节律性活动新生啮齿类动物脑干-脊髓及薄片体外制备方法

摘要

本方案以可视化方式展示了脑干-脊髓制备过程，并全面、逐步地阐明了脑干横切片的制备方法。该方案旨在提高实验可重复性，并增加成功获得存活时间长、具有节律性活性、可用于记录脑干呼吸区神经输出信号的脑片的可能性。

摘要

哺乳动物的吸气节律由延髓一个称为前包钦格复合体（preBötzinger complex, pBC）区域内的神经元网络产生，该网络发出信号驱动吸气肌的节律性收缩。可通过多种方法研究pBC产生的节律性神经活动及其向其他神经元群传递以支配呼吸肌的过程，包括整体神经记录和横切脑片记录。然而，以往发表的方法并未以透明且可重复的方式充分描述脑干-脊髓的解剖过程，不利于后续研究的开展。本文详细介绍了一种可重复制备具有节律性活性的脑干脑片的方法，该脑片包含生成和传递吸气驱动所必需且充分的神经环路。本研究在既往脑干-脊髓电生理实验方案的基础上进行了优化，提高了稳定获得可用于记录的、具有节律性活性的活体脑片的可能性，以便记录来自前包钦格复合体（pBC）、舌下神经前运动神经元（XII pMN）以及舌下神经运动神经元（XII MN）的神经输出信号。本工作在以往已发表方法的基础上进一步拓展，提供了从新生大鼠整体脑干-脊髓标本到包含舌下神经根丝的离体脑片的详细分步解剖图解。

引言

脑干呼吸神经网络为理解节律性神经网络的一般特性提供了丰富的研究领域。特别是，研究关注新生啮齿类动物呼吸的发育过程，以及呼吸节律是如何形成的。可通过多层次方法开展此类研究，包括在体全动物体积描记法、离体脑干脊髓标本神经记录，以及包含呼吸节律发生器的离体脑片记录。在探究发育中啮齿类动物脑干-脊髓区域呼吸节律发生机制及神经环路时，还原论的离体脑干标本和脑片记录是一种优势方法。发育中的呼吸系统包含约40种细胞类型，这些细胞类型可根据放电模式进行表征，包括中枢呼吸相关细胞^1,2. 中央呼吸网络包含一组位于延髓腹外侧头端的节律性活跃神经元^1,3哺乳动物的呼吸节律由一个被称为延髓前布策格复合体（preBötzinger complex, pBC）的自主节律性中间神经元网络产生，该区域已通过实验手段实现定位。 通过 新生哺乳动物脑干-脊髓的切片与整块标本制备^3,4,5,6,7,8该区域在功能上类似于心脏的窦房结（SA），可产生驱动呼吸的吸气节律系统。从脑桥呼吸群（pBC）发出的吸气节律传递至脑干其他区域（包括舌下运动核）以及脊髓的运动神经元池（例如支配膈肌的膈运动神经元）。⁹.

可利用脑干-脊髓整体标本或脑片从多种细胞群中获得节律性活动，这些细胞群包括C3-C5神经根丝、舌下神经（XII）根丝、舌下运动核（XII MN）、舌下神经前运动神经元（XII pMN）以及先布雷钦格复合体（pBC^3,10,11,12。尽管这些数据采集方法已在少数实验室中取得成功，但许多实验方案并未以充分可重复的方式呈现，不利于新进入该领域的研究人员复现。获得具有活性且呈现节律性活动的整体标本或脑片制备物，要求在解剖和切片全过程的每一步骤中都极为注重细节。以往的实验方案虽已详尽描述了各种记录方法和电生理技术，但在获取可存活组织制备物最关键的环节——脑干-脊髓解剖与切片操作步骤方面，却缺乏足够的细节说明。

高效获得具有节律性活动且存活的脑干-脊髓整体或脑片标本，用于电生理记录，要求所有步骤均正确、仔细且迅速地完成（通常，此处所述的整个操作过程可在约30分钟内完成）。脑干-脊髓电生理实验方案中一些此前未被充分描述的关键步骤，包括神经根丝的解剖以及在振动切片机上的切片过程。本方案首次以逐步可视化的方式，向该领域的新手研究人员和专家清晰呈现了脑干-脊髓的解剖过程。本方案还全面讲解了手术技术、解剖标志及其他相关操作，以帮助未来的研究人员标准化脑片和整体标本的制备，确保每次实验所获得的标本均包含所需的确切神经环路。本文所述的操作方法适用于新生大鼠和小鼠幼崽。

方案

以下方案已获得洛马林达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的接受和批准。实验室开展的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于动物伦理待遇的指南。执行本方案的人员均严格遵守各项伦理标准。

