在此，我们介绍一种用于进行便携式细胞气溶胶暴露并检测细胞反应的实验方案。该方法采用在气液界面培养的细胞，以模拟 体内 生理学。通过活性氧的产生和乳酸脱氢酶的释放，观察到细胞对铜纳米颗粒气溶胶的反应表现为氧化应激和细胞毒性。
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摘要
摘要
本方案介绍了一种新型可穿戴的体外暴露系统，包括其表征与性能评估。气液界面（ALI）体外暴露系统通常体积较大、笨重，难以运输至现场，也难以在排放源或呼吸带内进行操作。通过该系统的微型化，可将实验室功能带至现场，缩短样品处理时间，并提供一种更为合适的暴露方法，避免气溶胶在接触细胞前发生改变。便携式体外暴露盒（PIVEC）改造自37 mm滤膜盒，使其可在传统实验室环境之外进行体外毒性测试。本研究采用三种不同粒径的铜纳米颗粒对PIVEC进行表征，通过重量法和颗粒数浓度分析测定其沉积效率。初步细胞毒性实验通过暴露肺细胞，评估该系统在维持细胞活性的同时沉积颗粒物的能力。与现有的垂直气流体外暴露装置相比，PIVEC具有相似或更高的沉积效率。尽管样品通量较低，但其小巧的尺寸为当前的体外ALI暴露系统带来若干优势，包括可用于个人监测的可穿戴性、从实验室到排放源的移动能力，以及可同时部署多个系统以实现空间分辨，同时保持较低的用户成本。PIVEC是一种能够在现场及呼吸带内将气溶胶收集至气液界面体外模型上的系统。
引言
使用in vitro技术进行个体采样，可全面了解工作场所气溶胶的生物学效应。1 空气中污染物的暴露包括对化学物质本身的暴露，以及对采集的空气样本的暴露，暴露方式可为将气体引入细胞悬液中的淹没条件、使用摇床等装置进行间歇性暴露，或在气液界面（ALI）进行直接暴露。2 许多此类技术是在细胞悬浮培养或暴露前采集样本的条件下进行的，而这些步骤可能因气溶胶的潜在变化而影响毒理学研究结果。3 为避免这些变化，可将实验室搬至现场，采用文献中已报道的多种in vitro ALI培养暴露系统进行检测，4,5,6,7,8,9,10,11,12,
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方案
操作人员在执行步骤1、2、3、5和6时必须佩戴个人防护装备（如实验服、手套、护目镜）。
1. 材料准备
- 准备系统组装和暴露所需的材料，以确保实验的可重复性。
- 确保使用新的或经70%乙醇清洗过的内径为¼”导电管以及外径为¼”接头进行系统组装。
- 在实验开始前至少24小时，将包括滤膜、PIVEC组件、镊子和颗粒粉末在内的测试材料存放于温湿度受控的环境中。
注意：环境温度应接近室温，约为20 °C，相对湿度低于35%。这对实现实验间的可重复性至关重要。 - 使用异丙醇清洁颗粒计数器的部件，并根据制造商建议进行系统预热，包括用于测量的扫描迁移率粒径谱仪（SMPS）和光学粒径谱仪（OPS）。
2. 干气溶胶的制备
注意：操作人员应在通风橱内进行气溶胶生成。
- 组装干气溶胶生成系统
注意：颗粒在气体或液体中的悬浮状态应适合所模拟的应用及细胞培养条件。以下方法可使用基于液体的气溶胶进行。干气溶胶系统的设计源自 Tiwari 等.37 干式分散系统的示意图如图所示
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结果
职业的 体外 毒理学研究涉及在进行气溶胶暴露的同时维持细胞活性。PIVEC 系统如图所示。 图2，包括温度和湿度控制以及可穿戴的PIVEC装置。温度通过电池供电的电阻加热器维持，气溶胶则通过多孔湿润管增强自然加湿方式进行加湿。在实验室内的受控气溶胶环境中，PIVEC可按所示方式设置暴露实验 图1系统表征可用于确定沉积到细胞上的剂量，并进一步关联细胞反应。
沉积效率取决于添加到系统中颗粒物的尺寸，因为沉积力包括撞击、沉降和扩散。此外，沉积还受流速、暴露时间以及暴露系统特性的影响。基于这些信息，可以预测沉积情况。PIVEC的沉积效率已通过两种方法测定：重量分析法和颗粒计数法。使用基于滤膜的扫描迁移率粒径谱仪（SMPS）和光学粒径谱仪（OPS）测量数据，结合公式1和公式2，计算得到了表1中.......
