管和开始现在都可以清楚地看到 (图 2c)。
4. 进行腹侧椎板切除术。
   1. 将组织背侧向下旋转, 并将其固定在肋骨和脊柱的大部分尾骨端。用头骨皮瓣将组织的左侧向下, (图 3a)。
   2. 用同样的剪刀和钳子取出肋骨的腹侧半, 包括胸骨和所有腹部器官。解剖出连接在肋骨上的软组织, 露出肋骨和脊髓 (图 3b)。
   3. 取下位于颅底和脊柱上的舌头、食道、气管、喉部以及所有其他软组织和肌肉组织 (如图 3c所示)。
   4. 解剖硬托盘上的组织。通过在颅底定位一个带有 v 形压痕的矩形骨板来识别硬唇 (图 3c)。沿着味觉的中线切割, 小心地向上抬起, 并执行横向切割以将其取出 (图 4a)。
   5. 开始腹侧椎板切除术, 从第一颈椎切除暴露脑干和脊髓腹侧表面的椎板, 大致进入胸椎 7 (T7), 如图 4b 所示。
   6. 在这个阶段, 腹侧根子将是可见的。使用小的微解剖或弹簧剪刀, 注意使削减尽可能接近层状和远离根部的起源在脊髓;避免拉长根部。
   7. 在层状处脊柱两侧的永久性的咬量5-10 毫米。不要割得离脊髓太近或插入椎骨。这一步允许颈椎的切除, 以暴露脊髓。避免切割根茎。
   8. 沿着脊柱约20-25 毫米 (双侧) 的剪液根 (约 T7)。在整个过程中, 避免切割到脊髓和操纵椎骨的边缘, 如图 4c所示。
   9. 通过小心地抬起每个椎骨的左边缘并在骨骼下方进行仔细的截断, 取出 c1、C2 和 C3。切割的骨头越近, 根茎的时间就越长。使用钩或弯曲的钳子, 以帮助实现一个牢固的抓地力, 每个颈椎, 同时使削减 (图 4c)。
   10. 一旦所需的脊髓长度被分离并从脊柱中解剖, 则进行横向切割以切除脊髓 (图 5 a 和图 5b)。
5. 删除硬脑膜。
   注:如前面所述的 3^,7, 孤立的脑脊髓可用于整体体外记录。随着脑髓从脊柱中取出, 硬脑膜必须被移除, 以提供最佳的访问吸力电极, 以执行从切割的颅骨和脊柱根茎的记录。此外, 去除硬脑膜可以将脑干切干净, 并获得有节奏的活性薄片进行体外记录。
   1. 小心地将分离的脑脊髓组织背侧固定, 以便进入颅内根子囊周围的硬脑膜 (图 5b)。引脚应通过脑干的侧缘涂抹, 并与十二根根运动结合。
   2. 在硬脑膜的背缘用细钳 (#5) 将硬脑膜从脑干的背侧取出硬脑膜, 并用细弹簧剪刀从脑干的侧到内侧切割。要小心, 避免切入脑干本身。轻轻地从脑干表面抬起血管, 并在切割脑干时切割, 以避免振动叶片的障碍。
   3. 从脑干的内侧和侧侧进行仔细解剖, 因为颅神经根穿过硬脑膜, 当硬脑膜被解除时很容易被撕开。用小弹簧剪刀轻轻剪断根茎的可能性最小。
   4. 翻转脑脊髓, 使腹侧表面朝上, 颅骨根带清晰可见。从脑干的背侧解剖硬脑膜, 轻轻地将硬脑膜直接举过该区域的后座, 从左旋切割成尾端。由于大量的微毛细血管使这一区域得到了充分利用, 该区域的后部将出现轻微的粉红色。
   5. 使用一个精细的昆虫别针, 以挑逗任何剩余的硬脑膜, 并删除剩余的血管靠近颅骨和颈根。

4. 切片协议

1. 取出硬脑膜后, 将脑干放置在石蜡平台的中心塑料块 (以下简称 "切割块") 上。用精细昆虫别针将脑干的尾端固定在脊髓远端, 这些引脚的长度已被修剪到不超过1厘米, 如图 5c 所示。
2. 将石蜡覆盖的切割块与振动块支架中固定的脑干对齐, 使刀片切割垂直于脑干的左脸。
3. 做一个初始切片, 以消除不均匀的, 在最屋顶上的无关组织。这种初始切割通常可以是 200-300μm, 但要小心避免去除 IX、X 和十二颅根。这一步通常会揭示面部核 (VII) 和舌红根的尾端范围, 并使其能够对齐脑干, 使其面部与振动体叶片呈副平面。根据需要进行小的调整, 以确保部分平面, 并进行小切口, 以去除不均匀的组织。
   请注意:当一个人切割每个连续的切片时, 在脑干的侧边可以看到舌咽 (IX) 根, 这些根对于根干与有节奏产生所需的脑干神经电路的距离提供了一个里程碑。在脑干的腹侧, 舌下低垂的根线 (十二) 也应该是可见的轻微尾状的切割面显示第九根。最后一个地标将是脑干背侧的腹肌 (大脑中第四脑室变窄成为脊髓中央管的点)。在这三个参考点可见的情况下, 建立了正确的切割平面 (参见图 6a), 并可靠地获得了有节奏的活性切片。
4. 继续切割根到尾端, 直到九根靠近脑干切割面的表面。
5. 有关地标和正确方向, 请参见图 6 。调整振动组夹具中的石蜡板, 使横截面的下一个角度将创建一个非常轻微的 "楔形" 到切割片和切割切片约100-200 微米, 直到可以清楚地看到所描述的地标 (图 6a)。
   请注意:切割这个轻微的楔形增加了在切片中捕获的十二个运动神经元的数量, 并最大限度地增加了在录制过程中获得有节奏活动的可能性。使用所描述的地标 (舌咽神经束的根, 舌下神经束的根, obex) 将确保切片可重现地至少包含 pBC 的很大一部分 (图 6b)。
6. 从这些神经解剖标记中切出300-500μm 的脑干, 以捕获 pBC 和相关的传输电路。
   请注意:一个 "理想" 切片将包含最原始的根舌下的低脂质根束, 以可靠地获得吸气活性, 而无需诉诸表面记录使用吸力电极在节奏-一般传播位点内脑干。

