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方法文章

三维扫描技术通过新型三维嵌入重叠协议连接微电路与宏观脑成像

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DOI：

10.3791/58911

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2019年5月12日

 ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, Kyoto University, 2Graduate School of Informatics, Kyoto University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用3D扫描技术连接两个空间尺度的实验方案：通过MRI成像获取的全脑解剖结构的宏观空间尺度（>100 μm），以及利用免疫组织化学染色、多电极阵列系统及其他方法获得的神经元分布的微观空间尺度（约10 μm）。

摘要

人脑作为一个多尺度系统，既具有沿粗大的白质纤维束全局传播的宏观电信号，也具有沿轴突和树突传导的微观神经元放电活动。这两个尺度共同补充了人类认知与行为功能的不同方面。在宏观层面，磁共振成像（MRI）是目前标准的成像技术，其最小空间分辨率（即体素大小）为 0.1–1 mm3。而在微观层面，以往的生理学研究已注意到此类体素内部神经元结构的非均匀性。本研究开发了一种强有力的方法，通过将生物科学研究与三维扫描技术的最新进展相结合，精确地将微观数据嵌入到宏观图谱中。由于三维扫描技术迄今为止主要应用于工程与工业设计领域，本研究首次将其重新用于在保持活体脑细胞自然放电特性的同时，将微连接组嵌入全脑结构中。为实现这一目标，首先，我们建立了一套扫描方案，以从活体生物体中获取精确的三维图像——这类生物体因其湿润且反光的表面而固有地难以成像。其次，我们优化了扫描速度，以防止活体脑组织退化，这是维持组织良好状态并从脑组织中活跃神经元记录更自然神经放电的关键因素。分别来自两种不同成像模块（即 MRI 与三维扫描仪表面图像）独立提取的两个皮层表面图像，其距离误差的直方图众数仅为 50 μm。该精度在尺度上可与细胞间距离的微观分辨率相媲美，并且在不同个体小鼠之间具有良好的稳定性。这一新方案——三维新型嵌入重叠（3D-NEO）协议——通过该整合性流程弥合了宏观与微观尺度之间的鸿沟，加速了对全面连接结构（即微连接组）的科学研究进展。

引言

在各种物理和生物组织中，普遍存在非均匀的多尺度结构1,2。大脑也是一种高度非均匀且具有多尺度特征的网络结构3,4。多种认知功能编码于此类网络结构之中，并以亚毫秒级的时间分辨率记录神经元群体电脉冲模式的动态变化。历史上， Santiago Ramón y Cajal 超过150年前使用的染色技术首次对神经元之间的复杂网络进行了详细的结构观察5。为了观测活跃神经元的群体行为，研究人员已开发出多种记录技术6,7,8，近年来这些技术的重大进展使我们能够同时记录大量神经元的电活动。此外，基于这些功能活动，科学家已成功重建了大量神经元之间因果相互作用的网络，并将这些复杂相互作用的拓扑结构称为“微连接组（microconnectome）”9。从宏观层面观察大脑时，由于许多脑区通过多束纤维相互连接，整个大脑也可被视为一种网络结构。然而，在当前技术水平下，将微连接组嵌入到全脑图谱中仍存在明显局限，因此这种嵌入方案显得尤为重要。但该嵌入协议的建立仍面临诸多挑战。例如，若要观察完全隔离脑区中活体局部神经环路的活动，则需要制备脑切片以进行体外记录。此外，脑切片记录仍是体外研究的重要选择，至少出于两个原因：第一，目前仍难以以高时间分辨率（<1 ms）同时观测深度超过约1.5 mm脑区中大量活体单个神经元的活动；第二，当我们希望了解局部神经环路的内部结构时，必须阻断来自外部脑区的所有输入，以消除混杂因素。为了确定所制备脑切片的方向与位置，还需利用坐标系统整合这些脑切片的空间位置信息。然而，目前系统且可靠地有序制备脑切片的方法仍较为有限10,11。本文介绍了一种新的共配准协议，该协议采用3D扫描技术服务于神经科学研究，旨在提供一种整合性方案。该协议可协调微观与宏观尺度，将多电极阵列（MEA）的微观数据12,13以及染色数据，通过提取脑组织及无创记录脑组织的3D扫描表面，嵌入到宏观MRI空间中。令人惊讶的是，该方法在直方图中的模式值仅表现出约50 μm的距离误差。结果表明，在六只小鼠中，MRI表面与扫描所得3D表面之间最小距离的模式值均接近50 µm，这一数值在评估个体间共性时是合适的。典型的切片厚度约为300 µm，并记录到神经元的脉冲活动。

