一种用于诱导大鼠卒中后抑郁的中动脉闭塞技术

摘要

本文介绍了一种通过颈内动脉阻塞大脑中动脉以在大鼠中诱导卒中后抑郁的实验方案。我们采用Porsolt强迫游泳实验和蔗糖偏好实验来确认并评估所诱导的抑郁情绪状态。

摘要

卒中后抑郁（PSD）是缺血性卒中所导致的所有精神并发症中最为常见的一种。约60%的缺血性卒中患者会经历PSD，该疾病被认为是与缺血性卒中相关、导致死亡率升高及健康状况恶化的前兆因素。PSD的病理生理机制目前尚不明确。为了进一步研究PSD的发生与发展机制，并探索可能的治疗方法，我们尝试建立一种新的实验方案，即通过颈内动脉（ICA）阻塞大鼠的中动脉（MCA）。本方案描述了一种通过中动脉闭塞（MCAO）在大鼠中诱导PSD的动物模型。实验中还采用了Porsolt强迫游泳实验和蔗糖偏好实验，以确认并评估受试大鼠的抑郁样情绪状态。与原始方法中通过颈外动脉（ECA）插入导管不同，该MCAO技术使单丝线直接经由ICA进入。该MCAO技术数年前被开发，具有降低死亡率和减少实验变异性的优势。目前普遍认为，生物模型的选择应依据既定的标准进行。本方案获得的数据表明，该MCAO模型可用于在大鼠中诱导PSD，有望促进对PSD病理生理机制的理解，并为未来新药及其他神经保护剂的研发提供途径。

引言

脑卒中是美国致死性疾病中的第四大原因^1,2,3，同时在发达国家中，它是导致成人残疾的首要原因⁴，这使得脑卒中成为全球最重大健康问题之一。脑卒中幸存患者恢复正常的极为罕见，约有15%–40%的幸存者会遭受永久性残疾，20%的患者在脑卒中发病后3个月需要机构照护⁵，约三分之一的6个月幸存者需要他人协助才能维持日常生活⁶。据报道，脑卒中还导致了国家卫生支出的不断上升⁷。根据美国心脏协会的估算，2010年美国与脑卒中相关的费用已超过500亿美元⁸。

卒中不仅会导致个体的长期损害，一些幸存者还常出现情感和行为障碍，如痴呆、疲劳、焦虑、抑郁、谵妄和攻击行为^{9,10,11,12,13,14}。卒中后最常见的心理后遗症是卒中后抑郁（PSD），约40%–50%的幸存者被诊断出患有此症^15,16,17。卒中引发的抑郁会增加发病率和死亡率^{18,19,20,21,22}。PSD 的病理生理机制尚未完全明确，但显然由多种因素引起，并与功能障碍、认知损害及病灶部位相关²³。

通过大脑中动脉阻塞（MCAO）建立的局灶性脑缺血大鼠模型是目前最广泛使用的脑卒中动物模型^24,25,26,27。为展示通过颈内动脉（ICA）阻塞大脑中动脉（MCA）诱导大鼠发生卒中后抑郁（PSD），本研究采用可降低死亡率并减少MCAO模型变异性的技术²⁸。

本方案的主要目的是介绍通过颈内动脉（ICA）阻塞大脑中动脉（MCA）以在大鼠中诱导卒中后抑郁（PSD）的操作步骤，这是一种改良的大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，可降低死亡率并减少结果的变异性²⁸。具体目标包括进行神经功能和组织学检查（测定神经功能缺损评分[NSS]、梗死区域体积和脑水肿），以验证MCAO模型的有效性，并通过行为学测试评估该MCAO操作对情绪障碍（主要是PSD）发生发展的影响。

方案

以色列内盖夫本-古里安大学动物护理委员会批准了本方案中使用的所有处理和测试程序。

1. 实验操作用大鼠的准备

注意：选择体重为 300–350 g 的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠。

1. 将大鼠每笼四只饲养于温度22 °C、湿度40%的动物房中，采用12小时颠倒光照周期（上午8:00关灯），并可自由获取食物和饮水。
2. 将大鼠随机分为两组，即MCAO组（N = 24）和假手术组（Sham组，N = 19）。