5. 记录程序

1. 将切片放置在记录室内, 连续与 Csf (0.5-1.0 mL/min) 完美结合, 并使用吸力或细胞外电极记录来自十二根或 pBC、XII Pmn 或十二运动神经元的种群活动。有关详细的记录程序, 请参阅以前关于脑脊髓电生理学和贴片夹紧^10,11的出版物。

这里介绍的方法允许研究人员有兴趣获得有节奏的活跃的脑干切片可重现和可靠地削减一个可行的, 可靠的切片, 将允许记录虚构的电机输出数小时。使用这种方法, 可以在薄片中捕获产生和传输吸气节律所需的最低限度的神经电路元件。这些元素包括: 前 Bötzinger 复合体, 投射到舌下运动神经元 (pXII MNs) 和舌下运动神经元 (XII Mn), 和舌下神经根子。pBC、Xin 和 C4 神经根常用于吸气节奏记录, 如图 7所示。

成功使用此过程将产生一个可行的和有节奏的活跃的集团准备在 10-15分钟, 或有节奏的活性切片 & & lt;30 分钟。在单独的脑髓脊髓或薄片分离后, 在记录室中进行15分钟的平衡就足以产生虚构的电机输出。在切片的情况下, 将细胞外 [K +] 增加到大约 8-9 mM 将产生可靠的神经驱动, 在这个实验室的经验中可以持续24至36小时。该制剂应连续熔融加碳 (95% O 2/5% co2)和加热 acsf (~ 27°c)。成功的解剖进行迅速, 避免捏, 拉伸, 或损坏神经根用于录音。为了获得最佳效果, 手术中的所有步骤都能快速执行, 在进行解剖和组织隔离时, 必须用加碳性 aCSF 对组织进行沐浴或连续灌注 (如上文所述)。有关脑干神经解剖和精确图集的详细信息, 请参见 ruangkittisakul 等人的工作 13、14、ballanyi15和同事。这里介绍的协议是在高级作者的实验室中被证明是可靠的一种方法, 本报告提供了一种图形化的分步方法, 仅依靠脑干或脑干内可见的表面地标生成这些切片。脑干在这里详细。

图 1: 脑干-脊髓拔除的初始解剖.(a) 固定的致动小狗进行解剖。虚线表示在皮肤和横切到眼睛和横隔膜以下的矢状切口的切口指南。(b) 动物皮肤和前肢去除指南。(c) 剥皮啮齿动物的背侧。虚线表示用于皮瓣 "翻盖" 暴露的切口指南。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 背侧椎板切除术的阶段.(a) 虚线表示切除大脑的切口指南。(b) 去除组织后的结果。虚线表示背板切除术的切口指南。(c) 背椎板切除术后暴露的脑脊髓。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 初始腹侧解剖阶段.(a) 前脑和腹部被割断的剥皮啮齿动物的腹侧。虚线表示切口指南, 用于去除异音过程, 打开肋骨笼子, 随后切除腹部和胸腔器官。(b) 切除腹部和胸腔器官。(c) 切除咽部结构。虚线表示硬味觉切除的切口指南。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 腹侧椎板切除术的阶段.(a) 切除硬味觉和剩余的颅骨部位。切口指南说明如何去除脑脊髓周围的剩余组织。(b) 第一颈椎 (c1) 暴露。(c) 关于提升 c1 并对椎体进行横向切割以将其取出的演示。在取出椎体之前, 将神经小心地切开, 冲洗到椎体的背侧。这是解剖中最关键的一步。请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: 脑脊髓切片的制备.(a) 从脊髓中取出 c1-c3。切口指南指出了从尾端脊髓切断脑脊髓的位置。(b) 脑脊髓腹侧有标记的神经根。切口指南表明建议在从脑脊髓区域记录前在子宫内的横断或剩余的左肌结构。(c) 用于在振动体上切片的石蜡板设置。切片区包括颅神经九和十二之间的组织。不要将微型引脚放置在切片区域。请点击这里查看此图的较大版本.

图 6: 用于获得具有完整的舌下运动核和预 Bötzinger 复合体的切片的标记.(a) 在最初切割后, 脑脊髓的横向视图已被固定到舌下咽 (ix) 根。切口指南表明横截面水平只是尾状到舌下位 (十二) 根。(b) 在切割含有 pbc 和舌下运动核的切片之前, 石蜡块指向刀片。创建梯形 "楔形" 形状切割最大限度地增加了捕获切片中足够的吸气神经元以在录制过程中获得节律活动的可能性。楔形将包括 pBC、低群运动神经元和舌下运动神经元, 它们共同提供必要的电路来传递有节奏的驱动, 这是呼吸节律的一个指标。请点击这里查看此图的较大版本.

图 7: 代表录音从集团或切片准备.(a) 十二根的综合痕迹。(b) 来自 pbc 的集成跟踪。使用整体准备从 p c 进行记录, 需要一个盲目的补丁夹。(c) c4 神经根的综合痕迹。请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。