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方案

本文所描述的所有实验程序均已获得京都大学动物护理委员会的批准。

1. 动物（第1天）

  1. 准备雌性 C57BL/6J 小鼠（n = 6，年龄为 3−5 周）。
    注意：本方案适用于所有啮齿类动物物种。

2. MRI 设置（第1天）

  1. 将小鼠放入置于加热垫上的丙烯酸麻醉箱中，使用加热垫控制器将温度调节至 37 °C。
  2. 通过麻醉系统以 1.4 L/min 的气流速度向箱内输送含 2% 异氟烷的空气，对小鼠进行麻醉。该麻醉系统由异氟烷挥发罐、空气流量计和空气压缩机组成。
  3. 麻醉诱导后，将小鼠以俯卧位放置于磁共振成像（MRI）兼容的托架中。使用镊子夹捏小鼠脚趾，观察其是否无痛觉反应，以判断麻醉深度是否足够。
  4. 使用托架配备的门齿杆和面罩固定小鼠头部，并通过面罩以 1.4 L/min 的流速持续供给含 1%−1.5% 异氟烷的空气以维持麻醉状态。
  5. 将热敏电阻温度探头插入小鼠直肠，并在其背部放置压力敏感式呼吸传感器。
  6. 将托架移入磁共振成像（MRI）磁体孔内。调整异氟烷浓度至约 1%−1.5%，以确保麻醉深度稳定且可重复。在整个 MRI 实验过程中，使用专有软件的生理参数监测系统（材料表）监测小鼠体温是否维持在 33−35 °C 之间，呼吸频率是否保持在 0.5−1.3 Hz 范围内（材料表）。
  7. 根据测得的直肠温度，通过控制监测系统所配备加热装置向磁体孔内输送的暖空气温度，调节小鼠体温。

3. MRI 数据采集（第1天）

  1. 高分辨率3D T2加权MRI扫描的准备工作
    1. 获取三个正交平面（轴向、冠状和矢状）的磁共振（MR）图像，以检查小鼠的位置。
    2. 参考这些图像，通过移动托架调整小鼠的位置，使小鼠脑的中心位于共振器的中心，同时在轴向上也位于梯度线圈的中心。
    3. 调节MRI系统，包括调谐共振器、调整静态磁场均匀性（匀场）和基本频率，并校准射频（RF）功率。
    4. 获取冠状位和矢状位的低分辨率2D多层T2加权（T2W）图像。根据这些图像确定高分辨率3D T2W MRI扫描的视野范围（FOV）。
    5. 使用FASTMAP自动匀场算法进行局部匀场。在FASTMAP协议中，选择一个覆盖整个脑部的矩形区域。完成局部匀场后，通过点分辨波谱法（PRESS）获取局部1H波谱，确认脑区内的B0场不均匀性。
    6. 获取低分辨率3D T2W图像，以确认高分辨率3D T2W MRI的扫描设置是否合适，检查FOV位置是否恰当、是否存在卷褶（混叠）伪影以及脂肪信号是否得到有效抑制。
  2. 成像脉冲序列
    1. 完成上述准备工作后，采用快速采集弛豫增强（RARE）序列获取小鼠全脑的高分辨率3D T2加权图像。
      注意： 本文中的MRI实验是在一台7 T、210 mm水平孔径的临床前成像系统上进行的，该系统配备梯度强度为440 mT/m、上升时间为100 μs的梯度系统。射频激发和信号接收采用内径为35 mm的四通道容积共振器。MRI数据通过专用操作软件采集。本研究中所用3D RARE脉冲序列的采集参数总结于表1中。

