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活体小鼠肠道移植物抗宿主病的诱导及其微型内镜评估

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DOI：

10.3791/58871

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2019年2月11日

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1Department of Internal Medicine 1, University Erlangen-Nürnberg, University Hospital Erlangen, 2Institute of Pathology, Department of Nephropathology, University Hospital Erlangen, 3Deutsches Zentrum Immuntherapie (DZI), University Hospital Erlangen

本文内容

摘要

本文介绍了一种异基因造血干细胞移植方案，并可在原位对患有肠道移植物抗宿主病的活体小鼠远端结肠进行重复的微型内窥镜评估，以检测结肠炎症的存在、特征及其严重程度。

摘要

急性移植物抗宿主病（GvHD）是既往接受异基因造血干细胞移植（allo-HCT）的患者所面临的最严重并发症，常与不良临床预后相关。例如，皮肤GvHD表现通常对已建立的免疫抑制治疗有反应，因此一般不会导致致命后果；而肠道GvHD的存在及其严重程度，尤其是中下段肠道的受累，显著影响急性GvHD患者的预后和总体生存率。目前的治疗选择主要局限于经典的免疫抑制剂，其疾病缓解效果有限。因此，迫切需要深入了解肠道GvHD发生前后及过程中组织驻留免疫级联反应、肠道微生物群的变化以及间质细胞的应答，以阐明其发病机制并开发创新性治疗策略。GvHD的小鼠模型常被用于识别和功能评估可能驱动肠道GvHD的分子和通路。然而，由于目前用于评估和分级急性GvHD的既定评分系统通常包含多种参数，更多反映的是 全身性GvHD表现，因此尚缺乏能够特异性地随时间动态监测和评估肠道炎症的方法。对肠道GvHD的详细评估以往仅限于使用安乐死小鼠的研究，从而基本排除了在活体小鼠（即体内）特定实验条件下（例如，抗体介导的促炎细胞因子阻断）对结肠部位进行纵向（即动力学）分析的可能性。本文所述的对allo-HCT处理小鼠远端结肠进行微型内镜原位评估方法，能够实现：a）对肠道炎症不同方面的宏观细致评估；b）在观察期间的多个时间点采集组织样本以进行后续分析。总体而言，微型内镜技术为临床前无创监测和评估肠道GvHD提供了重要进展。

引言

起源于造血干细胞室的血液系统恶性肿瘤，以及失控的、快速进展的严重免疫介导性疾病，通常是进行异基因造血干细胞移植（allo-HCT）的指征1,2。然而，尽管供体淋巴细胞可产生预后有利的移植物抗肿瘤效应，但也常诱导并促进对allo-HCT受者体内健康组织成分的非预期免疫攻击，这一过程称为移植物抗宿主病3。胃肠道表现，即所谓的肠道GvHD，是急性GvHD中最令人担忧的并发症，其严重形式通常与高死亡率相关1,2,4。

总体而言，小鼠异基因造血细胞移植（allo-HCT）模型已成为识别和研究移植物抗宿主病（GvHD）发病机制中免疫介导作用的宝贵工具5然而，对活体小鼠中新型治疗干预措施的有益效果进行时间依赖性的动力学评估，通常依赖于临床移植物抗宿主病（GvHD）评分的测定。6。尽管这些评分适用于反映整体疾病负担（例如，系统性移植物抗宿主病），但临床评分在可靠地反映器官特异性表现方面缺乏足够的敏感性（例如, 因此，基于这些评分系统得出的结论（例如关于某种治疗干预对肠道的保护作用）通常不够充分。

尽管通过开发新型全身成像技术，并结合使用生物发光或荧光遗传小鼠模型取得了重大进展7,8，目前尚缺乏能够直接且特异性地评估活体小鼠肠道移植物抗宿主病（GvHD）表现的方法。因此，下一节所述内镜评估肠道GvHD表型方案的设计 rationale 在于克服这一障碍。此外，该方法的另一动机在于减少实验小鼠的使用数量，因为迄今为止，对细胞、形态及分子特征（例如, 通过组织病理学或分子生物学方法检测肠道移植物抗宿主病（GvHD）表现，最终需要牺牲实验小鼠。

