本文描述了在载玻片上利用蓝莓或蔓越莓花提取物监测真菌病原体Colletotrichum fioriniae发育过程的生物测定方法。同时详细介绍了以水、氯仿和田间雨水为基础的花部提取技术，并探讨了这些信息的应用途径。
本文内容
摘要
摘要
为了准确监测开花期的物候特征以及花部化学信号在真菌果实腐烂病原菌上的时间动态，本研究利用Colletotrichum fioriniae建立了花部提取方法和载玻片生物测定法。在蓝莓和蔓越莓中，由于花朵在病原菌侵染初期起关键作用，因此在开花期施用杀菌剂是防控该病原菌的最优策略。本文详细描述了采用水提取、氯仿提取以及田间雨水收集方法获取花部提取物（FE），并将其用于相应的玻璃载玻片生物测定。每种FE提供了不同类型的信息：水相提取物用于评估C. fioriniae对可溶性花部化学信号的响应（水基法）；氯仿提取物用于研究病原菌对花和果实表面蜡质成分的响应（氯仿基法）；田间收集的流经花朵的雨水则实现了将体外（in vitro）观察结果延伸至农业实际环境中的监测。FE总体上分为水相和氯仿相两类，并分别配以适当的生物测定方法，以弥补这两类提取物之间的固有差异。针对不同作物，使用特制装置分别收集流经花朵的雨水，表明该方法具有良好的灵活性，可推广应用于其他作物系统。这些生物测定方法快速、经济、简便，能够从多种来源获取关于刺激性花部化合物存在的时空分布及特定地点的信息。这些信息将有助于优化病害管理策略，因为花部提取物会缩短病原菌侵染所需的时间，从而揭示生长季中病原菌侵染风险的动态变化。
引言
Colletotrichum fioriniae 导致高丛蓝莓果实腐烂Vaccinium corymbosum L.) 和大果越橘（大西洋蔓越莓）V. macrocarpon Aiton)1,2该病原体最近从 C. acutatum 复合种3,4,5,6 是蓝莓炭疽病的致病因子，也是蔓越莓果实腐烂复合病害的病原之一，此外还在全球范围内引起多种其他植物病害7. C. fioriniae 具有潜伏性半活体营养生活方式8，感染在开花期间发生，但症状直到果实进入成熟末期才变得明显9在蓝莓和蔓越莓中，只有在开花期间施用杀菌剂才能有效控制果实腐烂病。该病原菌在休眠的蓝莓花芽鳞片中越冬。10 并在开花期间产孢。分生孢子通过雨水飞溅在冠层内传播11,12 且接种物的积累与水华期密切相关13. 反应 炭疽菌属 物种对寄主花卉的偏好并非特例 Vaccinium，因为花朵是柑橘花后落果（PFD）的重要组成部分14 以及草莓炭疽病15，这两种情况均导致病原体产生孢子。上述所有情况均凸显了建立有效方法以评估花部化学信号对病原体时间动态影响的必要性 C. fioriniae 以及其他在开花期间感染的病原体。本文所述方法所提供的见解正变得愈发重要。
本实验方案详细介绍了花提取物（FE）的制备方法，并指导通过载玻片生物测定法评估C. fioriniae对FE的响应15,16。花提取技术分为两大类：基于水的提取方法（主动-FE、被动（pass-FE）以及田间雨水提取（rw-FE））和基于氯仿的提取方法（ch-FE）17。基于水的提取方法可用于检测可溶于水的花部化学信号物质。这些可溶性信号物质很可能是侵染微环境中的重要组分，因为FE不仅显著加快侵染速度16，还为侵染过程提供了必要的水分条件。此外，该方法更接近自然状态，因为在湿润事件中，花部刺激物可随雨水在整个冠层中扩散，这在此前的蓝莓及其他作物系统中已有观察记录14,16。基于氯仿的花提取物（ch-FE）同样可提供有关病原菌对寄主表面蜡质响应的重要信息17,18，有助于阐明分生孢子一旦沉积到感病寄主器官（即花、子房和发育中的果实）后早期生长阶段的情况。本方案还可用于监测病原菌对寄主表面蜡质季节性变化的响应。因此，这些生物测定实验针对水基FE或氯仿基FE分别设计，以应对这两类材料之间的固有差异。
生物测定实验产生的数据表明，与氯仿提取物相比，水提取物能刺激更高水平的次级分生孢子形成，而在氯仿提取条件下则表现出明确的附着胞反应，因此推测发酵提取物（FE）中含有多种化合物。有趣的是，当使用蓝莓和蔓越莓花朵表面流过的雨水时，也观察到了这两种生长反应，表明花朵表面可被冲刷下多种刺激性化合物。因此，监测花朵表面的刺激效应将有助于了解病原菌在农业系统中成功侵染的可能性。
本实验方案的最终目标是提供一种方法，用于生成关于真菌植物病原菌对花卉化学信号响应的基础生物学信息，同时建立可利用这些花卉信息来辅助特定地点病害管理和决策过程的方法体系。
方案
1. 真菌分离株与孢子悬液
- 从自然感染的寄主植物中分离Colletotrichum fioriniae菌株19。随后，将纯培养物保存在玉米粉琼脂（CMA）斜面上。取CMA斜面培养物的菌块，接种至含有澄清V8汁琼脂（cV8A）（参照Miller 1955年方法改良）或未澄清V8汁琼脂（V8A）的标准塑料细胞培养皿（直径9 cm）中20。当菌落开始产孢时，用无菌接种环挑取分生孢子（橙色孢子团）划线接种至另一含cV8A或V8A的细胞培养皿中，以获得高密度产孢培养物。
