人正常记忆B细胞体外分化为长寿命浆细胞模型

摘要

利用多步骤培养系统，我们报道了一种体外B细胞向浆细胞分化的模型。

摘要

浆细胞（PCs）分泌大量抗体，由已活化的B细胞发育而来。浆细胞是稀有细胞，主要位于骨髓或黏膜组织中，负责介导体液免疫。由于其频率低且定位特殊，在人体中研究浆细胞具有较大难度。我们报道了一种从B细胞向浆细胞 利用特定细胞因子和活化分子的组合构建体外分化模型，可重现体内发生的连续性细胞分化过程。在此体外模型中，记忆B细胞（MBCs）将依次分化为前浆母细胞（prePBs）、浆母细胞（PBs）、早期浆细胞（early PCs），最终形成长寿浆细胞（long-lived PCs），其表型接近健康个体中的相应细胞. 我们还开发了一个开放获取的生物信息学工具，用于分析与浆细胞分化相关的基因表达谱（GEP）数据中最显著的信息。这些资源可用于研究人类B细胞向浆细胞的分化过程；在本研究中，我们探讨了人类B细胞向浆细胞分化过程中表观遗传因子的基因表达调控。

引言

B细胞向浆细胞（PCs）的分化对于体液免疫至关重要，可保护宿主免受感染¹。B细胞向浆细胞的分化伴随着转录能力和代谢的显著改变，以适应抗体的分泌。调控B细胞向浆细胞分化的转录因子已被广泛研究，并揭示了包括B细胞和浆细胞特异性转录因子（TFs）在内的独特调控网络²。在B细胞中，PAX5、BCL6和BACH2转录因子是维持B细胞身份的关键因子^2,3。诱导表达IRF4、编码BLIMP1的PRDM1以及浆细胞特异性转录因子XBP1，将抑制B细胞相关基因的表达，并启动协调一致的抗体分泌细胞转录程序^3,4,5。这些协调的转录变化伴随着免疫球蛋白基因的转录激活，以及免疫球蛋白重链从膜结合型向分泌型的转换^2,3,4。B细胞向浆细胞的分化还伴随着内质网和高尔基体功能相关基因的上调，同时激活未折叠蛋白反应（UPR），后者通过适应分泌型免疫球蛋白的合成而在浆细胞中发挥关键作用^6,7。转录因子XBP1在这一细胞适应过程中起着重要作用^8,9,10。

B细胞和浆细胞（PC）是体液免疫中的关键参与者。了解调控正常浆细胞生成与存活的生物学过程，对于需要确保有效免疫应答并预防自身免疫或免疫缺陷的治疗干预至关重要。浆细胞在体内属于稀有细胞，其早期分化阶段发生在解剖学上难以完全进行生物学表征的部位，尤其是在人体中。我们已报道了一种通过多步骤培养系统建立的体外B细胞向浆细胞分化的模型。该模型可重现体内不同器官中发生的连续性细胞分化与成熟过程^11,12,13. 第一步，记忆B细胞通过CD40配体、寡脱氧核苷酸及细胞因子组合刺激激活四天，分化为前浆母细胞（PrePBs）。第二步，通过去除CD40L和寡脱氧核苷酸的刺激，并更换细胞因子组合，诱导前浆母细胞进一步分化为浆母细胞（PBs）。第三步，再次更换细胞因子组合，诱导浆母细胞分化为早期浆细胞（early PCs）^11,12。第四步，通过将早期浆细胞培养于骨髓基质细胞条件培养基或特定生长因子中，获得完全成熟的浆细胞¹³。这些成熟浆细胞可在体外存活数月，并分泌大量免疫球蛋白（图1）。值得注意的是，我们的体外模型能够重现体内可检测到的B细胞向浆细胞各阶段分化过程中协调发生的转录变化及表型特征^{11,12,13,14,15}。由于浆细胞本身数量稀少，本体外分化模型为研究人类B细胞向浆细胞的分化过程提供了有效手段。