本机构此前已报道过在同基因型结肠炎模型中进行结肠病变微型内窥镜评估的方法学9。在本研究中，我们优化并调整了结肠镜评分矩阵，以适用于在主要组织相容性复合体（MHC）I类完全错配条件下，经异基因造血细胞移植（HCT）和供体淋巴细胞输注后，活体小鼠因异体免疫应答引发肠道移植物抗宿主病（GvHD）的评估。我们确定了四个能够反映肠道GvHD相关结肠病变的参数，并建立了一套可对每个参数进行精细分级的系统，从而形成一种新型评分方法，能够直观地反映特定时间点单只小鼠肠道GvHD的严重程度。组织病理学分析证实，当内镜评分超过某一阈值时，可可靠地预测中至重度的组织炎症。因此，微型内窥镜评估似乎可作为金标准组织病理学的有效替代方法，后者通常需要牺牲实验小鼠。重要的是，该方案几乎可在疾病进程中的任意时间点应用，并可进行多次重复使用10,11。此外，与依赖生物发光的检测方法不同，本方法无需进行繁复且耗时的遗传修饰小鼠杂交等操作，因此几乎可应用于任何感兴趣的小鼠品系。

综上所述，鉴于异基因造血干细胞移植（allo-HCT）患者在发生严重肠道移植物抗宿主病（GvHD）时具有不良的临床预后，迫切需要加快科学研究进展，并更深入地了解其免疫病理过程中潜在的分子机制。同样重要的是，伦理考量要求必须以最少数量的实验小鼠获取最大化的科学知识。因此，通过在实验流程中引入对实验小鼠模型进行结肠的连续微型内镜评估，以实时监测和分级评价肠道GvHD，既可推动对肠道GvHD研究的科学进展，又能满足动物伦理要求。本研究所描述并验证的实验方案即实现了这一目标。