4. 实验溶液的制备（第2天）

  1. 配制500 mL冰冻切割溶液（含2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、7 mM MgCl2、15 mM葡萄糖、25 mM NaHCO3、0.5 mM CaCl2、11.6 mM抗坏血酸钠、3.1 mM丙酮酸钠和100 mM氯化胆碱），用95% O2和5% CO2混合气体饱和。调节pH至7.3–7.4。
  2. 配制1 L人工脑脊液（ACSF；含127 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、1 mM MgCl2、15 mM葡萄糖、25 mM NaHCO3和2 mM CaCl2），用95% O2和5% CO2混合气体饱和。调节pH至7.3–7.4。

5. 仪器设备的准备（第2天）

  1. 准备一个6.6 cm2 方形，0.5 cm厚的磁铁“环”，先在环上贴黑色胶带，再贴外科胶带（图1c-2）。请注意，该材料称为脑组织块基质（BBB），需置于冰块上保持低温。
    注意： 随后，胶带将连同脑组织块一起固定在振动切片机的切片站上。方形环作为BBB的底部基座，具有两个作用：一是便于脑组织块从3D扫描站平稳转移至振动切片机，二是在扫描步骤中准确定量脑组织块的高度。
  2. 使用自动转台设置 BBB。打开扫描仪和转台。启动图像处理软件。
  3. 在进行所有实验之前，需对结构光投影式台式三维扫描仪所连接的相机和转台进行校准。
    1. 打开中央投影仪、两个摄像头和转盘，然后启动软件。在软件中点击 光学装置 选择图像区域为 100 x 80，网格数量为 100 x 100。随后，相机标定将按照以下四个步骤开始。
      1. 投影仪设置时，将校准表平放在桌面上，并将校准板放置在校准表上，使测量区域的固定点对准表的中心位置，方向朝前。调整投影仪与校准板之间的距离至约200 mm。松开固定两个旋钮的螺丝，旋转旋钮以调节两台相机的光敏度和焦距。然后，点击 箭头 进入下一步。
      2. 为调整相机方向，先松开固定两台相机的螺丝，移动相机的位置和旋转角度，使其与校准板上的中心线、垂直线以及投影仪投射出的黄色十字线重合。固定相机后，单击 箭头 再次重复。然后，屏幕将变暗。
      3. 松开旋钮的固定螺丝后，通过提高相机的感光度并重新调节焦距来对焦。然后，单击 箭头 进入下一步。
      4. 对于F值和（相机的）曝光程度，再次调整光敏感度，使其略低于红色区域消失时的水平。然后，单击 箭头 再次点击 校准开始，并选择 是 如果被问及 你完成光学设置了吗？
    2. 点击 初始化校准，并检查像素值是否已归一化至0–255之间。然后，单击 继续.
    3. 按照建议的位置，记录扫描仪与标定板之间九个不同相对角度的图像，在确认标定过程完成后，最后点击 校准更新.
    4. 将校准板更换为转台，然后单击 转盘校准.
      注意： 现在，所有校准均已完成。