1. 溶液

1. 配制人工脑脊液（aCSF）。
   1. 在实验前一晚，按以下配方配制1 L批次的新鲜aCSF：7.250 g NaCl（124 mM）、0.224 g KCl（3 mM）、2.100 g NaHCO₃（25 mM）、0.069 g NaH₂PO₄ • H₂O（0.5 mM）、0.247 g MgSO₄ • 7H₂O（1.0 mM）、5.410 g D-葡萄糖（30 mM）和0.221 g CaCl₂ • 2H₂O（1.5 mM）。CaCl₂ • 2H₂O必须最后加入。
   2. 将各组分溶于1 L去离子水中，搅拌20–30分钟。
   3. 测量aCSF的pH值，并用少量稀释的NaOH、KOH或HCl（通常<0.5 mL）调节至7.40 ± 0.02。
      注意：配制好的aCSF可在冰箱中（4 °C，pH 7.40 ± 0.02）保存最多三天，超过此时间后细菌生长可能影响实验过程中组织的活性。使用0.2 µm滤器以减少实验室中真菌或细菌的污染，因为实验可持续长达36小时。为提高效率，上述aCSF配方可按相同比例放大至4 L批次，该体积可满足最多三天的实验需求。

2. 解剖和振动切片机装置的准备

1. 安装刀片。
   1. 使用新的双刃剃须刀片在振动切片机上切割组织。在切割组织或折断刀片前，先用100%乙醇清洗刀片，并用去离子水冲洗，然后将刀片插入振动切片机的固定夹中。
   2. 每次在振动切片机上安装新的组织样本进行切片时，或刀片在切片过程中接触到石蜡块时，均应更换刀片。任何残留的石蜡都会导致几乎无法干净地切开新生神经组织。
2. 制备石蜡块。
   1. 使用任意一种包埋用石蜡。取10 g包埋介质放入耐热玻璃烧杯中，用低温加热使石蜡颗粒完全熔化成液体。
   2. 加入约0.5 g石墨粉，并将溶液在液态石蜡中充分且均匀地混合。
   3. 使用小块塑料板作为石蜡的基底。裁剪一小块塑料（厚度0.5–1 cm，面积约为2 × 2 cm²）（也可使用聚碳酸酯或铝片）。用机械师锉刀在塑料表面划出凹槽，以确保石蜡能够牢固附着于塑料表面。
      注意：也可使用加热的18号皮下注射针头在塑料片上打斜孔，以确保石蜡-石墨混合物牢固附着于塑料基底。
   4. 使用棉签的尾端反复浸入熔融的石蜡-石墨混合液中，然后将混合物滴涂到塑料基底上，逐层堆积，使石蜡-石墨层在塑料基底上达到约1.5 cm的厚度。
   5. 当石蜡-石墨混合物在基底上沉积至足够厚度后，将其放置一旁冷却，随后修整形状以适配脑干-脊髓组织。