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方案

本文所述实验方法已获德国巴伐利亚州中弗兰肯区政府批准。

1. 移植物抗宿主病（GvHD）的诱导

  1. 第0天：受体小鼠的全身照射
    1. 使用至少10周龄的雌性CD45.2+ H2kd+ BALB/c小鼠作为受体。
    2. 在诱导移植物抗宿主病（GvHD）前，称量并记录受体小鼠的体重。
      注意：确保受体小鼠的体重不低于20 g。初始体重将作为参考值，用于计算在GvHD诱导和进展过程中每只小鼠的体重下降情况。
    3. 将最多五只小鼠放入X射线辐照仪的容器中。
    4. 使用单次8 Gy剂量的X射线对小鼠进行全身照射。以Cs137作为辐射源。
  2. 第1天：用去T细胞骨髓重建照射后的小鼠
    注意：同种异体骨髓细胞的移植（如第1.2节所述）应在照射后24小时内进行。以下操作均需在无菌组织培养罩中进行，并使用过滤后的试剂。使用同种异体CD45.1/Ly5.1 B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl小鼠作为去T细胞骨髓的供体。
    1. 根据机构指南，在受体BALB/c小鼠照射后12–24小时，处死将提供同种异体骨髓细胞的CD45.1/Ly5.1 B6.SJL小鼠。通过吸入5%异氟烷对CD45.1/Ly5.1 B6.SJL小鼠进行麻醉。在呼吸停止后继续暴露于异氟烷1分钟，并通过颈椎脱位确认死亡。
    2. 用70%乙醇彻底消毒小鼠的毛发和皮肤。
    3. 将小鼠置于干净的操作垫上，使其呈俯卧位，后肢朝向实验人员。用长度为13 cm、尖端带锯齿的Semken镊子夹住跟腱处的毛发，再用8.5 cm长、直头的硬质精细剪刀在镊子与脚跟之间切开皮肤。
    4. 将切口向前（即从脚跟经小腿和大腿至髋部区域）延长。借助镊子去除后肢的皮肤和毛发。
    5. 对另一侧后肢执行相同操作。
    6. 通过切断邻近的髋关节移除后肢。
    7. 切除后脚掌，切断膝关节。将每条后肢的大腿骨和小腿骨一起放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的92 mm培养皿中，并置于冰上。
    8. 小心清理股骨和胫骨，尽可能去除每根大腿和小腿上的肌肉组织。将股骨和胫骨转移至装有无菌RPMI 1640培养基的50 mL离心管中，并置于湿冰上，直至完成第1.2.7步中收集的所有胫骨和股骨的去肌处理。
    9. 为分离骨髓，依次将一根已按第1.2.8步清理好的股骨或胫骨从50 mL离心管转移至盛有RPMI 1640培养基的92 mm培养皿中。用手术刀切除股骨或胫骨两端，以进入含有骨髓的骨腔。
    10. 准备一个装有5 mL RPMI 1640培养基的50 mL收集管。将连接有1 mL注射器（内含1 mL RPMI 1640培养基）的26 G针头插入骨腔，推动活塞将骨髓冲洗至收集管中。
    11. 重复第1.2.10步，直至骨骼呈现浅色且有光泽（即骨腔明显无红褐色骨髓）。弃去空骨。
    12. 重复第1.2.9–1.2.11步，使用第1.2.8步中获得的所有股骨和胫骨，将所有回收的骨髓片段收集至第1.2.10步中的同一50 mL收集管中。在处理完第1.2.8步中的所有骨骼前，保持收集管置于湿冰上。
    13. 通过轻柔吹打冲洗出的碎骨髓片段，制备单细胞悬液。将骨髓单细胞悬液经置于新50 mL收集管上的40 µm网筛细胞滤器过滤。
    14. 将含有骨髓单细胞悬液的50 mL收集管在4 °C下以450 x g离心5分钟。弃去上清液。
    15. 将沉淀重悬于5 mL ACK裂解缓冲液（1 mM Na2EDTA；10 mM KHCO3；144 mM NH4Cl；pH 7.2）中，以裂解红细胞。室温孵育细胞悬液3分钟。随后立即向细胞悬液中加入10 mL PBS溶液。
    16. 在4 °C下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于2 mL PBS溶液中。
    17. 使用血细胞计数板计数骨髓细胞。保留6 x 106个细胞的等分试样，用于流式细胞术分析，以检测细胞纯化后的纯度（见第1.2.20步）。
    18. 为从骨髓单细胞悬液中去除T细胞，使用市售的细胞纯化试剂盒。根据制造商说明书，通过磁珠法去除CD90.2+细胞（即淋巴细胞）。
    19. 使用血细胞计数板计数第1.2.18步所述方法分离的去T细胞骨髓细胞。保留1 x 106个细胞的等分试样，用于后续流式细胞术分析（见第1.2.20步）。
      注意：平均每只供体小鼠获得的去T细胞骨髓细胞数量通常为2 x 107至3.4 x 107个细胞。
    20. 通过流式细胞术确认T细胞去除的成功。分别取第1.2.17步（磁性细胞分选前的骨髓细胞）和第1.2.19步（磁性细胞分选后的去T细胞骨髓细胞）保留的1 x 106个细胞，使用以下抗体进行染色：α-CD45.1 (A20)、α-CD3 (17A2)、α-CD4 (GK1.5) 和 α-CD8α (53-6.7)。使用第1.2.17步剩余的细胞作为未染色对照和单染对照，用于流式细胞仪的设置。
      1. 将每个样本的1 x 106个细胞转移至96孔V型底板的一个孔中，以进行流式细胞术染色操作。
      2. 在96孔板内（第1.2.20.1步）于4 °C下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于100 µL FACS缓冲液（含3%过滤牛血清的PBS）中。
      3. 在96孔板内于4 °C下以450 x g离心5分钟。弃去上清液。