2. 大鼠手术前准备

1. 为准备大鼠进行改良的MCAO手术，将每只大鼠置于诱导室中，使用异氟烷混合气体（诱导浓度4%，手术期间2%，维持浓度1.3%）与24%氧气（流速2 L/min）麻醉30分钟，并使其自主呼吸^29,30。
   注意： 使用钝头镊子夹捏大鼠脚趾间皮肤和/或脚垫，刺激其足底回缩反射。 当该反射消失时，表明麻醉深度已足够。
2. 使用加热板将大鼠的核心体温维持在37 °C。
3. 在开始手术操作前，通过插入大鼠直肠的探头测量所有大鼠的体温。
4. 保持所有大鼠体温恒定（37 °C），以尽量减少低温对神经功能结局及神经损伤的影响。
5. 当动物处于准备台时，为其双眼涂抹人工泪液软膏。
6. 剃除每只大鼠颈部的毛发，并用70%酒精氯己定溶液（70%酒精和0.5%葡萄糖酸氯己定）对皮肤进行消毒。重复消毒步骤共三次。 
7. 用无菌手术巾覆盖大鼠。

3. 手术（大脑中动脉阻塞技术）

注意：按照 Boyko 等人²⁸ 描述的方法进行手术，并使用 McGarry 等人²⁹ 和 Uluç 等人³⁰ 提供的器械。

1. 行腹侧正中切口，并解剖浅筋膜。
2. 在三个三角形肌肉（胸骨舌骨肌、二腹肌和胸锁乳突肌）之间仔细进行锐性与钝性分离，以辨认颈动脉（颈外动脉、颈内动脉及颈总动脉[CCA]）。
3. 仔细分离并暴露右侧颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）。
4. 将右侧颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）与迷走神经分离。
   注意：按照步骤3.2所述识别颈动脉后，颈内动脉（ICA）可被确认为颈总动脉（CCA）分叉后的两个分支之一，与颈外动脉（ECA）并列。
5. 将一根导管（热钝化或硅胶包被的4-0尼龙单丝）直接经颈内动脉（ICA）插入，从右侧颈总动脉（CCA）分叉处起约18.5–19 mm，直至进入大脑动脉环（Willis环），遇到轻微阻力时停止，以阻塞大脑中动脉（MCA）。
   注意：热钝化单丝和硅胶包被的4-0尼龙单丝作用相同，近年来更受青睐，因其闭塞效果优于普通尼龙线^28,30。
6. 在右侧颈总动脉（CCA）（翼腭动脉）分叉点上方的颈内动脉（ICA）处，用4-0丝线结扎，永久性阻断导丝插入点近端的颈内动脉（ICA），而远端则暂时阻断。
7. 在颈内动脉（ICA）周围结扎，固定导丝处的丝线结，以防止出血。
8. 假手术组大鼠接受与大脑中动脉闭塞（MCAO）组相同的外科操作，但插入尼龙线代替²⁸。
   注意：尼龙线与硅胶包被尼龙线均可闭塞颈内动脉（ICA），但效果不如后者。
9. 大脑中动脉（MCA）闭塞后，缝合大鼠颈部切口，关闭麻醉，将大鼠置于孵育箱中观察，直至其苏醒。
   注意：近端结扎的目的是闭塞颈内动脉（ICA），附加的远端结扎则用于减少导丝周围出血并固定导丝位置。此外，大鼠在切口缝合后数分钟内应恢复意识。

4. 术后恢复

1. 手术后立即向每只大鼠腹腔注射 5 mL 0.9% 生理盐水溶液，以防止脱水。
2. 术后第一天无条件给予镇痛治疗；皮下注射美洛昔康 1 mg/kg，每 24 小时一次。 对于术后前 3 天内出现疼痛症状的大鼠，给予稀释的二吡咯烷（0.5 g 溶于 400 mL 饮用水中）。
3. 对发生癫痫发作的大鼠实施安乐死（癫痫发作由脑水肿或脑出血引起的颅内压升高所致²⁸）。

5. 神经系统严重程度评分³¹

注意：该操作由两名不参与手术过程的观察者执行；他们检测神经功能缺损，并对运动功能缺损进行评分，累积评分为0-4分³²。该评分可在不同时间点进行；在本项研究中，分别于术后50分钟、24小时、7天、15天和30天进行评估。以下为NSS评分的评估步骤。尽管在此情况下并非必需，但该评分可用于确认啮齿类动物是否发生脑卒中，从而决定是否给予治疗。

