使用实时细胞外通量分析对Candida albicans进行生物能量学研究

摘要

在此，我们提供了一种逐步操作方案，用于研究线粒体呼吸和糖酵解功能 白色念珠菌 使用额外的通量分析仪。

摘要

线粒体是细胞代谢和存活所必需的细胞器。多种关键生命活动发生在线粒体内，例如细胞呼吸、氧化代谢、信号转导以及细胞凋亡。因此，已有研究报道线粒体功能障碍在致病性真菌对抗真菌药物的耐受性及毒力中发挥重要作用。近期的研究数据也进一步认识到线粒体在真菌致病过程中具有重要贡献。尽管线粒体在真菌生物学中具有重要意义，但目前仍缺乏系统化、标准化的研究其功能的方法。本文介绍一种用于检测白色念珠菌（C. albicans）菌株基础氧消耗率（OCR，反映线粒体呼吸功能）和细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解功能）的实验方法。本方法适用于所有念珠菌属（Candidaspp.）菌株，无需从完整真菌细胞中分离纯化线粒体。此外，该实验方案还可根据需要进行调整，用于筛选针对白色念珠菌（C. albicans）菌株线粒体功能的抑制剂。

引言

侵袭性真菌感染每年在全球造成超过150万人死亡。由于免疫力低下人群数量增加（包括老年人、早产儿、器官移植受者和癌症患者），这一数字正不断上升¹。C. albicans 是一种机会性人类致病真菌，属于人体正常微生物群的一部分，同时作为共生生物定植于黏膜表面和胃肠道。C. albicans 可在免疫缺陷、接受过手术或长期使用抗生素治疗的人群中引发严重的全身性疾病。Candida 属真菌是人类医院获得性感染（NID）最主要的三到四种病原体之一^2,3,4,5,6,7。全球每年估计发生约40万例Candida 血流感染，相关病死率高达46–75%¹。仅在美国，每年因念珠菌病导致的死亡人数约为1万人。真菌引起的医院感染还导致患者医疗费用急剧上升⁵。在美国，每年用于治疗侵袭性真菌感染的费用超过20亿美元，给本已超负荷的医疗系统带来巨大压力。目前，标准抗真菌治疗手段因药物毒性、日益普遍的耐药性以及药物间相互作用而受到限制。因此，迫切需要发现新的抗真菌药物靶点，以改善高危患者的治疗选择。然而，由于真菌属于真核生物，针对真菌靶点的新药研发面临挑战，这极大地限制了真菌特异性药物靶点的数量。

近期研究表明，线粒体在真菌致病性及对抗真菌药物的耐受性中发挥关键作用，因为线粒体对细胞呼吸、氧化代谢、信号转导和细胞凋亡至关重要^8,9,10,11。糖酵解和非糖酵解代谢对于C. albicans在哺乳动物宿主中的存活均至关重要^{12,13,14,15,16}。此外，已发现多个缺乏线粒体蛋白（如Goa1、Srr1、Gem1、Sam37等）的C. albicans突变株在菌丝形成方面存在缺陷，而菌丝形成是C. albicans的重要毒力因子^{17,18,19,20,21,22}。同时，这些突变株在播散性念珠菌病小鼠模型中也表现出毒力减弱^{17,18,19,20,21,22}。因此，真菌线粒体是药物研发的一个理想靶点。然而，对C. albicans中线粒体功能的研究具有挑战性，因为C. albicans为“petite negative”²³，即其无法在缺失线粒体基因组的情况下存活。

本文介绍了一种无需纯化线粒体即可研究白色念珠菌（C. albicans）线粒体和糖酵解功能的实验方案。该方法还可进一步优化，用于研究基因操作或化学调节剂对白色念珠菌（C. albicans）线粒体和糖酵解途径的影响。

方案

注意：以下详细描述了该检测的逐步操作流程，示意图见图1。

1. C. albicans 菌株及培养条件

1. 在30 °C条件下，于培养摇床中将C. albicans菌株 在液体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中过夜培养。
   注意：将念珠菌属（Candida）菌株以冷冻保藏形式保存，并在YPD琼脂培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和2%琼脂）上进行培养。