      4. 向单染样本中加入适量选择的抗体（参见第1.2.20步），溶于100 µL FACS缓冲液中。
      5. 配制所有抗体的混合液（主混合液），其总量足以分别染色磁性T细胞去除前（见第1.2.17步）和去除后（见第1.2.19步）保留的骨髓细胞等分试样。向两个等分试样中各加入100 µL主混合液。
      6. 向未染色样本中仅加入100 µL FACS缓冲液。
      7. 在4 °C避光条件下孵育96孔板中的细胞20分钟。
      8. 加入100 µL FACS缓冲液，并在96孔板内于4 °C下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于100 µL FACS缓冲液中。
      9. 在4 °C下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于250 µL FACS缓冲液中。
      10. 将样本转移至5 mL聚苯乙烯圆底管中，并使用能够检测用于标记抗体的荧光分子的流式细胞仪进行分析（见第1.2.20步）。
      11. 比较磁性细胞分选前后细胞组成的差异。
        注意：通常在活细胞门内可达到约95%的CD45.1+CD3-（即去T细胞骨髓）细胞纯度。
    21. 用PBS溶液洗涤去T细胞骨髓细胞悬液两次（4 °C下450 x g离心5分钟），最后将细胞重悬于PBS溶液中，调整细胞浓度至5 x 107个细胞/mL。注射前保持细胞置于湿冰上。
    22. 将去T细胞骨髓细胞注入前一天已接受照射的受体小鼠体内（见第1.1节）。
      1. 将实验小鼠放入不漏气的密闭室中，通过吸入最高4%的异氟烷进行麻醉，直至小鼠失去意识。通过检测翻正反射消失及随后的足底回缩反射消失来确认镇痛和意识丧失。
      2. 使用配备30 G针头的1 mL注射器，将5 x 106个去T细胞骨髓细胞（即100 µL浓度为5x107个细胞/mL的细胞悬液）溶于PBS溶液中，经静脉注射至眶后静脉窦。 
  3. 第2天：T细胞转移
    注意：以下操作均需在无菌组织培养罩中进行，并使用过滤后的试剂。使用CD45.2 C57Bl/6（野生型；WT）小鼠作为同种反应性T细胞的供体。使用同源标记系统可区分受体（CD45.2+ H2kd+ Balb/c小鼠）与供体造血细胞类型（骨髓细胞：CD45.1+ H2kb+ B6.SJL小鼠；同种异体T细胞：CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6小鼠）。
    1. 根据适用的机构指南和法规处死C57Bl/6小鼠。通过吸入5%异氟烷对小鼠进行麻醉。在呼吸停止后继续暴露于异氟烷直至1分钟，并通过颈椎脱位确认死亡。用70%乙醇彻底消毒小鼠的毛发和皮肤。
    2. 在50 mL收集管上放置带有40 µm网筛的滤器。取出脾脏并置于滤器上。
    3. 用注射器活塞在滤器中研磨脾脏。用PBS冲洗滤器和注射器活塞，以收集所有脾细胞。
    4. 在4 °C下以450 x g离心5分钟，收集50 mL离心管中的细胞。弃去上清液。
    5. 将脾细胞重悬于3 mL ACK裂解缓冲液中以裂解红细胞。孵育细胞悬液3分钟。随后加入10 mL PBS，并在4 °C下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，将脾细胞重悬于PBS中。
    6. 使用血细胞计数板计数脾细胞。保留6 x 106个细胞的等分试样，用于流式细胞术分析，以评估第1.3.9步中的纯化程度。
    7. 为从总脾细胞中分离总CD3+ T细胞，使用市售的细胞纯化试剂盒。根据制造商说明书分离脾脏T细胞。
    8. 使用血细胞计数板计数第1.3.7步所述方法分离的脾脏CD3+ T细胞。保留1 x 106个T细胞的等分试样用于流式细胞术分析。
      注意：通过磁性细胞分选法每只供体小鼠平均可获得1.3 x 107至2 x 107个脾脏T细胞。
    9. 通过流式细胞术确认T细胞分离的成功。有关染色方案的详细描述，请参考并遵循第1.2.20.1 – 1.2.20.10步。
      1. 使用以下抗体对第1.3.6步（磁性细胞分选前）和第1.3.8步（磁性细胞分选后）的1 x 106个脾细胞进行染色：α-CD45.2 (104)、α-CD3 (17A2)、α-CD4 (GK1.5) 和 α-CD8α (53-6.7)。
      2. 使用第1.3.6步剩余的细胞作为未染色对照和各抗体的单染对照，用于流式细胞仪的设置。
      3. 比较磁性细胞分选前后细胞组成的差异。
        注意：应在淋巴细胞活细胞门内实现≥95%的CD45.2+CD3+ T细胞纯度。
    10. 用PBS洗涤T细胞两次（4 °C下450 x g离心5分钟），最后将细胞重悬于PBS溶液中，调整细胞浓度至7 x 106个细胞/mL。注射前保持细胞置于冰上。
    11. 将同种反应性脾脏T细胞（见第1.3.10步）注入先前已接受CD45.1+去T细胞骨髓细胞的照射BALB/c小鼠体内（见第1.2.22步）。
      1. 将实验小鼠放入不漏气的密闭室中，使其暴露于最高4%的异氟烷直至失去意识，以诱导麻醉。通过检测翻正反射消失及随后的足底回缩反射消失来确认镇痛和意识丧失。
      2. 使用配备30 G针头的1 mL注射器，将0.7 x 106个同种反应性CD3+ T细胞（即100 µL浓度为7 x 106 个细胞/mL的细胞悬液）溶于PBS溶液中（见第1.3.10步），经静脉注射至小鼠眶后静脉窦，以诱导GvHD。将这些小鼠命名为实验组。  (即)
      3. 向另一组小鼠静脉注射100 µL PBS溶液至眶后静脉窦，并将该组命名为对照组，后续称为"无T细胞移植（noT）小鼠"。

