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方法文章

小鼠中宿主-病原体反应及疫苗效力的评估

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DOI:

10.3791/58930

2019年2月22日

本文内容

摘要

本文介绍了一种简洁的实验方案 体内 评估疫苗有效性和宿主免疫反应。该方案可适用于研究病毒、细菌或寄生虫病原体的疫苗模型。

摘要

疫苗是一种20th 世纪医学奇迹。它们显著降低了传染病导致的发病率和死亡率,并推动了全球预期寿命的显著增长。然而,确定疫苗的有效性仍是一项挑战。新兴证据表明,目前的无细胞疫苗(aPV)在预防某些感染方面存在局限性。 百日咳鲍特菌 (B. pertussis)会引发次优免疫反应。因此,一个主要挑战是设计下一代疫苗,以在不产生全细胞疫苗(wPV)不良副作用的前提下诱导保护性免疫。本文描述了一种我们用于评估一种有前景的新型佐剂有效性的方案,该佐剂可使免疫反应偏向具有保护性的Th1/Th17表型,并促进更有效地清除病原体 B. pertussis 来自小鼠呼吸道的攻毒挑战。本文描述了小鼠免疫接种、细菌接种、组织采集以及免疫应答分析的实验方案。利用该方法,在本研究模型中,我们成功阐明了一种有前景的下一代无细胞百日咳疫苗所诱导的关键免疫机制。该方法可应用于任何传染病模型,以评估疫苗的有效性。

引言

疫苗是20世纪公共卫生领域最伟大的成就之一,但我们仍未完全理解成功疫苗激发保护性免疫的分子机制。分子特征谱(例如细胞激活标志物、细胞亚群扩增以及疫苗接种后诱导的基因表达模式,为预测和产生有效的免疫应答提供了大量信息。宿主与病原体相互作用的复杂性无法通过现有模型充分复制 体外 细胞培养系统1. 体内 疫苗模型旨在同时评估宿主内多种免疫细胞类型,这在表征疫苗抗原的加工与呈递、不同细胞因子的分泌以及免疫细胞扩增时具有优势。本文所述方案提供了一种通过评估系统性和局部免疫应答以及定量目标组织中的病原体负荷来确定疫苗效力的详细方法。此处提供的示例用于测试针对某种病原体的实验性疫苗的效力 百日咳鲍特菌 (B. pertussis).

B. pertussis 是一种革兰氏阴性细菌,是呼吸道疾病百日咳(pertussis)的致病原2,3。与感染者(有症状或无症状)密切接触会导致病原传播、定植及发病。尽管全球疫苗接种覆盖率较高4,百日咳在世界许多国家仍被视为一种再度出现的疾病,并且是可预防的儿童死亡的主要原因之一5,

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方案

所有涉及活体动物的实验均依照美国俄亥俄州立大学动物照护与使用委员会(IACUC)批准的方案进行,并符合IACUC指南的要求。所有免疫和感染实验均使用C57BL/6小鼠。每组实验同时包含雄性和雌性小鼠,以符合美国国立卫生研究院(NIH)指南的要求。每组动物数量根据实验组间预期结果差异进行统计功效分析后确定。例如,在双样本t检验中,每组8只小鼠可在α = 0.05(双侧)时提供80%的统计功效,以检测出感兴趣结果的差异达到1.33个标准差(SDs)。

1. 小鼠免疫

  1. 在无菌生理缓冲液(如生理盐水或DPS)中配制疫苗主混合液。
    注意:混合液的总体积应比整个免疫组所需体积多出10%。疫苗组分的浓度详见步骤1.1.1和1.1.2。将物品置于冰上运送至动物房。
    1. 对于 B. pertussis 研究包括以下疫苗组:aPV 和 aPV + BcfA。此外,设置氢氧化铝佐剂对照组、单独疫苗抗原组(FHA 和 Prn)以及未免疫小鼠(naïve)作为对照组。
      注意:aPV 为 1/5th 一种经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的无细胞百日咳疫苗(aPV),其组分包括破伤风类毒素、减量白喉类毒素、百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)和百日咳粘附素(Prn),以上成分吸附于铝盐。目前,人用百日咳aPV的单次剂量为0.5 mL,因此,1/5th