注意：所有涉及真菌的操作步骤均应在超净工作台中进行，以降低真菌培养物或生物测定实验被污染的风险。 - 培养7天后，用标准无菌接种环从高密度培养物中轻轻蘸取少量分生孢子，转移至含有10 mL无菌去离子水（SDW）的15 mL离心管中。涡旋振荡10秒，再用标准移液器反复吹打数次，使孢子充分混匀。
- 随后，取一滴涡旋处理后的孢子悬液置于血细胞计数板上，估算孢子浓度。计数血细胞计数板上的5–10个视野，计算平均值，并乘以相应的稀释倍数（即 10,000），从而得到每毫升无菌去离子水中分生孢子的浓度。
- 然后，根据体积（V）与浓度（C）的计算公式（V1●[C1]=V2●[C2]），用无菌去离子水将孢子悬液调整至终体积5 mL、浓度为1.0 × 105 个分生孢子/mL。此悬液称为孢子悬液，仅在进行生物测定前现配使用。
2. 活性水基植物提取物（active-FE）15,16
注意：参见补充图1、补充图2、补充图3和补充视频1。
- 在田间蓝莓（4月至5月）和蔓越莓（6月至7月）各自盛花期时，人工仔细采集花朵（补充图1）。在不同采样地点（品种/品系/地理位置）之间更换腈手套，以防止人体皮肤油脂污染以及不同花型之间的交叉污染。将来自单一来源的蓝莓或蔓越莓花朵放入塑料袋中（装满一个100 × 150 mm的袋子），采集后立即于4 °C冷藏保存。
注：主动提取方法经Leandro 等. (2003)16修改而来。 - 提取前，去除任何退化、受损或患病的花朵，使用弯头镊子（45˚镊子）从健康花朵中移除子房、萼片和花梗并弃去。仅使用剩余的花器官（花冠、柱头、花柱和雄蕊）进行主动提取。将纱布（150 × 150 mm）剪裁后置于7 × 7 mm漏斗内，插入洁净的50 mL离心管中，备用。
- 在研钵中按1份处理后的花朵与9份超纯水（质量:体积比为1:9）的比例混合。用研杵轻轻研磨30秒（注意不要完全粉碎样品）。将所得浆液通过预先准备好的纱布/漏斗过滤，并收集至离心管（50 mL）中。每次提取之间，使用95%乙醇和温水冲洗或更换新的研钵和研杵。
- 准备真空过滤装置：备好布氏漏斗、真空过滤锥形瓶（容量可达1,000 mL）、55 mm圆形滤纸和真空管/源。将滤纸放入合适尺寸的布氏漏斗中，并将其置于锥形瓶上，然后通过真空管将装置连接至水流/抽吸源，备用。
- 进一步通过在8,055 × g条件下离心10分钟澄清蓝莓花提取物。将上清液倒入已准备好的真空过滤装置中，开启真空源，过滤上清液，然后将锥形瓶中的滤液转移至新的离心管（50 mL）。每次过滤后，使用95%乙醇和温水清洗所有装置组件。再使用带有0.22 µm孔径、醋酸纤维素灭菌滤膜的注射器过滤装置，将滤液进一步过滤至新的离心管（50 mL）。
- 对于蔓越莓花提取物，仅需通过滤纸进行真空过滤，然后将锥形瓶中的滤液转移至新的离心管（50 mL）即可。
- 所得样品称为主动花提取物（active-FE）。将所有基于水的花提取物（主动、被动及雨水采集样品）分装为5–50 mL等份，于-20 °C保存，直至实验使用。对多个样品重复提取操作（每种样品类型至少进行3次独立提取），以提供生物学重复。
3. 被动、以水为基质的植物提取物（pass-FE）16
注意：参见补充视频2。
- 按上述方法手工采集完整的蓝莓花朵（50 g），采集后立即冷藏。提取前去除所有变质、受损或患病的花朵，并仅从完好的花朵上除去花梗。将处理好的样品冷藏，直至下文所述的被动提取系统准备就绪。
- 使用前用95%乙醇（EtOH）和温水冲洗所有组件，以防止污染（塑料网片、两个塑料网篮、玻璃烤盘和喷雾瓶）。同时按上述步骤2.2所述，为每次提取准备一个四层纱布/漏斗/50 mL离心管组合，备用。
- 准备筛网：将一张塑料网片（又称透明条状垫）放入一个塑料网篮（114 × 102 mm）中。将第二个相同的网篮倒置（开口向下）放入玻璃烤盘（127 × 229 mm）中（以避免花朵接触静置去离子水），再将装有网片的网篮置于其上。向筛网中加入50 g已准备好的花朵。
注意：也可使用小型试管[清洗]篮替代原先使用的塑料网篮（旧的绿色草莓网状品脱篮通常难以获取）。 - 用喷雾瓶均匀喷洒250 mL水雾润湿花朵，并用玻璃烤盘收集流出液。然后将滤液通过预先准备好的纱布/漏斗组合过滤至洁净的离心管中。所得样品称为被动花部提取物（pass-FE）；按上述步骤2.6所述条件储存。
- 每次提取后，均需用95%乙醇和温水清洗所有组件。对多个样品重复提取操作，以获得重复样本（每种样品类型至少3个重复）。
4. 基于氯仿的花部提取物（ch-FE）17
- 按照上述方法（步骤 2.1）采集蓝莓和蔓越莓的花朵，并进行花朵提取前的准备（步骤 2.2，无需准备纱布/漏斗）。将准备好的花朵冷藏保存，直至使用前取出。
- 出于安全考虑，所有涉及氯仿的操作必须在通风橱中进行。包括材料/玻璃器皿的准备、提取操作以及生物测定（使用 ch-FE 的步骤）。