2. 全身性移植物抗宿主病的评估

注意：应在动物设施内经许可并配备处理活体小鼠条件的实验室内，于半无菌环境中进行此操作。

  1. 根据下文所述并借鉴Cook先前建立的评分系统，对每只小鼠的移植物抗宿主病（GvHD）临床病程进行追踪；具体而言，每周3次评估并记录实验小鼠临床GvHD症状的存在情况并进行评分 等6.
    1. 分别称量每只小鼠的体重，记录体重数值，并根据实验开始前（第0天，步骤1.1.2）测定的初始体重（定义为100%）计算相对体质量损失百分比。体重减少低于初始体重10%者评为0分，体重减少10%至25%者评为1分，体重减少超过25%者评为3分。
    2. 根据小鼠的活动水平进行评分，将活动水平正常的小鼠（评分为 0）与活动水平轻度降低的小鼠（评分为 1）以及在无外界刺激时表现为静止行为的小鼠（评分为 2）区分开来。
    3. 评估毛发质地，将正常、有光泽且整洁的毛发（评分为 0）与中度蓬乱的毛发（评分为 1）以及秃斑的出现（评分为 2）进行区分。
    4. 根据皮肤纹理进行评分，区分正常皮肤（评分为 0）、散在的脱屑皮肤斑点（例如出现在尾部和足部）（评分为 1）以及明显的脱屑和破损皮肤区域（评分为 2）。
    5. 分析分泌性粪便组分的一致性。对呈正常形态的粪便进行评分（即，硬度为0级的硬便，可变形的软便为1级，无任何硬度、因此表现为严重腹泻的粪便为2级。
    6. 将各项单独评分的参数相加，得到每只小鼠最高为12的临床评分。
  2. 根据所在机构的指导原则和批准的动物实验方案，考虑并评估因个体小鼠当前疾病严重程度而终止实验的标准。