方案

该方案遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则以及蒙彼利埃大学生物资源中心的协议。

1. 体外正常浆细胞分化模型

注意：浆细胞通过四步培养法获得^11,12,13。

1. B 细胞扩增与分化
   1. 使用健康志愿者的外周血细胞进行记忆 B 细胞的纯化。
   2. 将 7.5 mL 血液用 24.5 mL RPMI 1640 培养基稀释。
   3. 在无菌的 50 mL 锥形管中加入 12.5 mL 室温密度梯度液（例如 Ficoll），然后将 32 mL 稀释后的血液轻轻叠加在密度梯度液上方，尽量减少两相之间的混合。
   4. 以 500 × g 离心 20 分钟，关闭刹车。收集稀释血浆与密度梯度液界面处的外周血单个核细胞（PBMCs），转移至无菌 50 mL 管中，并用 Hank's 平衡盐溶液补至 45 mL。
   5. 以 500 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，保留沉淀细胞。
   6. 加入 45 mL RPMI1640/10% 胎牛血清（FCS），以 500 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，保留沉淀细胞，再加入 30 mL PBS/2% FCS。
   7. 使用抗 CD2 磁珠去除 CD2+ 细胞。每 1 个靶细胞加入 4 个磁珠，4 °C 孵育 30 分钟。
      1. 利用磁铁分离装置将结合磁珠的细胞与未结合细胞分离，收集未结合细胞，并将细胞沉淀与抗 CD19 APC 和抗 CD27 PE 抗体在 4 °C 孵育 15 分钟（每 10⁶ 个细胞加入 2 µL 抗体）。
      2. 在 PBS/10% 小牛血清中洗涤两次。
      3. 在 FSC 和 SSC 图中去除杂质事件。通过 FSC-A 与 FSC-H、SSC-A 与 SSC-H 图绘制单细胞群，以去除碎片并选择总白细胞群体。在 CD19/CD27 图上选择记忆 B 细胞，即 CD19⁺CD27⁺ 细胞。
      4. 使用细胞分选仪纯化记忆 B 细胞（MBCs），纯度达到 95%。
   8. 所有培养步骤均使用 IMDM 培养基和 10% FCS，并添加 50 mg/mL 人转铁蛋白和 5 mg/mL 人胰岛素。
   9. 将纯化的 MBCs 接种于六孔培养板中（每孔 5 mL，细胞密度为 1.5 × 10⁵ MBCs/mL），在 IL-2（20 U/mL）、IL-10（50 ng/mL）和 IL-15（10 ng/mL）存在下培养 4 天。
      1. 加入硫代磷酸酯 CpG ODN 2006、带组氨酸标签的重组人可溶性 CD40 配体（sCD40L；50 ng/mL）以及抗多聚组氨酸单克隆抗体（5 mg/mL）以激活 MBCs（图 1）。仅使用 sCD40L 或 ODN 与相同细胞因子混合物激活，扩增效率较低¹²。此处描述的多种激活信号组合可获得最大数量的活化 B 细胞和前浆母细胞（PrePBs）^11,12（图 1）。
      2. 用于基因表达谱分析时，在第 4 天使用细胞分选仪纯化 CD38^-/CD20^- 的前浆母细胞（PrePBs）（图 2）。
2. 浆母细胞的生成
   1. 第 4 天计数细胞。
   2. 将细胞以每孔 2 mL、密度为 2.5 × 10⁵/mL 接种于 12 孔培养板中。
   3. 通过去除 CpG 寡核苷酸和 sCD40L，并更换为含新细胞因子混合物的新鲜培养基（包括 IL-2（20 U/mL）、IL-6（50 ng/mL）、IL-10（50 ng/mL）和 IL-15（10 ng/mL））诱导细胞分化（图 1）。在 37 °C 下继续培养 3 天（第 4 天至第 7 天）。
   4. 用于基因表达谱分析时，在第 7 天使用细胞分选仪纯化 CD38⁺/CD20^- 的浆细胞（PBs）（图 2）。
3. 早期浆细胞的生成
   1. 第 7 天计数细胞。
   2. 将细胞以每孔 2 mL、密度为 5 × 10⁵/mL 接种于 12 孔培养板中。
   3. 使用含 IL-6（50 ng/mL）、IL-15（10 ng/mL）和 IFN-α（500 U/mL）的新鲜培养基，在 37 °C 下培养 3 天，将浆母细胞（PB）分化为早期浆细胞（PCs）。用于基因表达谱分析时，在第 10 天使用细胞分选仪纯化 CD20^-/CD38⁺/CD138⁺ 的早期浆细胞（图 2）。
4. 长寿命浆细胞的生成
   1. 通过改变培养条件，将早期浆细胞分化为长寿命浆细胞。
   2. 将细胞接种于 12 孔培养板（每孔 2 mL，密度为 5 × 10⁵/mL）或 24 孔培养板（每孔 1 mL），在 37 °C 下使用含 IL-6、基质细胞条件培养基和 APRIL（200 ng/mL）的培养体系进行培养。
   3. 通过将基质细胞在培养基中培养 5 天获得基质细胞条件培养基，收集上清液经 0.2 µm 滤膜过滤后冷冻保存。
   4. 在浆细胞培养体系中加入 50% 的基质细胞条件培养基，并每周更换一次。所生成的长寿命浆细胞可维持数月¹³。已有报道表明，仅使用 IL-6 和 APRIL 即可实现浆细胞的长期存活¹³。
   5. 通过流式细胞分选获得的浆细胞检测免疫球蛋白（Ig）分泌情况。
   6. 将浆细胞以 10⁶ 个细胞/mL 的密度培养 24 小时，收集培养上清液。使用人源酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测 IgG 和 IgA 水平^11,12,13。第 10 天至第 60 天期间，每细胞每日 IgG 分泌中位数从 10 pg 提高至 17 pg¹³。