- 使用 95% 乙醇清洗所有组件两次，再用氯仿清洗两次，以防止每次提取过程中的污染：螺口玻璃培养管、2 个玻璃烧杯、小型不锈钢筛网和一个[玻璃]量筒。清洗后倒置晾干。仅用 95% 乙醇冲洗聚四氟乙烯（PTFE）衬垫瓶盖两次（氯仿会损坏瓶盖外部材料），然后晾干备用。
- 在烧杯中将 1 份处理过的花朵与 9 份氯仿（质量体积比为 1:9）混合（先加花朵，后加氯仿），轻轻旋转混匀 30 秒，然后通过不锈钢筛网过滤至第二个烧杯中。将滤得的 ch-FE 从第二个烧杯倒入玻璃培养管（10–15 mL），并拧紧 PTFE 瓶盖。用封口膜包裹瓶盖以防止蒸发。
- 此制备物为基于氯仿的花朵提取物（ch-FE）。将样品避光保存（以减少光降解），置于 4 °C 下，直至实验使用。对多个样品重复提取操作，以获得重复样本（每种样品类型至少 3 个重复）。
5. 蓝莓花朵雨水的收集（BB rw-FE）16
注意：蓝莓花部雨水收集装置由一个带连接适配器的一次性喷枪涂料杯（杯体：内螺纹，适配器：公对公螺纹）、50 mL 离心管（聚丙烯材质）、Parafilm 封口膜以及塑料包覆金属丝（标准电话线，单股内部金属丝）组成。
- 在蓝莓灌木的不同位置选择多个采样点，以收集花朵上的雨水径流，采样点范围从花序（花）正下方直至灌木基部（根茎处）。记录所选位置茎秆的直径（范围为1-5 cm），因为这将决定后续所述采集装置固定时所用孔径的大小。
- 针对每个选定位置制作采集装置。首先，将步进钻头安装在台钻上，然后在喷雾杯底部（杯体向螺纹开口弯曲处）钻一个与茎秆直径相对应的孔。接着，从孔的顶部沿直线切割至喷雾杯口部。在喷雾杯口部钻4个等距分布的孔（孔径需足够大以穿入塑料包被金属丝），并将塑料包被金属丝的一端固定在孔中，另一端保持自由。
- 在50 mL离心管盖上钻一个足够大的孔，以便插入喷雾杯适配器。用Parafilm封住适配器螺纹部分以防泄漏。将该适配器同时连接到离心管盖和喷雾杯的螺纹部分，并连接配套的50 mL离心管。
- 重复步骤5.3–5.4，根据所选位置制作多个采集装置，每个采样点至少制备4个采集装置。
- 通过弯曲喷雾杯将其安装至选定位置的茎秆上。利用连接在其他茎秆上的塑料包被金属丝，将喷雾杯的切口侧朝上固定，以确保流经花朵的雨水被有效收集。对可能漏水的缝隙使用Parafilm密封。（补充图3、补充图4、补充图5和补充图6）。
- 用部署日期/时间标记采集管。降雨事件后，取下并更换离心管的底部（管体部分），并标注采集日期/时间。将收集的径流样品（称为蓝莓雨水花部提取物，BB rw-FE）带回室内，进行真空过滤（过滤方法见步骤2.4–2.5）。按前述方法（步骤2.6）储存，直至用于水基生物测定实验。
6. 蔓越莓花朵雨水的收集（CB rw-FE）
- 蔓越莓花部雨水收集装置由一个 7 × 7 cm 的聚丙烯漏斗、50 mL 离心管（聚丙烯材质）、封口膜和 4 根标准塑料包被的金属丝扎带（每个装置）组成。
- 首先，使用金属探针在漏斗口部周围均匀加热打孔 8 个孔（孔径与扎带粗细匹配）。将 4 根扎带插入其中 4 个孔中，并将另一端固定在对侧相对位置的孔中，形成整齐的交叉结构。用封口膜包裹漏斗的下部茎状部分，放置一旁备用。
- 使用阶梯钻头在 50 mL 离心管盖上钻一个足够大的孔，以便插入漏斗的下茎部分。将已准备好的漏斗插入离心管盖中。重复步骤 6.2–6.3 制作多个装置，每个采样点至少设置 4 个收集装置。
- 将标注好日期/时间的装置部署到选定的蔓越莓沼泽地中。将两枝带花的花序（称为直立枝）小心地固定在交叉的塑料扎带下方。然后通过将离心管插入蔓越莓冠层中，使装置保持垂直方向（补充图 7–8，补充视频 3）。
- 降雨或喷灌结束后，取下并更换离心管的底部（管体部分）（标注采集日期/时间）。将收集的径流液（称为蔓越莓花部雨水提取物（CB rw-FE））带回室内，进行真空过滤（过滤方法见步骤 2.4–2.5）。按前述方法（步骤 2.6）储存，直至用于水基生物测定实验。
7. 使用水基花卉提取物的生物测定15,16（active-FE、pass-FE、rw-FE）
注意：参见图1。
- 该生物测定在超净工作台中进行。准备材料：用95%乙醇对玻璃盖玻片进行三次冲洗，晾干后备用。将纸巾裁剪成与标准塑料细胞培养皿（9 cm）内径相匹配的圆片，放入培养皿中，放置两层纸巾圆片，并加入2 mL无菌去离子水（SDW）使其充分浸润。
- 按前述步骤（1.2–1.4）制备至少5 mL浓度为1.0 × 105 个分生孢子/mL的SDW孢子悬浮液（C. fioriniae），置于一旁备用。随后，在2 mL微量离心管中等体积混合SDW与水基花提取物（floral extract, FE）。再向已准备好的含SDW和FE的2 mL微量离心管中加入等体积的孢子悬浮液，所得混合物称为水相处理液。对照组则省略FE部分，以等量SDW替代，以保持各组分生孢子浓度一致。