2. 试剂的制备

1. 按如下步骤配制检测培养基：
   1. 进行线粒体功能检测时，将1.04 g罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640粉末和2 g葡萄糖（2%）溶解于90 mL无菌水中，并将培养基预热至37 °C。用5 M NaOH调节pH至7.4，再用无菌水定容至100 mL。
   2. 进行糖酵解应激检测时，仅将1.04 g RPMI 1640粉末溶解于90 mL无菌水中，将培养基预热至37 °C，并调节pH至7.4，再用无菌水定容至100 mL。RPMI 1640粉末不含碳酸氢盐，这对于在检测过程中通过pH变化监测糖酵解水平至关重要。
2. 注射用化合物配制：
   1. 用无菌水配制1 M葡萄糖储备液，于-20 °C保存。
   2. 用二甲基亚砜（DMSO）配制100 mM寡霉素储备液，分装成小份，于-20 °C保存。
   3. 用DMSO配制100 mM抗霉素A储备液，分装成小份，于-20 °C保存。
   4. 在检测当天用乙醇配制100 mM SHAM（水杨羟肟酸）储备液。
   5. 在检测当天用无菌水配制1 M氰化钾（KCN）溶液。

3. 用聚-D-赖氨酸（PDL）包被检测板

注意：所有以下步骤均须在层流罩内进行。

1. 将多聚-L-赖氨酸溶于组织培养级水中，配制成终浓度为 50 µg/mL 的溶液。充分混匀后，分装至 1.5 mL 微量离心管中，长期保存请置于 -20 °C 保存。
   注意：每孔需要 50 µL，24 孔共需 1.2 mL。因此，建议每管分装至少 1.3 mL。
2. 每孔加入 50 µL，盖上盖子，在室温下孵育 1–2 小时。
3. 吸除溶液，并用 500 µL 无菌组织培养级水清洗一次。
4. 打开盖子，让各孔自然晾干。建议当天使用，或于 4 °C 最多保存 2–3 天。

4. 传感器盒的水合

注意：在实验前一天执行此步骤。

1. 打开额外的通量测定试剂盒并取出其中内容物。将传感器 cartridge 倒置放置在工具板旁边（图 2）。
2. 向工具板的每个孔中加入 1 mL 校准液，并将传感器 cartridge 放回。确保含有荧光染料的传感器（用于检测氧气和 pH）完全浸没在校准液中。
3. 将传感器 cartridge 在 37 °C、无 CO₂ 的培养箱中孵育过夜。

5. 在PDL包被的培养板中培养和接种细胞

1. 将白色念珠菌（C. albicans）接种于YPD液体培养基中，于30 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
   注意：根据实验设计和研究需求，白色念珠菌（C. albicans）也可在YPG或最低培养基中培养。
2. 在实验当天，用实验培养基将适量的菌液稀释，使最终浓度为每100 µL含100,000个细胞。
3. 除A1、B4、C3和D6孔外，向实验板的每个孔中加入100 µL稀释后的菌液；上述四个孔仅加入100 µL实验培养基，用于背景校正（图3）。
4. 将培养板置于37 °C、无CO₂的培养箱中孵育60分钟，以使细胞贴附于培养板表面。