3. 肠道移植物抗宿主病的评估

  1. 通过远端结直肠区域微型内镜对移植物抗宿主病相关病变进行评分
    注意： 在动物实验设施内经许可并配备活体小鼠操作条件的实验室内，于半无菌环境中进行操作。使用经批准可用于小型动物的微型内窥镜工作站。
    1. 使用内窥镜检查鞘包裹直径为1.9 mm、长度为10 cm的内窥镜镜头，以准备内窥镜设备。用水和乙醇清洁并消毒内窥镜。
    2. 打开计算机、可调节氙灯光源和相机模块，并调节焦距，使靠近镜头的物体呈现清晰的图像。
    3. 将气泵连接至内窥镜鞘管末端。为观察气流情况，将内窥镜顶端浸入盛有水的烧杯中。通过调节气泵与内窥镜鞘管之间的阀门来控制气流，调整至缓慢而持续的气流状态，以水中持续有少量气泡缓缓上升为宜。
    4. 将小鼠放入一个防漏的密闭室中。通过吸入最高4%的异氟烷诱导麻醉，直至小鼠失去意识。通过检测翻正反射消失以及随后足底回缩反射消失，确认镇痛效果及反射活动的缺失。
    5. 根据所使用的动物实验方案，使用合适的兽用麻醉机。将小鼠从麻醉舱转移至结肠镜检查工作区域。将处于麻醉状态的小鼠鼻部置于连接麻醉设备的鼻罩内，并将其放置于清洁的工作套筒上，使小鼠呈俯卧位，尾部朝向实验人员。
    6. 在结肠镜检查过程中，为维持麻醉状态，将异氟烷浓度降至约2%。在结肠镜检查期间监测小鼠的呼吸频率及对刺激的反应，必要时通过蒸发器调整异氟烷浓度。用眼膏涂抹小鼠眼睛，防止角膜干燥。
    7. 通过轻捏小鼠脚趾间皮肤来控制麻醉效果。若无反应，则进行步骤 3.1.8。
    8. 用一只手提起尾根部上方的尾巴，另一只手将内窥镜小心地经肛门插入直肠。
    9. 当气流充盈结直肠肠腔时，缓慢而谨慎地将内窥镜向前推进，方向为离口侧。
    10. 将内窥镜置于结肠腔中央，并保持此位置，以尽量减少与结肠壁的接触，避免造成划痕、更深层的壁损伤（例如导致出血）甚至穿孔（参见步骤 3.1.17）。通过持续观察视频流（即始终在可视化结肠腔的情况下）来控制该步骤。
    11. 若粪便阻碍视野，应撤出内窥镜，使用软质巴斯德移液管经直肠灌注最多2 mL生理盐水进行灌肠。应尽量减少液体用量，以避免粪便意外稀释及其他可能对黏膜表面特性产生负面影响的次级效应，从而影响评分结果。
    12. 尽量定期将内窥镜置于一个确定的位置 即, 远端结肠内一个明确的解剖位点，以标准化结肠炎症评分，并优化小鼠间及不同实验间评分结果的可比性。
      注意： 通常情况下，使用硬性内窥镜经直肠入路可达到的最大深度为4 cm。在距肛门2至4 cm处，结肠常出现弯曲，硬性结肠镜无法通过该弯曲部位。默认评分位置应选择在该弯曲远端相邻的结肠区域。
    13. 开始录制视频流，并开始炎症评分。
    14. 通过评分下述已说明并图示的参数，评估结肠中与移植物抗宿主病（GvHD）相关的炎症 表1 和 图3.
      1. 在评分位置轻轻前后移动内窥镜，以评估各项参数。
      2. 评估参数 "半透明性"以及 "粪便性状"通过将内窥镜置于距离结肠壁较远的位置。
      3. 评估参数 "粒度" 和 "血管化" 通过将内窥镜靠近结肠壁来实现。为此，需使用内窥镜顶端对结肠壁施加适度且精确控制的张力。
    15. 评分过程完成后，停止记录。
      注意： 随后，所记录的视频片段可整体使用，或用于生成代表性的图像（即截图），以全面反映经微型内镜评估的结肠炎相关指标。
    16. 小心地取出内窥镜。
    17. 将小鼠转移至另一个笼子以停止异氟烷暴露，使其暴露于环境空气中。使用红光灯为小鼠保温，并观察直至其从麻醉状态恢复并完全清醒。
      注意： 由于内窥镜检查过程中结肠充气，小鼠在操作后腹部区域可能出现暂时性膨胀。这种情况属于正常且短暂的现象；然而，若腹部出现持续、显著甚至进行性加重的膨胀，且小鼠未能恢复正常状态，则可能提示结肠发生意外穿孔（此时应立即实施安乐死）。
    18. 完全恢复后，将小鼠放回其相应的笼子中。
    19. 可选方法：也可进行视野引导下的组织活检。按以下步骤操作。
      注意： 结肠镜检查将按照第3.1.1–3.1.18步所述方法进行，但需进行以下修改。
      1. 在步骤3.1.1中，应使用带有内置工作通道的内窥镜检查套管，而非无工作通道的简易检查套管，以覆盖望远镜。将活检钳经工作通道插入，直至其尖端在视频屏幕上的内窥镜前端刚好可见，这可大幅避免对肠管造成意外损伤。
      2. 继续执行步骤 3.1.2 - 3.1.11。将内窥镜插入结肠，并小心推进至目标部位。
      3. 请另一位实验人员协助完成结肠组织活检操作。让第二位实验人员通过缓慢向前推进活检钳在工作通道内的位置，将活检钳尖端送至目标结肠区域，直至可张开钳口。操作过程中需持续观察视频图像，以尽量降低损伤结肠壁的风险。
      4. 通过小心地张开和闭合活检钳的钳口，回收一段结肠壁组织样本。
        注意： 操作时需谨慎，以防结肠壁穿孔。若发生结肠穿孔这一罕见情况，应立即根据机构指南并在持续麻醉条件下实施安乐死。
      5. 将闭合的活检钳从工作通道中回撤并取出。通过将打开的活检钳浸入无菌PBS溶液并轻轻振荡，使组织样本从钳口脱落。随后，根据计划进行的后续分析选择适当的组织样本保存条件。使用70%乙醇消毒后，该活检钳可重复用于获取其他活检样本。
      6. 取完活检后，取出内窥镜，并按照步骤 3.1.16 - 3.1.18 所述完成结肠镜检查。
  2. 组织病理学分析
    1. 在X射线照射后的第26至30天，根据所在机构的指南和相关规定对异基因造血细胞移植（allo-HCT）受体小鼠实施安乐死。通过吸入5%异氟烷对小鼠进行麻醉，在呼吸停止后继续暴露于异氟烷1分钟，并通过颈椎脱位确认安乐死完成。使用70%乙醇彻底消毒小鼠的皮毛和皮肤。
    2. 打开腹腔并取出结肠，将其转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿（直径92 mm）中。
    3. 用5 mL移液器吸头吸取PBS。借助一把长13 cm、尖端带锯齿状弯曲的Semken镊子，将结肠远端（约5 mm）套入移液器吸头的尖端。用镊子将结肠在移液器吸头处轻轻固定，然后按下移液器吸头的推杆，用PBS冲洗结肠，以清除肠道内的粪便。
    4. 使用手术刀切除距肛门约5 mm处的一段结肠。
    5. 将切除的肠道标本用4.5%甲醛固定过夜。在包埋于石蜡前，将组织置于直立位置。
    6. 切取3 µm厚的石蜡包埋结肠组织横切面，按照标准染色方案进行苏木精和伊红（HE）染色。
    7. 制备结肠组织样本的HE染色横切面。
    8. 改编自 Kaplan 报道的评分矩阵 等12，对炎症活动进行半定量组织病理学评分，评分范围为0-3：无炎症（评分为0），轻度炎症（评分为1），中度炎症（评分为2），重度炎症（评分为3）。
      注意： 理想情况下，应由一位熟悉小鼠肠道移植物抗宿主病（GvHD）评估且对实验组与对照组的分组情况设盲的病理学家来完成此项工作。

