方法文章

非人灵长类造血干细胞与祖细胞的制备及基因修饰

DOI：

10.3791/58933

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2019年2月15日

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1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

本文内容

摘要

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本方案的目的是从预处理的非人灵长类动物骨髓中分离CD34+细胞，利用慢病毒载体对这些细胞进行基因修饰，并制备可用于回输至自体宿主的产品。整个方案耗时约48小时。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

造血干细胞和祖细胞（HSPC）移植作为治疗白血病和其他癌症的核心疗法已有近半个世纪的历史，是目前唯一已知可治愈人类免疫缺陷病毒（HIV-1）感染的方法，并在β地中海贫血等遗传性疾病的治疗中展现出巨大前景。我们团队已建立了一种在非人灵长类动物（NHP）中模拟HSPC基因治疗的实验方案，使科研人员能够优化与临床应用相同的一系列试剂和技术。本文描述了从预处理后的骨髓（BM）中纯化CD34+ HSPC以及长期存在的造血干细胞（HSC）亚群的方法。相同的技术也可用于其他HSPC来源（例如，动员后的外周血干细胞[PBSCs]）的纯化。本方案为为期两天的流程，包括细胞纯化、体外培养、慢病毒（LV）修饰，以及为回输至自体宿主做准备。评估成功的关键指标包括CD34+ HSPC群体的纯度、纯化后HSPC在半固体培养基中形成形态学上可区分的集落的能力，以及最重要的——基因修饰效率。HSPC基因治疗的关键优势在于其能够提供可长期存活的细胞来源，并分化为所有类型的造血细胞。因此，这些方法已被用于模拟癌症、遗传性疾病和感染性疾病的治疗策略。在各类疾病模型中，均通过增强特定HSPC子代细胞（包括红细胞、T细胞、B细胞和/或髓系亚群）的功能来确立治疗效果。HSPC产品的分离、修饰和制备方法可直接应用于人类患者的多种疾病治疗，具有高度的可转化性。

引言

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干细胞基因治疗是应对多种人类病理状况的有力手段。造血干细胞和祖细胞（HSPC）基因治疗是一种特别有吸引力的方法，原因包括：i）从患者体内收集这些细胞相对容易；ii）目前已有大量关于细胞表面表型和体外培养参数的知识积累；并且随着该领域的发展，iii）科学家可获得的、针对不同目标疾病定制的基因修饰策略工具箱也在不断扩大。我们正在从多个角度积极研究HSPC基因治疗，包括HSPC生物学的基础科学、基因修饰HSPC在临床前体内模型中的植入效果，以及在相关患者人群中的应用。我们及其他研究团队已对功能上不同的HSPC亚群的细胞表面表型1,2,3、可最大化HSPC产量和植入效率同时最小化毒性的动员与预处理方案4,5，以及针对多种恶性肿瘤、遗传性疾病和感染性疾病的基因修饰与基因编辑策略6,7,8,9,10进行了系统表征。基因修饰HSPC的功能和植入能力可在多种小型和大型动物模型中进行评估，包括小鼠、犬类和非人灵长类动物（NHP）。特别是，NHP模型具有优势，因为许多试剂（例如，针对CD34和CD90等HSPC细胞表面蛋白的特异性抗体）可在人和NHP细胞中互换使用。此外，与小鼠相比，大型动物如NHP能更准确地模拟实现临床疗效所需的基因修饰规模。最后，NHP是模拟人类疾病（如HIV-1感染11）的金标准模型，也是候选抗癌和抗HIV免疫疗法的新兴模型系统12,13。

本方案旨在概述纯化、基因修饰及制备非人灵长类动物造血干细胞和祖细胞（HSPC）输注产品的相关方法。尽管本方案未涵盖以下内容，但我们先前的研究已证明，这些产品可在自体非人灵长类动物宿主体内成功植入，生成所有造血谱系，并在多种疾病模型中表现出治疗效果1。我们还对植入的HSPC的克隆性进行了表征，并建立了平台，用于追踪自体移植后单个HSPC及其子代细胞的动力学、迁移路径和表型特征1,14。本文所介绍的方法基于以下目标开发：i）分离高纯度的HSPC以及具有长期植入能力的造血干细胞（HSC）亚群；ii）在体外培养过程中维持原始HSC的未分化状态；iii）高效地对整体HSPC群体或具有长期植入能力的HSC亚群进行基因修饰。我们采用磁珠辅助细胞分选（MACS）以及荧光激活细胞分选（FACS）技术，分离具有不同表型/功能特征的HSPC群体，该策略与多个研究团队所采用的方法一致2,15,16。在体外培养中维持原始HSC的状态（即最大限度减少这些细胞向产生成熟淋巴系和髓系细胞的定向前体细胞分化）是本方案的关键环节。尽管我们此前已报道过在保持原始表型的同时扩增HSPC的方法17,18，但本文描述的方案侧重于通过极短（48小时）且明确的体外培养条件来维持HSC特性。