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讨论
滤膜盒提供了一种简单且低成本的方法，用于采集呼吸区的气溶胶；然而，从滤膜上提取的气溶胶样品并不能代表完整的气溶胶成分（即气体、挥发性物质和颗粒物），从而限制了对相关生物学效应的评估。基于37 mm滤膜盒的初始设计，PIVEC旨在保持便携性，并模拟颗粒物吸入后的in vivo沉积过程。PIVEC显著小于当前的ALI暴露系统，体积约相当于一个纸巾盒，并内置温度和湿度控制功能。其尺寸与个人级联冲击器相似，但除此之外还可提供气溶胶暴露后细胞反应的数据。尽管PIVEC一次仅能容纳一个样品，与其他现有暴露系统相比容量较小，但其小巧的尺寸允许多个系统同时使用，从而增加样本量，并可实现空间分布的监测。
该实验方案中有多个关键步骤。为了确定沉积效率，必须按照步骤1所述正确地对滤膜进行预处理，这一点至关重要。此外，在暴露前准确称量铜纳米颗粒、在暴露后准确称量滤膜，对于确定基于质量的沉积效率也非常重要。数量沉积效率必须通过粒子计数器测得的气溶胶初始浓度与最终浓度之间的差值来确定。如果未能准确测定沉积效率，则很难判断不同类型气溶胶之间的生物学反应差异。可通过改变沉积条件对沉积过程进行调整.......
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披露
作者的所属单位如封面页所示。本研究在弗吉尼亚州里士满的弗吉尼亚联邦大学完成，作者获得该大学的经费支持。作者对本文的撰写和内容负有唯一责任。作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
作者感谢 Boris Solomonov 和弗吉尼亚联邦大学创新机械车间在设备快速原型制作方面的帮助。作者还感谢 Lewinski 课题组的 Cristian Romero-Fuentes、Vitaliy Avrutin 博士、Dmitry Pestov 博士以及弗吉尼亚联邦大学纳米材料核心表征设施在颗粒表征方面的支持。本研究得到了弗吉尼亚联邦大学工程学院为 Lewinski 博士提供的启动资金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 扫描迁移率粒径谱仪（SMPS） | TSI, Inc. | 3910 | NanoSMPS |
| 光学粒径谱仪（OPS） | TSI, Inc. | 3330 | |
| 不锈钢管，4" 长 | McMaster-Carr | 4830K116 | 标准壁厚 304/304L，两端带螺纹，1/8 管径 |
| 带杠杆手柄黄铜球阀 | McMaster-Carr | 4112T12 | 紧凑型高压等级，1/8 NPT 内螺纹 |
| 钢管，2" 长 | McMaster-Carr | 7753K121 | 标准壁厚，一端带螺纹，1/8 管径 |
| HEPA 滤膜 | GE Healthcare | 09-744-12 | HEPA-Cap 一次性空气过滤胶囊 |
| 真空发生器 | PISCO USA | VCH10-018C | |
| PIVEC | VCU | 如需设计请联系作者 | |
| 电阻加热器 | |||
| 1/4" 卡套式接头 | Zefon International, Inc. | 459743 | |
| 多孔管 | Scientific Commodities, Inc. | BB2062-1814A | 亲水性，孔径 10 µm |
| 移动电源 | |||
| 细胞培养小室 | Fisherbrand | 353095 | 24 孔板用插入式培养小室 |
| 滤膜镊子 | Fisherbrand | 09-753-50 | |
| 移液管 | ThermoScientific | 13-711-27 | |
| 玻璃纤维滤膜 | SKC | 225-7 | 无粘合剂型 AE 滤膜，37 mm，孔径 1.00 µm |
| 超微量天平 | A&D | BM-22 | 置于环境控制舱内 |
| 37 mm 滤膜夹具 | SKC | 225-3250 | 空白滤膜夹具，37 mm，透明苯乙烯材质 |
| 可变流量真空泵 | SKC | 220-5000TC | AirChek TOUCH，5 至 5000 mL/min |
| 铜颗粒 | U.S. Research Materials, Inc. | US1090 | 40 nm |
| 铜颗粒 | U.S. Research Materials, Inc. | US1088 | 100 nm |
| 铜颗粒 | U.S. Research Materials, Inc. | US1117M | 800 nm |
参考文献
- Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
- Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A.
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重印与许可
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