6. 检测方案

注意：此处所述方案适用于仪器的24孔板格式。若使用其他规格，需调整体积。

1. 线粒体功能检测
   1. 化合物的配制
      1. 配制线粒体功能检测用10倍浓度的化合物：在相应的检测培养基中配制20 mM SHAM、100 µM 寡霉素（Oligomycin）、100 mM 氰化钾（KCN）和20 µM 抗霉素A（Antimycin A）。
      2. 将50 µL SHAM加入A孔，55 µL 寡霉素加入B孔，62 µL 氰化钾加入C孔，68 µL 抗霉素A加入D孔（图4）。
2. 糖酵解应激检测
   1. 化合物的配制
      1. 配制糖酵解应激检测用10倍浓度的化合物：在相应的检测培养基中配制100 mM 葡萄糖、100 µM 寡霉素、500 mM 2-脱氧葡萄糖（2DG）和20 µM 抗霉素A。
      2. 将50 µL 葡萄糖加入A孔，55 µL 寡霉素加入B孔，62 µL 2-DG加入C孔，68 µL 抗霉素A加入D孔。
3. 使用 Seahorse 细胞能量代谢分析仪（extra flux analyzer），该仪器可在24孔板体系中实时检测活细胞的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。提前设置好检测方案。
4. 打开 Seahorse 细胞能量代谢分析仪，通过检测向导选项卡（assay wizard tab）设置检测模板，并按照逐步提示填写设置过程中弹出的所有信息。生成的分组布局应与图5所示类似。按照表1设置检测程序。应在检测前充分提前设置好这些布局，并保存至计算机中。检测时，通过检测向导选项卡中的“打开文件”（open file）选项打开相应文件，恢复已保存的检测方案（图5）。
5. 将10倍浓度的化合物加入已水化并含有校准液的传感器微孔板的相应加样孔中，然后将微孔板放入 Seahorse 细胞能量代谢分析仪的承载托盘中。点击屏幕上的开始按钮启动校准程序。
6. 沿孔板孔壁轻轻加入350 µL 检测培养基，以尽量减少对细胞的扰动，使最终体积达到450 µL。
7. 将含有校准液的工具板替换为检测板，继续进行检测。
8. 检测完成后，取出传感器微孔板和细胞板。将数据文件保存至指定的目标文件夹中。

7. 数据分析

1. 在软件中使用曲线下面积-方差分析（AUC-ANOVA）分析标签页，通过选择相应参数（OCR 或 ECAR）来计算各组之间的显著性差异，如图6所示。
2. 选择需要比较的组别。
3. 将所选组别添加至方差分析（ANOVA）的分析组中，然后点击确定。
   注意：该 AUC ANOVA 分析将在文件中添加一个新的工作表，用于计算每组的 AUC 并通过 ANOVA 进行组间比较，结果将生成一个 p 值表格以显示显著性水平。

结果

本实验方案的重点是确定生物能量学功能 C. albicans 通过外源性通量分析仪评估。A C. albicans 缺失线粒体蛋白Mam33的突变株及其互补菌株也一并包括在内， mam33Δ/Δ::MAM33 研究线粒体蛋白缺失对氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）的影响。 MAM33 编码一种假定的线粒体酸性基质蛋白及其在 假丝酵母 尚不清楚。

胞外通量测定所需的细胞数量
在胞外通量测定中，我们每孔使用了 1×10⁵ C. albicans 野生型细胞，测得的耗氧率（OCR）为 145 pmol/min（图7），处于任何胞外通量测定最佳范围（100–300 pmol/min）之内。...

讨论

生物能量学额外通量检测是一种优秀的工具，可通过实时测量依赖氧化磷酸化（OXPHOS）的耗氧量来评估线粒体功能。此外，在实时分析中还可同时检测以细胞外酸化率（细胞外pH值变化）衡量的糖酵解功能。

在检测板中成功接种C. albicans是该实验的关键步骤之一，因为在经PDL包被的板中孵育细胞可使细胞黏附于检测板上。黏附的C. albicans细胞可通过光学显微镜进行观察。若细胞黏附不当，可能导致细胞漂浮于孔中，从而造成重复样本间读数不一致，影响实验结果。同样，进行细胞数量的滴定作为本实验的第一步也至关重要，以获得100–300 pmol/min范围内的耗氧率（OCR），此为最佳范围。此外，对化合物进行浓度滴定以确定其最佳浓度，对于获得最佳反应同样关键。每当基础培养基成分发生变化时，均应重新进行该步骤。

在哺乳动物细胞的胞外通量分析中，DMEM 是最常用的基礎培養基。然而，根據我們的實驗結果，RPMI 1640 培養基在與白色念珠菌（C. albicans）的實驗中表現出最佳效...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
抗霉素A	Sigma	A8674
KCN
线粒体应激检测试剂盒	Agilent	103015-100
寡霉素	Calbiochem	495455
pH计	Accumet	AR20
酚红	Sigma	P5530
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
鱼藤酮	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
氯化钠	Amresco	241
氢氧化钠颗粒	J.T Baker	3722
细胞培养级水	Gibco	1523-0147
XF检测校准液	Agilent	100840-000
酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基	Fisher scientific,	BP2469
酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂	Sigma	A1296
酵母提取物蛋白胨甘油培养基	Sigma	G2025