3. 神经轴的解剖与分离

1. 进行初步解剖和麻醉。
   注意： 本研究中使用的动物包括小鼠和大鼠，其大小范围从小鼠胚胎第18天（E18）至出生后第10至20天，或大鼠从胚胎第18天（E18）至出生后第5至6天。根据实验设计，可使用任何品系、处理方式或性别的大鼠或小鼠。由于使用异氟烷（在25 mL麻醉 chamber 中加入0.25 mL），麻醉及初步解剖操作应在通风橱中进行。
   1. 称重幼鼠，然后将其放入麻醉室中，麻醉室内放置有0.25 mL异氟烷，置于一块2英寸×2英寸的纱布上² 一块纱布。当动物达到手术麻醉深度（通过夹趾无回缩反射来确认）后，将其固定在装有石蜡或硅橡胶的培养皿中。
      注意： 新生啮齿类动物也可通过冷冻麻醉进行麻醉^13,14异氟烷汽化¹⁵或注射¹⁶ 用氧气平衡。
   2. 将动物腹侧朝下放置，使用10号或11号手术刀片或手术剪，从眼后方沿中线切至脊柱中腰段。分离皮肤，于顶骨-枕骨缝水平处去脑（见 图1）并沿膈肌下方横切动物体表以去除皮肤。然后用剪刀或解剖刀在肩关节处切断以去除前肢。
   3. 皮肤去除后，将动物转移至底部带有硅胶弹性体的灌流 chamber，用于进一步解剖并制备延髓-脊髓。
   4. 用冷却的（4 °C，pH 7.40 ± 0.02）aCSF 持续鼓泡充氧人工脑脊液（aCSF）储液瓶（500 mL 侧口瓶），并以 95% O₂₂ 和5% CO₂ （也称为 "碳合气"在解剖过程中，使用预冷的aCSF定期冲洗灌注腔，以在整个脑干-脊髓分离过程中提供新鲜且含氧的aCSF。
      注意： 在残留的动脉和静脉中可见红细胞，当其充分氧合时，呈鲜红色。
   5. 使用重力流灌注 通过 管路和止流夹，用于间歇或持续地向组织灌注含氧人工脑脊液（aCSF）（团注体积或 通过 使用止流夹缓慢滴注，速度约为0.5–1.0 mL/min。此操作可为组织供氧并维持清晰的手术视野。
   6. 根据需要使用真空抽滤系统去除多余液体。
   7. 使用解剖显微镜进行解剖操作。建议采用连续变倍型号，以便精细调节放大倍数，并在解剖的每一步骤中实现对目标区域的最佳观察。
      注意： 推荐的显微外科手术工具包括各种有齿组织镊、钝头镊、#5 镊、角度组织镊、多种显微解剖剪（弹簧剪）以及常规昆虫针和显微解剖针。
   8. 暴露大脑 通过 沿矢状缝对颅骨进行中线切开，然后用显微解剖针固定翻折的骨瓣，并使用27 G针头将脊柱尾端固定于解剖腔硅胶包被的底部。
      注意： 解剖的其余步骤需要使用解剖显微镜，以清晰观察组织及解剖标志，从而最大程度确保在脑干颅神经根丝和脊神经根丝上获得节律性拟真输出。使用中型弹簧剪或虹膜剪以及精细镊子进行这些解剖步骤。
2. 迅速将分离出的动物躯干转移至充氧的解剖室中，将组织背侧朝上放置，头端（脑部）朝向解剖室前方。用固定针在肩部及脊髓最尾端处固定组织。
   1. 沿顶骨缝做正中矢状切口穿过颅骨，以避免损伤颅骨下方的皮层和脑干。
      注意： 新生儿的骨组织尚未完全钙化，非常脆。骨/组织在一定程度上具有柔韧性，但比周围的结缔组织和肌肉组织更坚韧。
   2. 使用中型弹簧剪或虹膜剪从矢状缝开始，向两侧剪开颅骨的枕部缝，从而形成 "皮瓣" 颅骨部分可翻折并用针固定，以锚定颅骨的吻侧部分并为组织提供一定稳定性（参见 图2A).
   3. 翻转颅骨瓣后，切除其余的大脑皮层，保留小脑后部（蚓部）相对完整（图2B).
3. 进行背侧椎板切除术。
   1. 使用显微弹簧剪和镊子去除颅骨和脊柱周围的肌肉组织。沿肋骨背面去除组织，保留完整的肋骨，以便后续在腹侧椎板切除术中将组织固定，从而最大限度地减少对脊髓的损伤风险。
   2. 使用中型弹簧剪或精细虹膜剪小心剪除椎板的侧突。剪去覆盖在脑桥和延髓上方的所有组织。此时小脑蚓部、小脑、脑桥以及脊髓起始部将清晰可见。图2C).
4. 进行腹侧椎板切除术。
   1. 将组织背侧朝下，用大头针固定在肋骨和脊柱最尾端。使用颅骨瓣将组织的头侧向下固定图3A).
   2. 使用同一把剪刀和镊子去除肋骨的腹侧部分，包括胸骨和所有腹腔器官。分离附着在肋骨上的软组织，暴露肋骨和脊髓。图3B).
   3. 去除舌、食管、气管、喉以及覆盖在颅底和脊柱上方的所有其他软组织和肌肉（如图所示）。 图3C).
   4. 解剖覆盖在硬腭上的组织。通过在颅底找到一块具有V形凹陷的矩形骨板来确定硬腭的位置（图3C）。沿腭部正中线剪开，小心向上抬起，并作横向切割以移除腭部（图4A).
   5. 从第一颈椎开始至大约第七胸椎（T7）水平，通过切除椎板进行腹侧椎板切除术，暴露脑干和脊髓的腹侧面，如图所示。 图4B.
   6. 此时可见腹侧根丝。使用小型显微解剖剪或弹簧剪，应尽量靠近椎板并在尽可能远离脊髓根起源处进行剪切；避免牵拉神经根。
   7. 沿椎板两侧的脊柱剪取5-10毫米。切勿过于靠近脊髓或切入椎体。此步骤可去除颈椎椎体以暴露脊髓。避免切断根丝。
   8. 沿脊柱（约T7水平）双侧剪断根丝，长度约为20–25 mm。操作过程中应避免损伤脊髓，并如图所示操作椎骨边缘。 图4C.
   9. 用镊子小心提起每节椎骨的头侧边缘，在紧贴骨下方剪断，以去除 C1、C2 和 C3。剪切位置越靠近骨骼，根丝越长。剪切时可使用带钩或弯曲的镊子，以牢固夹持每节颈椎椎骨图4C).
   10. 在分离并解剖出所需长度的脊髓后，进行横向切割以移除脊髓图5A 和 图5B).
5. 去除硬脑膜。
   注意： 分离的脑干-脊髓可用于整体离体记录，方法如前所述。^3,7脑干-脊髓从椎体中取出后，必须去除硬脑膜，以便吸吮电极能够充分接触并记录切断的颅神经根和脊神经根。此外，去除硬脑膜还可实现对脑干进行清晰切片，从而获得具有节律性活动的薄片组织，用于体外记录。
   1. 小心地将分离出的脑干-脊髓组织背侧朝上固定，以便接触颅神经根周围的硬脑膜。图5B。应将针穿过脑干侧缘，位于第Ⅻ对根丝的头侧。
   2. 用精细镊子（#5）夹住脑干背侧表面硬脑膜的背侧边缘，将硬脑膜提起，再用精细弹簧剪沿脑干长度方向从外侧向内侧剪开，以去除脑干背侧的硬脑膜。注意避免剪入脑干组织本身。轻轻提起脑干表面的血管并剪断，以防止在使用振动切片机切片时阻碍刀片。
   3. 小心地从脑干的内侧和外侧分离硬脑膜，因为颅神经根丝会穿过硬脑膜，当抬起硬脑膜时容易被撕脱。使用小型弹簧剪刀在根丝周围轻轻剪开，以尽量减少根丝被拉脱的风险。
   4. 将脑干-脊髓翻转，使腹面朝上，颅根根丝清晰可见。从脑干背侧轻轻提起迷走神经三角区上方的硬脑膜，由头端向尾端剪开，从而分离硬脑膜。由于该区域富含大量微毛细血管，迷走神经三角区呈现轻微粉红色。
   5. 使用细小的昆虫针轻轻剥离残留的硬脑膜，并清除靠近颅神经和颈神经根丝的残余血管。