6. 脑表面扫描、切片与多电极阵列记录（第2天）

  1. 用1%−1.5%异氟烷麻醉小鼠，随后将小鼠断头。使用手术刀切开皮肤，暴露颅骨。
  2. 用手术刀沿矢状缝切开麻醉后小鼠的头皮，再用手术剪从人字缝点向冠状缝前方一点呈对角方向剪开颅骨。然后用弯头镊子轻轻将颅骨从脑组织上剥离。
  3. 用刮铲抬起脑组织并转移至盛有冰冻切割液（按步骤4.1配制）的培养皿（100 mm × 20 mm）中。通过外部气瓶通入含95% O2 和5% CO2 的气体，调节泵的转速至约4.0 rpm，使冰冻切割液中产生细小气泡（图1a）。
  4. 1–2分钟后，将脑组织置于表面覆盖有筛面粉筛的超细纤维布上，轻轻用超细纤维布擦拭脑表面的液体（图1b）。
  5. 将脑组织背侧朝上放置在BBB的样品台上，并将BBB置于自动转台中央。
  6. 在3D扫描过程中关闭室内光源，于转台上进行3D扫描。为测试3D扫描是否正常工作，选择拍摄角度间隔为22.5°，起始角度为0°，终止角度为360°，点击3D扫描（图1c-1）。
  7. 将脑组织移至培养皿中，在切割液中鼓泡约10秒。
  8. 用手术刀在冠状面中线处将脑组织切成两部分，并用手术刮铲轻柔地将两块脑组织移至平整表面。
  9. 使用瞬干胶将脑组织块固定在BBB上，并在1–2分钟内再次用超细纤维布轻轻仔细擦拭脑表面液体。随后再次进行3D扫描（Figure 1c-2）。
  10. 将覆盖BBB中心的黑色胶带粘附至振动切片机切片台的中心位置（图1d）。
  11. 向切片台中加入切割液，并将切片台安装至振动切片机上。调节切片速度和振幅。从两块脑组织上各切出2–5片冠状切片（厚度为300 µm）。尽可能保持切片台内溶液持续鼓泡（图1e）。
  12. 将刀片安装至振动切片机的刀片夹持器上，并将系统参数优化为：切片速度12.7 mm/min，频率87–88 Hz，摆动幅度0.8–1.0 mm。当需要精细切片时，将速度降低至2–3级。
  13. 在切片过程中，以包含前后坐标、半球及其他条件的格式记录每一片脑切片的切片坐标（图2c）。
  14. 用粗塑料移液管将脑切片轻柔转移至盛有预热（约34 °C）人工脑脊液（ACSF）的烧杯中，并在约34 °C条件下孵育约1小时。在此期间，对切片台上剩余的脑组织块进行3D扫描（图1c-2）。
  15. 将MEA芯片安装至记录装置上。用两根导管将芯片连接至蠕动泵。其中一根导管用于将相同的ACSF导入MEA芯片，另一根导管用于将ACSF从MEA芯片导出。
  16. 将连接在两根导管末端的两根针头（0.60 mm × 19 mm）固定在MEA芯片壁的顶部，调整其位置，使针头末端沿MEA芯片内壁放置。将ACSF流速设定为4.1 rpm。
  17. 1小时后，用粗塑料移液管将一片脑切片移至芯片上，并用软毛刷调整其位置。随后开始记录神经元活动（图2-d）。