1. 将大鼠置于陶瓷地面上，使其自由活动1分钟。
2. 轻轻抓住大鼠尾巴向后牵拉，并按以下标准进行评分。
   1. 无神经功能缺损者评分为0分。
   2. 前肢屈曲者评分为1分。
   3. 对侧前肢握力减弱者评分为2分。
   4. 牵拉尾巴时向偏瘫侧转圈者评分为3分。
   5. 出现自发性转圈者评分为4分³²。
      注意：若观察到多种反应，应以评分较高的动作为准。

6. 梗死体积的测定（组织学检查）

1. 梗死体积的测量
   注意：按照先前所述方法进行此操作^33,34。在再灌注后24小时，使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死体积。
   1. 在最后一次NSS后24小时，将每组五只大鼠置于诱导室中，通过过量异氟烷暴露实施安乐死。
   2. 将大鼠断头，并使用小剪刀和镊子迅速分离其脑组织。
   3. 用0.9%生理盐水清洗分离出的脑组织。
   4. 检查脑组织上的出血点，排除在Willis环处发生蛛网膜下腔出血的大鼠。
   5. 将每个脑组织放置在置于-20 °C冰袋上的洁净玻璃载片上，随后放入-20 °C冰箱中5分钟，以便于切片。
   6. 将带有脑组织的玻璃载片从-20 °C冰箱中取出，重新放回-20 °C冰袋上，使用刀片和镊子切除额极和小脑部分。
   7. 用刀片将脑组织水平切成2 mm厚的切片，共获得六片。
   8. 在动物处死前，将1.25 g TTC粉末溶于500 mL生理盐水中，配制成0.05% TTC溶液，转移至用铝箔包裹的24孔板（每孔1 mL），并在4 °C下保存。
      注意： TTC及其染色组织对光敏感。
   9. 使用镊子将脑切片转移至含有TTC溶液的24孔板中（每孔一片），并在溶液中将切片展平。
   10. 将24孔板置于37 °C水浴中孵育30分钟。
   11. 用移液器吸除孔板中的TTC溶液，用脑组织清洗液洗涤切片，并在室温下继续孵育30分钟。
   12. 将切片按切割顺序排列在实验室玻璃片上，使用扫描仪观察各片段。
   13. 基于视觉识别，使用ImageJ分析软件将梗死面积计算为整个脑切片面积的百分比。
2. 梗死体积的分析³⁵
   1. 使用标准图像分析软件（ImageJ）定量梗死体积，并将梗死脑体积分析为全脑大小的百分比³³。
   2. 将脑切片放置在玻璃显微镜载片上，使用光学扫描仪以高分辨率（1,600 x 1,600 dpi）进行扫描，以供充分分析。
   3. 裁剪图像，并利用扫描图像中包含的公制尺对所有图像进行比例标准化。
   4. 使用ImageJ 1.37v软件中的 Wand（追踪）工具和自由手选工具，测量连续六片2 mm冠状切片中苍白区域的面积³⁶。
   5. 使用以下公式计算间接梗死体积³⁷。

7. 脑水肿的测量³⁸

注意：在最后一次MCAO后24小时测量脑水肿。若动物出现严重神经功能缺损，导致进食和/或饮水困难持续至少三天，体重减轻超过20%，偏瘫或癫痫发作，应实施安乐死。

1. 通过冠状切片区域的累加，以任意单位（像素）计算左右半球的体积，评估右半球水肿的程度。
   注意：使用 ImageJ 1.37v 软件进行该计算，光学扫描分辨率为 1,600 × 1,600 dpi。选定感兴趣区域后，使用 分析 菜单中的 测量 功能。本研究中使用了宏命令。
2. 将脑水肿面积表示为未受累对侧半球标准面积的百分比。
3. 使用先前建立的公式³⁹计算肿胀程度。