4. 切片方案

1. 去除硬脑膜后，将脑干置于塑料包埋框上石蜡平台的中央（下文简称 "切割块"）。使用已修剪至长度不超过1 cm的精细昆虫针，如图所示，从延髓尾端穿过远端脊髓进行固定 图5C.
2. 将包埋石蜡的切块与振动切片机刀架中固定好的脑干对齐，使刀片垂直于脑干头端面进行切割。
3. 在脑干最前端（rostral-most端）进行初次切割，以去除不平整的多余组织。该初始切面通常为200–300 µm，但需小心避免切除第IX、X和XII对脑神经根丝。此步骤通常可暴露面神经核（VII）的尾侧边界以及舌咽神经（glossopharyngeal）根丝，从而便于调整脑干方向，使其切面与振动切片机（vibratome）刀片保持平行。根据需要进行微调以确保切面平行，并进行少量修切以去除不平整的组织。
   注意： 舌咽神经（IX）根丝将在每次连续切片时于脑干外侧缘可见，这些根丝可作为确定脑干节律产生神经回路所需头尾方向距离的解剖标志。在脑干腹侧，舌下神经根丝（XII）应位于显示IX神经根丝的切面稍偏尾侧的位置。第三个标志是位于脑干背侧的闩部（obex），即人类脑中第四脑室变窄并延续为脊髓中央管的部位。当这三个参考点均可见时，即可确定正确的切片平面（参见 图6A可稳定获得具有节律性活动的脑片。
4. 继续从头侧向尾侧切割，直至第Ⅸ对脑神经根丝接近脑干切面的表面。
5. 参见 图6 用于定位标志和正确方向。调整振动切片机夹具中的石蜡块，使下一切面角度产生极轻微的倾斜。 "楔形" 将切片修整至适当形状，并继续切割厚度约为100–200 µm的切片，直至能够清晰观察到所述解剖标志（图6A).
   注意： 切取这一微小楔形组织可增加脑片中捕获的舌下神经（XII）运动神经元数量，并最大限度地提高记录过程中获得节律性活动的可能性。利用所述解剖标志（舌咽神经束的吻侧根丝、舌下神经束的根丝、闩部）可确保脑片可重复地包含至少大部分前包钦格复合体（pBC）。图6B).
6. 从这些吻侧神经解剖标志处切取一块300–500 µm厚的脑干切片，以获取面侧臂核（pBC）及其相关传导通路。
   注意： 一个 "理想" 切片将包含舌下神经根束最吻侧的根丝，以可靠地获得吸气活动，而无需使用吸电极在脑干的节律产生/传导区域进行表面记录。