7. 免疫组织化学染色（第3天和第4天）

  1. MEA 记录完成后，将脑片转移至装有含磷酸盐缓冲液（PBS）的 4% 多聚甲醛（PFA）的 1.5 mL 离心管中。于 4 °C 下孵育过夜。随后弃去 4% PFA 溶液，用 PBS 洗涤脑片 3 次，每次 5 分钟，共 15 分钟。
    注意：如有需要，可将脑片包埋于 20% 明胶/PBS 中，并使用振动切片机重新切片，使其厚度小于 50 µm。
  2. 配制抗原修复液（10 mM 柠檬酸钠，pH 6.0）。弃去最后一次 PBS 洗涤液，加入抗原修复液。
  3. 在电热保温壶中将水煮沸，将装有脑片的离心管置于其中，在约 95–98 °C 下孵育 20 分钟，随后自然冷却。
  4. 配制 50 mM Tris 缓冲盐水，并加入 1% 亚硫酸钠（1% Na bisulfite-Tris 溶液），调节 pH 至 7.5。然后在室温（约 20–25 °C）下用 1% Na bisulfite-Tris 溶液洗涤脑片 5 分钟。
  5. 在 1% Na bisulfite-Tris 溶液中加入 4% 正常山羊血清和 0.5% 辛基酚聚氧乙烯醚，配制封闭液。
  6. 弃去含脑片的离心管中的 1% Na bisulfite-Tris 溶液，加入封闭液，在室温下孵育 2 小时。
  7. 在 1% Na bisulfite-Tris 溶液中加入 1% 正常山羊血清和 0.5% Triton X-100，并稀释一抗，配制一抗溶液。使用以下一抗稀释比例：小鼠抗 GAD67 抗体 1:800，兔抗 NeuN 抗体 1:500。
  8. 弃去含脑片的离心管中的 1% Na bisulfite-Tris 溶液，加入一抗溶液，于 4 °C 下孵育过夜。
  9. 配制 50 mM Tris 缓冲盐水，并加入 8.5 g/L NaCl（Tris-NaCl 溶液），调节 pH 至 7.5。然后用 Tris-NaCl 溶液在室温（约 20–25 °C）下洗涤脑片 3 次，每次 5 分钟，共 15 分钟。
  10. 在 Tris-NaCl 溶液中加入 3% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100，并稀释二抗，配制二抗溶液。使用以下二抗稀释比例：山羊抗小鼠抗体 1:500，山羊抗兔抗体 1:500。
  11. 弃去含脑片的离心管中的 Tris-NaCl 溶液，加入二抗溶液，在室温下孵育 2 小时。随后用 Tris-NaCl 溶液洗涤脑片 3 次，每次 5 分钟，共 15 分钟。
  12. 用小刷子将脑片置于载玻片上，滴加封片剂并加盖盖玻片。使用共聚焦显微镜观察切片，并采集脑片表面的图像（图 2e）。

8. 提取皮层体积的 MRI 数据处理

  1. 安装免费软件 FSL（https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation）。准备第 3 节中获取的 MRI 图像。
  2. 使用 fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ 命令更改图像格式。使用 fslcreatehd 命令将脑图像扩展至人类大脑大小，并在必要时使用 fslorient 命令并配合选项 -setqformcode 1 调整方向。之后，使用 fslchfiletype NIFTI_GZ 恢复原始文件格式。具体命令如下：
    fslchfiletype NFTI_PAIR [输入图像].nii.gz
    fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [输入图像].hdr.gz
    fslorient –setqformmcode 1 [输入图像].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI_GZ [输入图像]
  3. 输入 fsl 以启动 FSL 软件。通过图形用户界面（GUI）使用 bet 命令提取大脑图像，但切勿过度剥离。然后仔细调节 Fractional intensity thresholds, ... 和 Coordinates of centre of initial brain surface sphere 参数。最佳值因数据而异。
  4. 使用与步骤 8.2 相同的流程，将脑图像重新缩放至原始小鼠脑大小。具体命令如下：
    fslchfiletype NFTI_PAIR [输入图像].nii.gz
    fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 4 [输入图像].hdr.gz
    fslorient –setqformmcode 1 [输入图像].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI_GZ [输入图像]
  5. 使用 flirt 命令对所有脑图像进行配准，并利用 fslmaths 命令的 -add 选项和 -div 选项生成平均脑图像。
    fslmaths [脑图像 1] –add … –add [脑图像 N] –div N [平均图像名称] –odt float
  6. 使用 fslmaths 命令的 -thr 选项使平均脑图像更清晰。然后根据具体情况选择合适的阈值。
    fslmaths [平均图像名称] –thr [阈值，例如 5000] [经阈值处理的平均图像]
  7. 最后，再次使用 flirt 命令将平均脑图像重映射至个体坐标系中。然后，准备出较为干净的皮层提取结果（图 2a）。
    注意：由于 FSL 软件在剥离包括嗅球和小脑在内的所有脑区方面存在固有限制，因此从 MRI 体数据重建的脑表面中，嗅球和小脑部分将无法达到理想效果。