8. 行为范式

1. 术后第30至33天，在封闭、安静且光照可控的房间内进行行为学测试。
2. 指派对所有实验操作均不知情的研究人员，使用 commercially available program（商业可得程序）对所有行为学测试进行录像。
3. 蔗糖偏好实验^40,41
   1. 将大鼠置于单独的笼子中，放置于其日常饲养环境相同的房间内，并在黑暗周期期间进行操作。
   2. 接下来24小时，在每只待测大鼠的笼内放置一瓶100 mL的1% (w/v) 蔗糖溶液，使其适应该溶液。
   3. 24小时后，通过移除水瓶，对大鼠禁食禁水12小时。
   4. 12小时后，在每个笼内放置两瓶液体，持续4小时：一瓶含100 mL自来水，另一瓶含100 mL 1% (w/v) 蔗糖溶液。
   5. 记录大鼠消耗的蔗糖溶液和水的体积（单位：mL），并按如下方式计算蔗糖偏好率。
4. Porsolt强迫游泳实验⁴²
   注意： Porsolt强迫游泳实验的操作方法参照Zeldetz等⁴⁰和Boyko等⁴²先前发表的实验方案。该实验的基本原理是：当大鼠被强制置于一个无法逃脱的有限水域中游泳时，最终会进入静止状态，停止任何逃离水体的尝试^43,44。本实验在黑暗周期期间于另一房间进行。
   1. 将每只大鼠放入一个垂直的聚甲基丙烯酸甲酯圆柱形容器中（高度：100 cm；直径：40 cm），容器中盛有80 cm深、温度为25 °C的水，适应15分钟。
   2. 取出大鼠，放入加热的隔离箱（32 °C）中干燥15分钟。
   3. 将大鼠放回其原来的笼子中。
   4. 24小时后重复步骤8.4.1，此次用于正式测试，持续5分钟。
   5. 对5分钟测试过程进行录像，并计算该期间内大鼠静止状态的总持续时间。

结果

组织学结果（表1）显示，与假手术对照组动物相比，MCAO术后脑梗死体积占总脑体积的百分比具有统计学显著性（p < 0.0001）。此外，实验组与假手术对照组相比，脑水肿也具有统计学显著性（p < 0.0003）。

如表2所示，经Mann-Whitney检验，实验组（MCAO）的NSS评分显著低于假手术对照组，神经功能表现更差：50分钟时p < 0.001，24小时时p < 0.05，7天时p < 0.05。

蔗糖偏好评估结果显示，与假手术组大鼠相比，MCAO大鼠摄入的蔗糖量显著减少（p < 0.0001，

讨论

本研究中所展示的MCAO技术相较于原始MCAO模型更安全的一个方面在于：通过颈内动脉（ICA）阻塞大脑中动脉（MCA）时，颈外动脉（ECA）及其分支（包括枕动脉、终末舌动脉和上颌动脉）的血流未受损害。原始MCAO模型需在远端分离并凝固ECA及其分支⁴⁶，这会破坏咀嚼肌的血液供应，导致咀嚼功能受损⁴⁷。肌肉组织的损伤最终可能引发额外的计算流体动力学变化。与原始MCAO技术通过ECA入路到达MCA不同，本文所述技术针对脑卒中模型进行了改良，可避免ECA及其属支发生血流中断。

与原始MCAO模型相比，选择新型MCAO模型的最重要依据在于其能够显著降低脑水肿、梗死体积和体重变化的变异性，并减少与MCAO相关的死亡率。MCAO手术中的死亡率是一个重要因素⁴⁸；20%的死亡率被认为是可接受的^49,50。本研究中的死亡率（原始MCAO为2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸收垫	-	-	-
黑色无光泽有机玻璃箱	-	-	（120 cm × 60 cm × 60 cm），分为25%的中央区域和周围的边缘区域
瓶子	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL 瓶子，装有 100 mL 水和 100 mL 1%（w/v）蔗糖溶液
电刺激装置	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
成像系统	Kodak	-	用于成像和定量分析
单丝纤维	-	-	-
纸巾	药房	-	干燥纸巾，用于将大鼠从水中取出后擦干体表
有机玻璃圆筒	-	-	高100 cm、直径40 cm的圆筒，用于进行强迫游泳实验
Purina Chow	Purina	5001	啮齿类动物实验室饲料，适用于大鼠、小鼠和仓鼠，是一种生命周期营养配方，已在生物医学研究中使用超过50年。本实验中大鼠可自由摄取
大鼠笼具	Techniplast	2000P	常规啮齿类动物饲养笼具，本实验全程用于大鼠的饲养
扫描仪	Canon CanoScan	4200F	-
摄像机	ETHO-VISION (Noldus)	-	数字摄像机，用于在开放场实验中高清记录大鼠行为