注：处理液体积取决于重复次数和取样时间点数量，通常每份体积不超过500 µL。一旦将分生孢子与FE混合，即视为生物测定开始，此时记为接种后0 h。 - 将预清洁的玻璃盖玻片放置于培养皿内湿润的纸巾上。在每片盖玻片中央滴加40 µL水相处理液。对所有所需处理组（包括对照组）重复此操作后，盖上培养皿盖。为实现重复实验（至少3次重复）和不同时间点的测定，需在独立的培养皿中分别进行（每个培养皿对应一个时间点）。完成所有处理组和重复组的加样后，将所有培养皿放入密封塑料容器（30 × 13 × 7 mm）中，于25°C避光条件下培养。
- 在预定的时间点，向液滴中加入10 µL固定液（如乳酸酚棉蓝溶液，配方为：20.0 g苯酚晶体、20.0 mL 2.5%乳酸、40.0 mL甘油、0.05 g棉蓝），以终止生长并实现半永久封片保存。
- 为采集0 h时间点样本，需等待2 h后再加固定液，此时间足以使分生孢子附着于玻璃表面，但不足以引发萌发。其余各时间点则在相应时间直接加入固定液。
- 加入固定液后，小心将盖玻片翻转，使液滴面朝下贴附于显微镜载玻片上，以便后续显微观察（每张载玻片放置一片盖玻片）。待所有盖玻片均转移至载玻片后，在超净工作台中静置并部分干燥20分钟。
- 在盖玻片上统计所有存在的分生孢子（总分生孢子数，包括初生分生孢子、已萌发分生孢子及新形成的次生分生孢子）以及附着器的数量，可在400倍放大下计数16个视野，或在200倍下计数4个视野，总计观察面积为3.808 mm2。整个生物测定实验需设置重复，以用于统计分析。对于使用水基FE的实验，数据分析方法参照Waller et al. 201716，结果通常以每mm2的平均计数（总分生孢子数或附着器数）表示。
8. 使用基于氯仿的花提取物（ch-FE）进行生物测定17
注意：参见图2。
- 按照上述步骤（7.1）准备材料和细胞培养皿。此外，在通风橱内，用相同数量的Van Tieghem细胞（VanT.细胞）（外径8 mm，内径6 mm）覆盖盖玻片，并用玻璃移液管（1 mL，最小刻度1 µL）分别以95%乙醇冲洗两次，再以氯仿冲洗两次，然后放置备用。
- 在超净工作台中，使用2 mL微量离心管加入两份等体积（每份至少500 µL）的无菌蒸馏水（SDW）和一份孢子悬浮液，混匀后放置备用。此即ch-FE生物测定所用的水相处理混合液。
- 在通风橱内，将一个VanT.细胞放置于已准备好的塑料细胞培养皿中的盖玻片上。用玻璃移液管向VanT.细胞中心加入33 µL所需ch-FE（避免接触VanT.细胞壁）；对照处理组则加入纯氯仿，并使其自然干燥。每组处理需在独立的细胞培养皿中进行重复实验（至少3次重复）。
- 待ch-FE完全干燥后，用标准移液器向VanT.细胞中心加入99 µL已配制的水相处理混合液，然后盖上所有细胞培养皿的盖子。一旦水相处理混合液接触到干燥的ch-FE处理物，即视为生物测定开始，记为接种后0小时（0 h post-inoculation）。
- 完成所有处理及重复加样后，将所有（已封闭）的细胞培养皿放入一个密封的塑料容器（30 × 13 × 7 mm）中，在黑暗条件下于25°C恒温培养。
- 在预定的时间点，向VanT.细胞中加入15 µL固定液（乳酚棉蓝），静置至少5分钟，以确保真菌结构充分染色。染色完成后，小心取出VanT.细胞，并按照上述步骤（7.5–7.6）进行盖玻片翻转及数据采集。数据分析参照Gager 201517所述方法，通常以附着胞形成率表示结果，即在观察区域（3.808 mm2）内统计的总分生孢子数与形成的附着胞数之比。
9. 基于蔓越莓物候的提取方法17
- 手工采集越橘花（6月；100 g）、未成熟果实（两次；7月和8月；每次200 g）以及收获期的成熟越橘果实（10月；200 g），放入适当大小的塑料袋中，采集后立即于4 °C冷藏。操作时需遵循上述污染防控措施（步骤2.1）。
注意：每个时间点将收集额外的植物材料，以避免提取明显受真菌感染的子房和果实（表现出疾病症状和体征）。 - 在提取之前，去除任何退化、受损或患病的花朵，仅选用健康花朵，用弯头镊子（45°镊子）去除萼片、花梗、花冠、柱头、花柱和雄蕊，仅保留子房，其余部分弃去。收集子房后，按1 wt: 9 vol的比例进行氯仿提取（具体步骤见4.2–4.4，仅使用子房）。保存样品直至所有其他提取完成， 即 直至进行生物测定电导率。
- 果实采集后，采用氯仿提取法（步骤4.2–4.4，以采集的果实代替花朵），将10 g果实加入90 mL氯仿中进行提取，提取完成后使溶液蒸发至9 mL（得到10 g : 9 mL 质量体积比的溶液）。
- 在7月、8月和10月采集果实后立即进行果实提取。按照上述方法（步骤4.4）保存，直至收集完所有提取物。在完成最后一次基于氯仿的果实提取后，将本实验所收集的全部基于物候学的氯仿提取物进行基于氯仿的生物测定，并按相应步骤分析（步骤8.1–8.6）。
结果