9. MRI 图像处理以提取皮层表面

  1. 下载另一款免费软件 3D Slicer（https://download.slicer.org/）。
  2. 使用 3D Slicer 中的 Volume Rendering 和 Editor 模块，打开根据第 8 节生成的提取脑组织的 MR 图像（点击 File，然后选择 Add data）。
  3. 将模式从 Editor 切换至 Volume rendering，然后点击目标按钮，使脑图像居中显示在屏幕中央。
  4. 选择 MR-T2-brain 模式，并通过移动 Shift 滑块调整阈值。随后，从 Volume rendering 返回至 Editor，并点击 Threshold effect 按钮。
  5. 应用标签 41. Cerebral cortex，并将脑表面数据保存为 .stl 文件。然后，将文件格式从 .vtk 转换为 .stl，并勾选表单后保存文件。

10. 三维扫描数据的预处理

  1. 通过点击“对齐”选项中的“全局配准”，对一次扫描序列中从8个或16个不同角度获取的8幅或16幅图像进行自动共配准，以校正图像间的微小错位，并将其整合。从不同角度重复扫描，以获得全脑表面图像图2b).
    1. 如果从不同角度扫描的图像未能成功整合，请点击 手动校准 并选择一对 固定图像 和一个 移动图像.
    2. 点击 开始 通过在不同图像中选择三个或四个共同点，开始手动对齐图像。然后，单击 好的优化算法为迭代最近点（ICP）算法10不包含非线性形变。
  2. 通过选择所有图像并点击，将所有已配准的图像（即点数据集）制作成一个网格 网格生成 按钮，然后选择该选项 小型艺术物件 以获得最高分辨率的网格。然后，将图像保存为二进制格式的 .stl 文件，或 ASCII 格式。

11. MRI 表面与 3D 扫描表面的共同配准

  1. 使用表面处理软件打开 MRI 表面，并将其与 3D 扫描表面进行合并。然后，采用与步骤 10.1.1 和 10.1.2 中所述相同的方法进行手动配准。随后，再次保存这些共配准的表面图像（图 2a,b）。
    1. 如有必要，对各个表面数据进行清理，例如，去除脑区周围的小噪声，特别是在处理 MRI 数据时；并填补存在的孔洞，尤其是在处理 3D 扫描数据时。
  2. 最后，使用数据分析软件（例如 MATLAB）打开表面数据，并计算和评估两个表面之间最小距离的直方图。

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结果

我们评估了通过剥离MRI体数据生成的皮层表面与从离体大脑3D扫描获得的表面之间的距离。距离直方图的众数值仅为55 μm（图3a）。此外，当从距离为零的点开始对直方图进行累积时，累积值在约300 μm处达到总样本数的90%（图3b）。两个表面间距离的最终直方图显示出一个典型的峰值，位于约50 μm附近。若从宏观角度解释该数值，有趣的是，该精度（众数值约50 μm）与MRI体素尺寸（即100 µm）所预期的几何极限相吻合（图3a）。这一点间接表明，MRI与3D扫描之间的重叠算法（ICP）工作效果极佳，且MRI与3D扫描的噪声水平均被有效抑制至较低水平（图2a,b）14。

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讨论

我们开发了一种名为3D-NEO的新方案，通过更精确地叠加两个脑表面，实现宏观与微观空间尺度之间的衔接。最初，在创建该方案时存在两个挑战，这些挑战曾阻碍对两个脑表面图像进行精确叠加以及从活体生物中记录健康的神经元活动。首先，在从颅骨中取出脑组织后，必须在不损伤脑组织的前提下，有效清除其周围残留的切片液（方案第6.2步）。其次，由于干燥和时间延迟这两个条件可能对活体组织产生不利影响，因此必须在10至15分钟内完成从脑组织提取到切片制备的全部扫描步骤，以维持神经元的活性。

利用本方案成功记录脑活动的能力，现已实现了不仅对结构组织，而且对全脑图谱上功能活动的协调。该方案的另一个优点是，由于已制备了血脑屏障（BBB），扫描仪与振动切片机基座之间的校准变得更加顺畅。

如代表性结果所述，两个表面之间距离的直方图显示峰值出现在约 50 μm 处。尽管我们进行了重叠处理，这看似是从宏观视角进行的；但如果从微观视角来解释该结果，50 μm 是神经元分布中具有可比性的空间尺度，因为皮层神经元对之间的连接概率在约 100 μm 范围内即显著衰减