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结果

本文所述模型展示了一种用于评估宿主-病原体相互作用过程中疫苗效力及免疫应答的方法。图1展示了用于小鼠免疫、感染及组织采集分析的代表性疫苗接种方案。图2展示了所采用的麻醉系统的设置,该系统用于对小鼠进行麻醉,以便研究人员实施免疫接种和细菌接种。图3展示了为制备用于小鼠接种的100倍稀释细菌接种物而进行的OD600测量与计算示例,以获得1 OD的细菌悬液。图4展示了用于感染的接种物制备过程、系列稀释的涂布方案,以及基于系列稀释涂布结果对递送至小鼠的菌落形成单位(CFU)进行计数的示例计算方法。图5展示了疫苗抗原FHA刺激7天后诱导的抗原特异性回忆应答。联合疫苗组(Alum/FHA/BcfA)免疫的小鼠脾细胞产生IFNγ和IL-17,同时显著下调IL-5的表达。.......

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讨论

本文所述用于研究疫苗诱导的针对B. pertussis感染免疫反应的综合方案,也可用于评估宿主对多种其他病原体的免疫应答。该方案介绍了疫苗接种的实施方法、病原体攻击后疫苗效力的测定方法,以及免疫功能的平行分析方法。在将该方案调整用于研究其他病原体时,需修改若干参数,包括但不限于动物麻醉方式、疫苗成分、剂量和接种途径。此外,所研究病原体的攻击剂量与接种途径、选定的组织采集部位,以及免疫应答的后续检测方法,也均可根据特定病原体或疾病的研究需求进行调整。

B. pertussis 感染的小鼠模型被广泛使用,是研究百日咳杆菌致病机制和疫苗学的优秀模型16,17,18,19,20。小鼠模型在许多方面与人类感染具有相似性,包括:i)细菌.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由1R01AI125560-01及俄亥俄州立大学的启动资金资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2L 诱导室Vet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017任何品牌均可
Bordet Gengou 琼脂基础BD bioscience248200
酪蛋白SigmaC-7078
酪蛋白氨基酸VWRJ851-500GStrainer Scholte (SS) 培养基组分
L-谷氨酸Research Products IntG36020-500
L-脯氨酸Research Products IntP50200-500
氯化钠FisherBP358-10
磷酸二氢钾FisherBP362-1
氯化钾FisherP217-500
六水合氯化镁FisherM2670-500G
氯化钙FisherC75-500
Tris 碱FisherBP153-1
L-半胱氨酸盐酸盐FisherBP376-100SS 培养基补充剂
七水合硫酸亚铁SigmaF-7002
烟酸Research Products IntN20080-100
谷胱甘肽Research Products IntG22010-25
抗坏血酸Research Products IntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL 美国来源,非热灭活
庆大霉素ThermoFisher Scientific15710064
β-巯基乙醇Fisher BP176-100
15mL Dounce 组织研磨器Wheaton357544任何类似品牌均可
无线手持匀浆器Kontes/Sigma Z359971-1EA任何类似品牌均可
器械——剪刀、弯头剪、镊子、精细镊子、三角涂布棒任何品牌均可
3mL 注射器BD bioscience309657
15mL 锥形管Fisher 339651
1.5mL 微量离心管DenvilleC2170
70μm 细胞筛Fisher 22363548
60mm 培养皿ThermoFisher Scientific130181
48 孔组织培养板ThermoFisher Scientific08-772-1C
1mL 胰岛素注射器 28G 1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
小鼠 IFN-γ ELISA Ready-SET-Go! 试剂盒Invitrogen / eBioscience50-173-21
小鼠 IL-17 ELISA Ready-SET-Go! 试剂盒Invitrogen / eBioscience50-173-77
小鼠 IL-5 ELISA Ready-SET-Go! 试剂盒Invitrogen / eBioscience50-172-09

参考文献

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J.

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重印与许可

标签

宿主-病原体反应小鼠免疫细菌接种组织采集菌落形成单位计数流式细胞术酶联免疫斑点分析Bordetella pertussisTh1 Th17 极化