本文展示的结果仅是利用该方法可开展的众多检测中的几个示例。 图1 是一种以图示方式介绍基于水相的FE生物测定法的指南，并由 图2 随后进行基于氯仿的FE生物测定。 图3 为显微镜评估时可能观察到的结果提供直观的指导 C. fioriniae 在24小时时，基于水和氯仿的生物测定中（与SDW对照组相比）。 图4 详细描述了一项为期24小时的时间进程研究 C. fioriniae 在蔓越莓品种‘Stevens’的ch-FE存在条件下，为本研究的一个重要结果提供了直观参考：与SDW相比，FE缩短了感染结构形成所需的时间。 图5 提供了一个使用蔓越莓花部雨水径流（CB "Flower" rw-FE）进行盖玻片生物测定所获得数据的示例。 图6 代表了另一项重要结果：花期子房的壳聚糖-果胶复合物（ch-FE）比果实期的ch-FE具有更强的刺激作用，表明开花期在生命周期中的重要性 C. fioriniae 补充图片和视频提供了用于提取的花朵以及花部雨水收集装置及其布设的重要可视化资料，此外还包括展示以下内容的视频 活性- 和 被动的 提取（水基）过程
图1水基花卉提取物（FE）生物测定的总体概述 该检测方法用于蓝莓和蔓越莓的水性花提取物： 活性-植物提取物（活性-Fe) 被动的植物提取物（通过- FE）和花部雨水径流（rw-FE）。“-FE”部分通常作为实验中的可变因素。相反，“-FE”部分可保持恒定，而接种后不同时间点（小时）可被评估。推荐在200倍放大倍数下进行4个视野的田间分析。缩写：无菌去离子水，SDW；每个视野面积，A。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：基于氯仿的花部提取物（ch-FE）生物测定法的总体示意图。 该测定法适用于蓝莓和蔓越莓（花、子房及果实）。本实验仅使用一种水相处理混合液，即1份孢子悬浮液与2份SDW混合（以保持分生孢子浓度一致，避免因ch-FE挥发导致浓度变化）。该方法可用于比较多种ch-FE（来自不同植物表面的蜡质）或使用单一ch-FE比较接种后不同时间点/小时的效应。缩写：无菌去离子水，SDW；Van Tieghem [玻璃]细胞，VanT. cell。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：在水相FE和氯仿-FE存在下Colletotrichum fioriniae的直观比较。 本实验中，比较了蓝莓‘Bluecrop’（活性-FE，水相）（真菌分离株：BB#10）和蔓越莓‘Stevens’氯仿提取物（ch-FE）（真菌分离株：CB-PMAP182）的花提取物与SDW对照组的效果。接种后24小时，与SDW（对照组）(A) 相比，在活性-FE (B) 存在下的分生孢子表现出明显的次级产孢（环状结构）和附着胞形成（箭头所示）。然而，在氯仿生物测定中，与SDW对照组 (C) 相比，ch-FE处理组 (D) 的次级产孢现象并不显著；相反，C. fioriniae 的生长趋势转向更多地形成附着胞。本图展示了无论寄主/花种如何，对水相和氯仿相两种提取方式的典型响应。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：在ch-FE存在下对Colletotrichum fioriniae进行的时间序列研究（24小时）。 本实验中，在接种后0、6、12和24小时对SDW对照组（A-D）以及蔓越莓'Stevens'的ch-FE处理组（E-F）进行了肉眼观察（此处以可变时间点为例，而非比较多种FE）。在ch-FE条件下，附着胞的形成（箭头所示）从6小时开始，并在后续时间点持续增加。该结果提示了病原菌在开花期生物学中的一个重要因素：花朵缩短了病原菌形成侵染结构所需的时间。请点击此处查看该图的放大版本。
图5使用rw-FE在生物测定中收集数据的图形化展示。 单次降雨事件中蔓越莓花朵上的雨水径流（CB“花朵”rw-FE）以及未接触任何蔓越莓植株组织的原始雨水（“地面”rw-FE），外加一个标准 活性，越橘水性花提取物（CB 活性-FE)（阳性对照）和 SDW（阴性对照）进行基于水的盖玻片生物测定，并对其进行评估 C. fioriniae 生长。CB “Flower” rw-FE 的次级分生孢子形成和附着胞发育水平与标准 CB 相同。 活性接种后24小时的FE，表明采集装置有效捕获了润湿事件期间释放的花部刺激物。总分生孢子数包括初级（沉积的）分生孢子和新形成的次级分生孢子。字母表示在 p < 根据Fisher最小显著性差异检验（LSD），显著性水平为0.05；大写字母表示总分生孢子数；小写字母表示附着胞数。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：基于蔓越莓物候期的氯仿提取物（ch-FE）生物测定法的肉眼观察结果。 果实腐烂真菌的病害管理通常涉及在开花期施用杀菌剂。本实验中，对蔓越莓（‘Stevens’品种）在不同生长阶段采集的氯仿提取物（ch-FE）进行了肉眼评估，以观察其表面蜡质对接种后24小时的C. fioriniae的影响。分别采集了6月的子房 (A)、7月和8月的未成熟果实 (B, C)、10月的收获果实 (D)，以及无菌蒸馏水对照组 (E)，并观察其附着胞的形成情况（箭头所示）。结果显示，子房来源的ch-FE诱导附着胞形成的程度最高，表明该植物物候期（开花期）对C. fioriniae的生活史具有关键重要性。请点击此处查看该图的高清版本。