5. 记录步骤

1. 将脑片置于记录室中，持续灌注人工脑脊液（aCSF，流速为 0.5 - 1.0 mL/min），并使用吸吮电极或细胞外电极记录舌下神经根丝、前包钦格复合体（pBC）、舌下神经前运动神经元（XII PMNs）或舌下运动神经元的群体电活动。有关详细的记录步骤，请参见既往关于脑干-脊髓电生理学和膜片钳技术的文献^10,11。

结果

本文介绍的方法可帮助希望获得具有节律性活性的脑干切片的研究人员，可重复且可靠地制备出具有活性和稳定性的薄切片，从而实现持续数小时的模拟运动输出记录。使用该方法可在薄切片中完整保留生成和传递吸气节律所必需的最少神经环路元件。这些元件包括：前包钦格复合体（preBötzinger Complex）、投射至舌下神经运动神经元（pXII MNs）的中间运动神经元，以及舌下神经运动神经元（XII MNs）和舌下神经根丝。前包钦格复合体（pBC）、舌下神经（XIIn）和C4神经根丝通常用于吸气节律记录，如图7所示。

成功实施该操作可在10至15分钟内获得一个具有活性且节律性良好的整体脑干-脊髓标本，或在<30分钟内获得一个具有节律性活动的脑片。在分离出整体脑干-脊髓标本或薄片后，于记录室中平衡约15分钟，即可产生节律性的拟运动输出。对于脑片而言，根据本实验室的经验，将细胞外[K⁺]提高至约8–9 m...

讨论

将本文所述方案调整为整体组织块或切片工作流程，对于希望利用整体脑干-脊髓组织块和/或薄切片进行电生理记录的实验室和研究而言具有显著优势。本研究所提出的解剖与切片方法，结合先前其他研究者已报道的方法^17,18,19，可实现稳定、有活性且可重复的组织制备，广泛适用于使用啮齿类动物延髓或脊髓的各种实验。本文提供的解剖方法极为详尽，包括背侧和腹侧椎板切除术，并详细说明了在进行切片前脑干-脊髓组织的定位方向。该详细的解剖与切片方案使研究人员能够保留生成和传递吸气节律所必需的全部神经环路。利用本方法可涵盖的主要神经元群/结构包括：舌下神经前运动神经元、舌下神经运动核以及preBötzinger复合体。需注意的是，本方案所述制备过程不包含脑干中存在中枢CO₂感受器或呼气节律产生回路（RTN/pFRG）的区域^20,21。在获得整体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
KCl	Sigma Aldrich	P5405-1KG
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1
NaH2PO4 •H2O	Sigma Aldrch	S9638-25G
CaCl2•2H2O	Sigma Aldrich	C7902-500G
MgSO4•7H2O	Sigma Aldrich	M7774-500G
D-葡萄糖	Sigma Aldrich	G8270-1KG
冷光源卤素灯 150 W	AmScope	H2L50-AY
解剖显微镜	Leica	M-60
Vibratome 1000 Plus	Vibratome	W3 69-0353
磁性底座	Kanetic	MB-B-DG6C
异氟烷，USP	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
经典双刃手术刀片	Wilkinson	97573
Histoclear	Sigma-Aldrich	H2779
Dumont #5 精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5/45 镊子	Fine Science Tools	11251-35
手术刀片 #10	Fine Science Tools	10010-00
手术刀柄 #3	Fine Science Tools	10003-12
直头弹簧剪	Fine Science Tools	15024-10
窄齿直头有齿镊	Fine Science Tools	11002-12
Castroviejo 微型解剖弹簧剪；直头	Roboz	RS-5650
Vannas 剪刀 3" 弯头	Roboz	RS-5621
昆虫针，0号	Fine Science Tools/8840604	26000-35
昆虫针，0号，不锈钢	Fine Science Tools	26001-35
昆虫针，00号	Fine Science Tools	26000-30
昆虫针，00号，不锈钢	Fine Science Tools	26001-30
昆虫针，000号	Fine Science Tools	26000-25
昆虫针，000号，不锈钢	Fine Science Tools	26001-25
显微操作针，0.10 mm	Fine Science Tools	26002-10
显微操作针，0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
显微操作针，0.2 mm	Fine Science Tools	26002-20
Fisher 组织处理石蜡	fisher	T56-5
石墨	fisher	G67-500
Delrin 塑料	Grainger	3HMT2
18号皮下注射针头	BD	305195