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结果

本方案描述了对远端结肠移植物抗宿主病（GvHD）相关病变进行微型内镜评估的方法，已在先前建立并验证的严重急性GvHD小鼠模型中应用。在本研究中，我们采用主要组织相容性复合体I类（MHC class I）完全错配的模型系统，即对BALB/c小鼠实施致死性照射后，移植T细胞耗竭的同种异体骨髓，并给予可诱导GvHD的同种反应性C57BL/6 CD3+ T细胞。+ T 淋巴细胞。用于诱导移植物抗宿主病（GvHD）的T细胞耗竭骨髓细胞和脾脏T细胞通过磁分离法进行纯化。这些细胞群的纯度通过流式细胞术测定，纯化过程的代表性结果如下所示。 图1，表明从总骨髓细胞中充分耗竭了T细胞，并稳定富集了脾脏来源的CD3+ T细胞在转移至先前接受照射的小鼠之前的临床病程显示 图2 在异基因造血细胞移植（allo-HCT）后，存在（WT，黑色）与不存在（noT，灰色）同种反应性供体T淋巴细胞的情况下，均可稳定、可重复地诱导出临床系统性移植物...

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讨论

本方案描述了诱导及通过微型内窥镜评估肠道移植物抗宿主病（GvHD）过程中结肠表型的方法学。其更广泛的意义在于使科研人员能够对肠道GvHD在整个疾病进程中（即从结肠症状出现、病情进展直至疾病活动达峰期）进行纵向且无创的观察研究。