补充图1：蓝莓花序。 在盛花期（美国新泽西州4月至5月）采集蓝莓花朵用于提取（图示品种为‘Bluecrop’）。请注意相邻花朵之间花冠与子房的重叠情况，以及花序的整体结构，并与补充图2（越橘直立茎）进行比较。请点击此处查看此图的放大版本。
补充图2：越橘直立茎。 在盛花期（美国新泽西州6月至7月）采集越橘花朵用于提取（图示品种为'Stevens'）。注意单个越橘花序（直立茎）上不同的花发育阶段，以及呈钩状、保留着花冠形状的水滴。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图3：蓝莓花部雨水收集装置（花）。 已完成的蓝莓花部雨水收集装置，直接放置于花序簇下方。注意使用了塑料包被的金属丝以使装置保持垂直方向。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图4：蓝莓雨水采集装置（茎部）。 已完成的蓝莓花部雨水收集装置，安装在植株茎部中间位置，介于花序与灌木基部冠部之间。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图5：蓝莓花部雨水采集装置（冠层）。 已完成的蓝莓花部雨水采集装置，放置于灌木基部（冠层）。若无需固定，可移除塑料包被的金属丝。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图6：蓝莓种植区雨水采集装置（地面部署）。 已组装完成的原始雨水采集装置，放置于蓝莓灌木旁。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图7：蔓越莓雨水采集装置（特写）。 已完成的蔓越莓花部雨水收集装置，两个支杆插入整齐交叉的扎线带下方。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图8：蔓越莓雨水收集装置的部署。 多个已完成的蔓越莓花朵雨水收集装置部署在湿地中。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充视频 1：活性水基花提取物（active-FE）。 本补充视频对应步骤 2.3–2.5.1。使用蓝莓品种“Bluecrop”的花。 请点击此处观看视频。（右键可下载。）
补充视频 2：被动水基花卉提取物（pass-FE）。 本补充视频对应步骤 3.3–3.4。实验使用蓝莓品种“Bluecrop”的花朵。请点击此处观看视频。（右键可下载。）
补充视频 3：蔓越莓花朵雨水采集装置的部署。该补充视频对应步骤 6.4 的操作。 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）
讨论
检测生物活性的生物测定法 C. fioriniae 对蓝莓和蔓越莓果实腐烂病害系统，已建立了响应花卉提取物（FEs）的实验方法，但该方法可轻松适用于其他园艺作物。上述详细方案在获取大量重要数据集方面具有重要价值，包括但不限于：不同FEs对多种病原菌多个分离株的影响、真菌在不同FEs存在条件下的生长阶段时间进程信息、提取技术的比较、以及单一化学成分作用的检测 C. fioriniae 生长与分化，单个花器官提取物的评价，温度对...的影响 C. fioriniae 而在存在FE的情况下，物候依赖性蜡质提取的影响以及花部雨水的影响。通过使用这些技术，所生成的数据还为这些过程提供了更为清晰的理解 C. fioriniae 生活史阶段，并部分阐明了为何盛花期对控制多种果实腐烂病原体如此关键。
最初，所有花朵均按照活性-FE的方法进行处理，但目前提取过程已逐渐转向使用整朵花。花器官解剖耗时较长，且对所得FE的生物活性影响甚微。然而，本方案也可用于单独评估不同花器官，但必须格外注意避免将花组织彻底研磨破碎（补充视频1，具体注意事项详见步骤2.3），否则可能导致真菌毒性/抑菌性化合物释放到FE中，从而干扰显微观察结果。目前更倾向于采用侵入性较小的提取方法，例如被动-FE（补充视频2）和rw-FE，因其获取更为简便。此外，这些提取技术仅需通过真空过滤即可获得具有生物活性的花部化学信号。
