使用实时细胞外通量分析对Candida albicans进行生物能量学研究

摘要

在此，我们提供了一种逐步操作方案，用于研究线粒体呼吸和糖酵解功能 白色念珠菌 使用额外的通量分析仪。

摘要

线粒体是细胞代谢和存活所必需的细胞器。多种关键生命活动发生在线粒体内，例如细胞呼吸、氧化代谢、信号转导以及细胞凋亡。因此，已有研究报道线粒体功能障碍在致病性真菌对抗真菌药物的耐受性及毒力中发挥重要作用。近期的研究数据也进一步认识到线粒体在真菌致病过程中具有重要贡献。尽管线粒体在真菌生物学中具有重要意义，但目前仍缺乏系统化、标准化的研究其功能的方法。本文介绍一种用于检测白色念珠菌（C. albicans）菌株基础氧消耗率（OCR，反映线粒体呼吸功能）和细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解功能）的实验方法。本方法适用于所有念珠菌属（Candidaspp.）菌株，无需从完整真菌细胞中分离纯化线粒体。此外，该实验方案还可根据需要进行调整，用于筛选针对白色念珠菌（C. albicans）菌株线粒体功能的抑制剂。

引言

侵袭性真菌感染每年在全球造成超过150万人死亡。由于免疫力低下人群数量增加（包括老年人、早产儿、器官移植受者和癌症患者），这一数字正不断上升¹。C. albicans 是一种机会性人类致病真菌，属于人体正常微生物群的一部分，同时作为共生生物定植于黏膜表面和胃肠道。C. albicans 可在免疫缺陷、接受过手术或长期使用抗生素治疗的人群中引发严重的全身性疾病。Candida 属真菌是人类医院获得性感染（NID）最主要的三到四种病原体之一^2,3,4,5,6,7。全球每年估计发生约40万例Candida 血流感染，相关病死率高达46–75%¹。仅在美国，每年因念珠菌病导致的死亡人数约为1万人。真菌引起的医院感染还导致患者医疗费用急剧上升⁵。在美国，每年用于治疗侵袭性真菌感染的费用超过20亿美元，给本已超负荷的医疗系统带来巨大压力。目....

方案

注意：以下详细描述了该检测的逐步操作流程，示意图见图1。

1. C. albicans 菌株及培养条件

1. 在30 °C条件下，于培养摇床中将C. albicans菌株 在液体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中过夜培养。
   注意：将念珠菌属（Candida）菌株以冷冻保藏形式保存，并在YPD琼脂培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和2%琼脂）上进行培养。

2. 试剂的制备

1. 按如下步骤配制检测培养基：
   1. 进行线粒体功能检测时，将1.04 g罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640粉末和2 g葡萄糖（2%）溶解于90 mL无菌水中，并将培养基预热至37 °C。用5 M NaOH调节pH至7.4，再用无菌水定容至100 mL。
   2. 进行糖酵解应激检测时，仅将1.04 g RPMI 1640粉末溶解于90 mL无菌水中，将培养基预热至37 °C，并调节pH至7.4，再用无菌水定容至100 mL。RPMI 1640粉末不含碳酸氢盐，这对于在检测过程中通过pH变化监测糖酵解水平至关重要。
2. 注射用化合物配制：

结果

本实验方案的重点是测定生物能量学功能 C. albicans 通过外源性通量分析仪检测。A C. albicans 缺失线粒体蛋白Mam33的突变株及其互补菌株也被包括在内， mam33Δ/Δ::MAM33 研究线粒体蛋白缺失对氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）的影响。 MAM33 编码一种推测的线粒体酸性基质蛋白及其在 假丝酵母 尚不明确。

胞外流量测定所需的细胞数量
在胞外流量测定中，我们每孔使用了 1×10⁵ 个 C. albicans 野生型细胞，测得氧耗率（OCR）为 145 pmol/min（图 7），处于任何胞外流量测定最佳范围（100–300 pmol/min）之内。在测定前或不同实验间培养基成分发.......

讨论

生物能量学额外通量检测是一种优秀的工具，可通过实时测量依赖氧化磷酸化（OXPHOS）的耗氧量来评估线粒体功能。此外，在实时分析中还可同时检测以细胞外酸化率（细胞外pH值变化）衡量的糖酵解功能。

在检测板中成功接种C. albicans是该实验的关键步骤之一，因为在经PDL包被的板中孵育细胞可使细胞黏附于检测板上。黏附的C. albicans细胞可通过光学显微镜进行观察。若细胞黏附不当，可能导致细胞漂浮于孔中，从而造成重复样本间读数不一致，影响实验结果。同样，进行细胞数量的滴定作为本实验的第一步也至关重要，以获得100–300 pmol/min范围内的耗氧率（OCR），此为最佳范围。此外，对化合物进行浓度滴定以确定其最佳浓度，对于获得最佳反应同样关键。每当基础培养基成分发生变化时，均应重新进行该步骤。

在哺乳动物细胞的胞外通量分析中，DMEM 是最常用的基礎培養基。然而，根據我們的實驗結果，RPMI 1640 培養基在與白色念珠菌（C. albicans）的實驗中表現出最佳效.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
抗霉素A	Sigma	A8674
KCN
线粒体应激检测试剂盒	Agilent	103015-100
寡霉素	Calbiochem	495455
pH计	Accumet	AR20
酚红	Sigma	P5530
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
鱼藤酮	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
氯化钠	Amresco	241
氢氧化钠颗粒	J.T Baker	3722
细胞培养级水	Gibco	1523-0147
XF检测校准液	Agilent	100840-000
酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基	Fisher scientific,	BP2469
酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂	Sigma	A1296
酵母提取物蛋白胨甘油培养基	Sigma	G2025