2. B 细胞向浆细胞分化的分子图谱

注意：我们开发了一个便捷且开放获取的生物信息学工具，用于提取和可视化与浆细胞分化相关的Affymetrix基因表达谱（GEP）数据中的最主要信息（GenomicScape）¹⁵。这些基因表达谱数据可从ArrayExpress数据库（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）公开获取，包括纯化的记忆B细胞（MBCs）、前浆细胞（PrePBs）、浆细胞（PBs）和早期浆细胞（EPCs）：E-MTAB-1771、E-MEXP-2360、E-MEXP-3034以及骨髓浆细胞（BMPC）E-MEXP-2360^14,15。Genomicscape是一个免费提供的网络工具。

1. 选择B细胞向浆细胞分化的数据集
   1. 在GenomicScape开放获取生物信息学工具（http://www.genomicscape.com）的浏览数据菜单中选择名为人类B细胞向浆细胞分化的数据集。在主页的分析工具中使用表达-共表达报告工具，可对单个基因或基因列表的基因表达谱进行可视化。
2. 有监督分析与主成分分析（PCA）
   1. 选择分析工具 | webSAM以加载SAM工具。
   2. 选择人类B细胞向浆细胞分化数据集，并选定待比较的样本组。
   3. 使用可用的不同筛选条件，应用感兴趣的筛选选项。
   4. 为利用SAM工具比较基因表达谱，需调整包括倍数变化、置换次数、错误发现率以及比较类型在内的筛选参数。GenomicScape将执行分析，并提供在选定组间差异表达的基因列表。
   5. 在分析工具菜单中选择主成分分析，以运行主成分分析。
   6. 选择人类B细胞向浆细胞分化数据集，并选定感兴趣的组别。
   7. 粘贴感兴趣的基因列表，或根据方差选择基因。若要粘贴基因列表，请点击如需分析基因/ncRNA列表，请点击此处…。GenomicScape将计算PCA结果，该结果可进行可视化和下载。

结果

体外正常浆细胞分化的整体流程如图1所示。通过本方案，我们能够生成足够数量的细胞，而这些细胞无法通过人源离体样本获得。尽管已有研究探讨了参与浆细胞分化过程的复杂转录因子网络的作用，但调控关键浆细胞分化转录网络的机制仍知之甚少。细胞分化主要由表观遗传学和转录水平的变化驱动。利用我们的体外模型以及B细胞至浆细胞的基因表达谱图谱（GEP atlas），我们研究了正常浆细胞分化过程中表观遗传因子的表达变化。

正常浆细胞分化过程中表观遗传因子的表达
我们将表观遗传因子定义为属于以下家族的因子：DNA甲基转移酶（DNMT）、甲基-CpG结合结构域（MBD）蛋白、组蛋白乙酰转移酶（HAT）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）、组蛋白甲基转移酶（HMT）和组蛋白去甲基化酶（HDM），该分类此前已在癌细胞研究中有所描述¹⁶ (

讨论

在人体中，浆细胞（PC）是稀有的细胞，其分化阶段发生在解剖位置上，这阻碍了对其进行全面的生物学表征。我们建立了一种体外B细胞向浆细胞分化的多步骤培养模型，通过依次添加不同组合的激活分子和细胞因子，以模拟体内不同器官或组织中发生的有序细胞分化过程^11,12,13。

其他高效的体外B细胞向浆细胞分化的模型已有报道^18,19由 Le Gallou 建立的模型 等人采用两步培养法，从CD19开始研究T细胞依赖的B细胞向浆细胞分化过程⁺/CD27^- 初始B细胞。Cocco 等人报道了一种从总B细胞体外生成长寿浆细胞的模型¹⁹我们的策略模拟了生发中心中的活化与分化过程...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD2磁珠	Invitrogen	11159D
抗CD138-APC	Beckman-Coulter	B49219
抗CD19-APC	BD	555415
抗CD20-PB	Beckman-Coulter	B49208
抗CD27-PE	BD	555441
抗CD38-PE	Beckman-Coulter	A07779
抗组氨酸抗体	R&D Systems	MAB050
CpG ODN(PT)	Sigma		T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
人转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T3309
IFN-α	Merck	Intron A
IMDM	Gibco	31980-022
重组人CD40L-hi	R&D Systems	2706-CL
重组人APRIL	R&D Systems	5860-AP-010
重组人IL-10	R&D Systems	217-IL-
重组人IL-15	Peprotech	200-15-10ug
重组人IL-2蛋白	R&D Systems	202-IL-
重组人IL-6	Peprotech	200-06