所有提取所用的花朵通常在提取制备前冷藏0至3天。本方案的一个难点是花提取物（FE）周转过程的时间管理（从田间采集到提取物储存）。由于来自多个来源和不同日期的样品数量众多，这一问题变得更加复杂。目前尚未对冷冻花朵进行充分评估，因为解冻后的花朵似乎出现退化和变色现象。然而，一旦制备成水基花提取物（FE），反复冻融对FE的生物活性没有影响，因此只要在生物测定制备后迅速重新冷冻，FE即可保持活性（已有保存3年仍具活性的FE实例）。
基于氯仿的提取方法能够通过在玻璃盖玻片上进行氯仿-蜡质提取物（ch-FE）蒸发，以二维平面研究病原体对三维花部/果实表面蜡质的响应。然而，由ch-FE沉积形成的蜡质实际晶体结构很可能与原始采集表面的结构并不完全相同。这意味着，如果研究的主要目标是真菌对特定蜡质结构的体内（in vivo）响应，则应结合使用其他补充技术。相比水相提取物，基于氯仿的提取物需要更严格的储存维护。除需将ch-FE提取物避光保存外，还应定期检查聚四氟乙烯（PTFE）衬垫的细胞培养管盖和封口用Parafilm膜是否存在蒸发泄漏，并根据需要及时更换。
监测花部雨水径流的概念源于推进特定地点病害监测工具的理念。只要集水装置能够收集从花朵表面流下的雨水，该装置便可适用于多种其他植物结构。此方法可提供信息，用于判断在特定时间田间是否存在花部刺激信号，并可在整个生长季持续监测。此外，也可在冠层不同位置布设集水装置，以确定在任意一次湿润事件中花部信号物质被冲刷的距离。在未来的实验中，雨水洗脱物中的花部诱导因子（rw-FE）将决定杀菌剂施用的起始时间以及安全终止时间。此外，通过监测依赖物候期的蜡质提取（方案第9部分），花期对病原菌生物学的重要性变得更加明确。该部分内容的加入还旨在展示这些生物测定方法的灵活性，提供可对在时间上分离的寄主表面蜡质进行并行比较的实验手段。利用花部提取技术及生物测定所获得的数据，代表了病原菌刺激的可量化指标、对病原菌生物学具有重要意义的特定化学类别，以及未来防控策略的潜在靶点。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 William S. Haines, Sr. 命名的蔓越莓研究基金以及新泽西蓝莓与蔓越莓研究委员会（New Jersey Blueberry and Cranberry Research Council, Inc.）提供的支持。我们还感谢 Jennifer Vaiciunas（指导与花朵样品制备）、Christine Constantelos（真菌培养与花朵样品制备）、David Jones（花朵样品制备与提取）、Langley Oudemans（花朵样品制备、拍摄/摄影）、Jesse Lynch（花朵样品制备）、Roxanne Tumnalis（常规支持）以及众多学生/暑期实习生。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 孔径，醋酸纤维素无菌滤器 | VWR | 101102-280 | 蓝莓花提取物（FE）澄清 |
| 200-1000 µ移液器及吸头 | - | - | 设备，任何品牌在指定范围内均可满足要求 |
| 40-200 µ移液器及吸头 | - | - | 设备，任何在规格范围内的品牌均可满足要求 |
| 5-40 µ移液器及吸头 | - | - | 设备，任何品牌在指定范围内均可适用 |
| 一次性喷漆杯配连接适配器的空气喷枪 | 海港货运 | 97098 | 蓝莓雨水（rw-）FE收集 |
| 高压灭菌 | Amsco | 3011 | 设备与培养基制备 |
| 塑料网垫 | Winco | BL-240 | 被动式（pass）FE样本采集 |
| 台式计时器 | Fisher Scientific | 06-662-47 | 设备，FE 制备 |
| 黑色压力/真空软管 | VWR | 62994-795 | 真空过滤组件 |
| 布氏漏斗 | 科尔斯美国 | 60240 | 真空过滤组件，可容纳55 mm滤纸圆片 |
| 本生灯 | - | - | 仪器设备 |
| 碳酸钙 | Fisher Scientific | C64-500 | 培养基组分 |
| 离心 | Sorvall | RC 5B Plus | 仪器设备 |
| 离心管（15 ml） | Fisher Scientific | 05-527-90 | 仪器设备 |
| 离心管（50 ml） | VWR | 10025-694 | 设备，rw-FE 收集 |
| 纱布（50号） | Fisher Scientific | AS240 | 设备，FE 制备 |
| 氯仿 | VWR | JT9175-3 | 化学试剂，三氯甲烷：分析纯 ≥ 99% 纯度，分子生物学用，无过氧化物 |
| 玉米粉琼脂（CMA） | Fisher Scientific | B11132 | 预混培养基，斜面保存分离菌种 |
| 棉蓝染色 | Sigma-Aldrich | 61335 | 乳酸酚棉蓝染色 |
| Difco 琼脂 | VWR | 90004-032 | 培养基组分 |