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

M.S. 感谢京都大学研究生院医学研究科及医学部医疗信息工程课程全体教职人员的支持，并感谢高桑哲哉教授、泽本信克教授和多丽丝·扎基安（Doris Zakian）提出的有益意见。本研究得到了日本文部科学省（MEXT）“挑战性探索研究资助项目”以及“优秀青年研究人员领先计划”（LEADER）对 M.S. 的资助。本研究中的磁共振成像实验在日本京都大学研究生院医学研究科医学研究支援中心的小动物磁共振成像部门完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
空气压缩机Kimura MedicalKA-100磁共振成像动物准备
一体式荧光显微镜KEYENCEBZ-X710
麻醉箱Bio Research CenterRIC-01磁共振成像动物准备
麻醉系统ACOMA Medical IndustryNS-5000A磁共振成像动物准备
抗GAD67，克隆1G10.2Merk MilliporeMAB5406用于免疫染色
氯化钙nacalai tesque06729-55aCSF
氯化胆碱nacalai tesque08809-45aCSF
弯头钝头镊子
一次性手术刀Kai10
不含钙和镁的D-PBS(-)液体（10倍浓缩）nacalai tesque用于免疫染色
D(+)-葡萄糖Wako049-31165aCSF
明胶nacalai tesque16605-42重切片
山羊抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723用于免疫染色
山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 555InvitrogenA32732用于免疫染色
加热垫Bio Research CenterHM-10磁共振成像动物准备
加热垫控制器Bio Research CenterBWT-100A磁共振成像动物准备
加热系统SA InstrumentsMR-compatible Small Animal Heating System磁共振成像动物准备
异氟烷AbbVie磁共振成像动物准备
异氟烷蒸发器ACOMA Medical IndustryMKIIIai磁共振成像动物准备
线性切片机DOSAKANeo Linear Slicer MT
L(+)-抗坏血酸钠盐Wako196-01252aCSF
六水合氯化镁Wako135-00165aCSF
MaxOne 单孔微电极阵列MaxWell Biosystems
金属刮刀
监测系统SA InstrumentsModel 1025磁共振成像动物准备
监测软件SA InstrumentsPC-SAM V.5.12磁共振成像动物准备
磁共振兼容托架Bruker BioSpinT12812磁共振成像动物准备
磁共振线圈Bruker BioSpinT9988用于磁共振成像
磁共振操作软件Bruker BioSpinParaVision 5.1用于磁共振成像
Neo LinearSlicer MTD.S.K.NLS-MT
NeuN (D4G40) XP 兔单克隆抗体Cell Signaling24307用于免疫染色
正常山羊血清Wako143-06561用于免疫染色
氯化钾Wako163-03545aCSF
聚乙二醇单对异辛基苯基醚nacalai tesque12967-45用于免疫染色
压力敏感式呼吸传感器SA InstrumentsRS-301磁共振成像动物准备
临床前磁共振扫描仪Bruker BioSpinBioSpec 70/20 USR用于磁共振成像
丙酮酸钠盐nacalai tesque29806-54aCSF
SCAN in a BOXOpen Technologies srl
剪刀
筛瓶TIGERCROWN81用于3D扫描
SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenS36937用于免疫染色
氯化钠Wako191-01665aCSF
磷酸二氢钠Wako197-09705aCSF
碳酸氢钠Wako191-01305aCSF
亚硫酸氢钠nacalai tesque31220-15用于免疫染色
热敏电阻温度探头SA InstrumentsRTP-101-B, PLTPC-300磁共振成像动物准备
门齿固定杆Bruker BioSpinT10146磁共振成像动物准备
带翼静脉穿刺针TERUMOSV-23CLK用于灌注
1 mol/l Tris-HCl 缓冲液nacalai tesque35436-01用于免疫染色
1 mol/l 盐酸nacalai tesque37314-15用于溶液pH调节
16%甲醛水溶液Electron Microscopy Sciences15710用于免疫染色

参考文献

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