然而，在将这些技术应用于相应科学领域之前，实验人员需要了解所展示方法中存在的一些关键步骤和重要局限性。首先，尽管我们已成功在次要组织相容性抗原不匹配模型系统中使用微型内窥镜评估与肠道移植物抗宿主病（GvHD）相关的结肠病变11，但本文提供的方案目前仅适用于MHC I类完全不匹配的急性GvHD模型。虽然MHC I类完全不匹配的GvHD模型较为常见且被广泛使用5，但已明确的是，GvHD表现的特征高度依赖于所使用的近交系小鼠亚系，因为这会显著影响例如对辐射的敏感性。此外，实验小鼠的来源，例如其肠道微生物群组成的差异以及所移植同种异体T细胞的数量，可能对肠道GvHD发生发展的动力学过程产生关键影响12。因此，一个关键步骤是必...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助，项目包括合作研究中心（CRC）221（CRC/TR221-DFG，#324392634；项目B03）（资助对象：K.H.）和合作研究中心1181（CRC-DFG，项目B05）（资助对象：K.H.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BIOTBEAM 2000 γ射线辐照仪Gamma-Service Meical GmbH
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-Aldrich Co. LLC.D8662-6x500ML
Semken 镊子（长度：13 cm；带齿、弯曲尖端）Fine Science Tools11009-13
硬化精细剪刀（长度：8.5 cm；直头尖端；刃口长度：24 mm）Fine Science Tools14090-09
RPMI-1640 培养基Sigma-Aldrich Co. LLC.R8758-500ML 
皮下注射针头（26 G）B. Braun Melsungen AG4657683
1 mL 注射器B. Braun Melsungen AG9166017V
50 mL 离心管Sarstedt Ag & Co.KG62,547,254
带 40 µm 网筛的细胞滤器BD Falcon352340
氯化铵（NH4Cl）Sigma-Aldrich Co. LLC.11209ACK 裂解缓冲液的组分
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Na2EDTA）Carl Roth GmbH & Co.KG8043.2ACK 裂解缓冲液的组分
碳酸氢钾（KHCO3）Merck KGaA1,048,540,500ACK 裂解缓冲液的组分
CD90.2 MicroBeads，小鼠Miltenyi Biotec GmbH130-049-101磁性细胞分选法用于分离去T细胞的骨髓细胞
小鼠 Pan T 细胞分离试剂盒 IIMiltenyi Biotec GmbH130-095-130磁性细胞分选法用于分离脾脏T细胞
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD45.2 抗体（克隆：104；批号：B252126；RRID: AB_493731）Biolegend109822
Pacific Blue 抗小鼠 CD3 抗体（克隆：17A2；批号：B227246；RRID: AB_493645）Biolegend100214
FITC 抗小鼠 CD4 抗体（克隆：GK1.5；批号：B225057；RRID: AB_312691）Biolegend100406
PE/Cy7 抗小鼠 CD45.1 抗体（克隆：A20；批号：B217246；RRID: AB_1134168）Biolegend110730
APC/Cy7 抗小鼠 CD8a 抗体（克隆：53-6.7；批号：B247008；RRID: AB_312753）Biolegend100714
过滤牛血清 Pan BiotecP40-47500FACS 缓冲液的组分 
96 孔聚苯乙烯 V 型底板Greiner Bio-One651201
聚苯乙烯圆底管（5 mL）Falcon352052
BD LSRFortessa II 流式细胞仪BD Bioscience Co.
带无菌内腔的胰岛素注射器（30 G）BD324826
Oxy Vet Oxymat 3Eickemeyer用于麻醉的氧气浓缩器 
NarkoVet Eickemeyer213062
有机玻璃腔室 Eickemeyer214620
直视前视望远镜KARL STORZ SE & Co KG64301 AA结肠镜检查实验装置的组成部分
保护与检查套管KARL STORZ SE & Co KG61029 C结肠镜检查实验装置的组成部分
带工作通道的检查套管KARL STORZ SE & Co KG61029 D结肠镜检查实验装置的组成部分
活检钳KARL STORZ SE & Co KG61071 ZJ 结肠镜检查实验装置的组成部分
 175 瓦 SCB 氙灯光源KARL STORZ SE & Co KG20132120结肠镜检查实验装置的组成部分
光纤导光缆KARL STORZ SE & Co KG495 NL结肠镜检查实验装置的组成部分
Image 1 S3 摄像头探头KARL STORZ SE & Co KG22220030结肠镜检查实验装置的组成部分
Image 1 SCB 摄像头控制单元KARL STORZ SE & Co KG22200020结肠镜检查实验装置的组成部分
LCD 显示器OlympusOEV181H结肠镜检查实验装置的组成部分
Forane / 异氟烷AbbVie Inc. B506
37% 甲醛溶液Carl Roth GmbH & Co.KG7398.1
5.0 mL 分液头 Eppendorf AG30089456

参考文献

  1. Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
  2. Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
  3. Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, Suppl 2 58-64 (2008).
  4. Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
  5. Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
  6. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  7. Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697(2012).
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  9. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
  10. Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138(2018).
  11. Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
  12. Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).

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