| 台式钻床 | Delta | - | 设备，rw-FE 收集 |
| EASYpure LF 超纯水 | Barnstead | D738 | 设备，去离子水来源 |
| 乙醇（95%） | - | - | 化学 |
| 500 ml 三角烧瓶 | Pyrex | 5340号 | 真空过滤组件 |
| 通风橱 | Hamilton | - | 设备，氯仿使用 |
| 漏斗（7 X 7 cm） | VWR | 60820-110 | 蔓越莓 rw-FE 收集，FE 制备 |
| 普通载玻片 | Fisher Scientific | 22-038-101 | 生物测定电导率 |
| 通用塑料喷雾瓶 | VWR | 16126-454 | pass-FE 收集管，容量至少 250 ml |
| 玻璃细胞培养管 | - | - | ch-FE的储存 |
| 玻璃盖玻片（22 × 22 mm） | Fisher Scientific | 12-542B | 生物测定电导率 |
| 玻璃范蒂赫姆细胞（手工切割的玻璃管） | - | - | 氯仿（ch）-FE 生物测定，（外径 8 mm，内径 6 mm） |
| 玻璃移液管（1-100 µl) | Hamilton公司 | #710 | ch-FE 生物测定 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | 乳酚棉蓝染色 |
| 血细胞计数板 | 亮线 | 5971R10 | 仪器设备 |
| 乳酸 | Sigma-Aldrich | W261106 | 乳酸酚棉蓝染色 |
| 层流罩 | Labconco | 3730400 | 设备，无菌工作环境 |
| 金属探针（通用） | - | - | 仪器设备 |
| 微型离心管（2 ml） | Fisher Scientific | 05-408-138 | 水相处理混合物的储存与制备 |
| 显微镜，Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | 仪器设备 |
| 研钵（陶瓷） | Coors USA | 60313 | 真空过滤组件 |
| 腈纶手套 | Fisher Scientific | 19-130-1597D | 花朵采集 |
| 纸片（裁剪的纸巾） | 办公基础 | KCC01510 | 生物测定中的湿度控制 |
| Parafilm | 贝米斯 | PM-996 | 塑料石蜡膜 |
| 研钵（陶瓷） | 科尔斯美国 | 60314 | 真空过滤组件 |
| 苯酚晶体 | Fisher Scientific | A92-100 | 乳酸酚棉蓝染色 |
| 塑料袋（约100 mm × 152 mm） | Uline | S1294 | 设备，花卉冷藏 |
| 塑料细胞培养皿（9 厘米直径） | Fisher Scientific | FB0875712 | （培养皿），生物测定电导率 |
| 聚四氟乙烯（PTFE）衬垫瓶盖 | VWR | 60927-228 | ch-FE的储存 |
| Pyrex烧杯（100 ml） | Pyrex | 1000号 | ch-FE的制备 |
| Pyrex 烤盘 | - | - | pass-FE 收集 |
| Pyrex量筒 | - | - | 设备，FE 制备 |
| 密封塑料容器（30 mm × 13 mm × 7 mm） | - | - | 生物测定电导率 |
| 尖头解剖剪 | Fisher Scientific | 8940 | 设备，用于切割纱布和纸片 |
| 不锈钢网筛 | VWR | 470149-756 | ch-FE的制备 |
| 阶梯钻头（阶梯钻） | 德沃特 | - | 设备，rw-FE 收集 |
| 无菌接种环（combi-loop） | Fisher Scientific | 22-363-602 | 培养物制备 |
| 电话线（内部导线） | - | - | 蓝莓rw-FE收集 |
| 试管架 | VWR | 470137-792 | 可替代塑料网眼[草莓]篮的易得材料 |
| V8 蔬菜汁 | Campbell's Soup Company | - | 真菌培养基成分 |
| 复古塑料网状（草莓）篮 | 捐赠 | - | pass-FE 收集器，可替代试管架（470137-792） |
| Vortex Genie（涡旋混合器） | Fisher Scientific | 12-812 | 孢子悬液制备 |
| Whatman No. 1 定性滤纸 55 mm 圆片 | Whatman | 1001-055 | 真空过滤组件 |
| 白色塑料扎带（100 mm） | Uline | S-566W | 蔓越莓 rw-FE 收集 |
参考文献
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