高效修饰HSPC及其HSC亚群是本方案的核心目标。在我们已报道的多种方法中，目前在临床试验中研究最为广泛的有两种：慢病毒载体（LV）介导的基因修饰和核酸酶介导的基因编辑1,6,19。 基因编辑策略利用多种核酸酶平台之一，特异性地修饰目标基因，例如，靶向C-C趋化因子受体5型（CCR5）用于治疗HIV感染7,19，或靶向Bcl11A用于治疗血红蛋白病6。本文重点介绍LV介导的基因修饰，该方法中转基因载荷以半随机方式整合入基因组1,8,20。LV方法的一个关键优势在于其能够递送大量遗传物质（最多可达8至9 kb）。尽管当前正在开发基于同源供体重组（HDR）的基因编辑策略，以实现将目标转基因特异性地整合至指定基因座，但这些方法仍需在体外及小型动物模型中进一步优化。相比之下，慢病毒载体已在非人灵长类动物（NHP）和患者中得到广泛应用21,22。重要的是，本文所述方案以预激活的骨髓作为起始的HSPC来源，该方法可便捷且广泛地进行调整，例如用于分离外周血干细胞（PBSCs）。如上所述，我们充分利用了非人灵长类动物与人类之间高度的遗传相似性，从而使用适用于两个物种的实验试剂。最后，该方法也已被拓展用于修饰其他造血细胞亚群，特别是T细胞12,23,24；高效T细胞免疫治疗策略的发展在很大程度上依赖于本方案中所采用的相同LV平台。这些方法适用于所有对HSPC生物学或LV介导的基因修饰感兴趣的研究人员。例如，本文所展示的HSPC纯化方案可用于表征新发现的富集HSC的细胞亚群，如先前研究所述1,15,25。同样，本文所介绍的LV转导方法也可进一步拓展并应用于多种其他细胞类型及实验问题，无论是在体外还是体内模型中。

综上所述，我们介绍了分离和遗传修饰非人灵长类动物造血干细胞和祖细胞（HSPC）的方法。这些方法可轻松适用于其他物种及其他来源的HSPC。该经过充分验证的实验方案在模拟多种人类疾病的有效疗法方面展现出巨大前景。

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方案

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自体NHP移植、预处理（动员）、细胞采集和基因修饰均按照先前发表的方案进行26。所有实验操作均经Fred Hutchinson癌症研究中心和华盛顿大学的机构动物照护与使用委员会审查并批准（方案编号 #3235-01）。所有研究均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》（“指南”）中的建议执行；动物被随机分配至各研究组。

1. CD34+ 造血干细胞和祖细胞的富集及过夜培养（第 -1 天）

  1. 采集骨髓并进行预处理。
    1. 使用粒细胞集落刺激因子（GCSF）对非人灵长类动物（NHP）进行4天动员，方法如先前所述26。
    2. 使用100 mg/kg的氯胺酮和0.03 mL/kg的右美托咪定（0.5 mg/mL储备液）对动物进行镇静。在采样时给予镇痛药（例如缓释型布托啡诺SR）。
    3. 使用电推剪剃除动物肱骨近端和/或股骨部位的毛发，并用碘伏类消毒液或类似的抗菌溶液擦拭皮肤，交替使用酒精，重复3次。作为额外麻醉措施，在骨膜处注射布比卡因（每部位2 mg，5 mg/mL储备液）。
    4. 将骨髓穿刺针（16 G）置于骨膜穿刺点（髓腔）上方，刺穿皮肤，通过旋转动作进入髓腔。取出穿刺针内的针芯，并将其保留在无菌区域以备后续使用。
      注意：选择骨膜穿刺点时应位于肌肉覆盖较少、骨形或骨面轮廓在皮肤下可见或易于触诊的区域（通常靠近骨的近端或远端）。
    5. 将预装有抗凝剂枸橼酸右旋糖酐溶液（ACD-A）和肝素（20 USP/mL，每9 mL骨髓采集量加入1 mL）混合液的注射器连接至骨髓穿刺针。
    6. 缓慢回拉注射器活塞，同时轻轻摇动并旋转肢体，以搅动注射器内容物，使抽吸物与抗凝剂充分混合。在整个抽吸和回撤过程中旋转并调整针头位置，以获取骨髓腔内更大比例的细胞。
    7. 样本采集完成后，拔出穿刺针并对穿刺部位施加压力直至出血停止。
      注意：根据所需体积，可在单次采集过程中从一至四个肢体（两个肱骨、两个股骨）获取骨髓。每个肢体采集量不应超过20 mL，总采集量不应超过动物体重的10%（即10 mL/kg）。
    8. 若从多个肢体获取抽吸物，应将其合并并记录总体积。
    9. 让NHP在麻醉后恢复。
      1. 操作结束后，使用0.03 mL/kg的阿替美唑（5 mg/mL储备液）逆转右美托咪定的作用。根据临床兽医人员的处方，在术后至少48小时内给予镇痛药（例如缓释型布托啡诺SR），必要时可延长用药时间，具体由临床兽医根据临床表现决定。
      2. 术后将动物放回其原饲养笼，并每15–20分钟监测一次，直至动物能够自主坐起。由兽医人员每日监测，直至确认穿刺部位已完全愈合。此外，需持续观察是否存在炎症、感染或疼痛等迹象。
    10. 在细胞处理的同时，对同一只NHP进行清髓性全身照射（TBI）预处理：总剂量1,020 cGy，照射速率为7 cGy/min，在细胞输注前2天内分次给予。
  2. 裂解骨髓细胞。
    1. 将骨髓样本分装至50 mL锥形管中（每管10–12 mL），加入溶血缓冲液使总体积达到50 mL（表1）。室温（RT）孵育，直至细胞完全裂解，但不超过7分钟。以800 × g离心5分钟，吸除上清液，每管保留2–5 mL液体。将沉淀重悬于残留液体中。
      注意：成功裂解的样本颜色会由深红色变为透明浅红色。
    2. 向每份沉淀中加入10–15 mL溶血缓冲液。使用70 µm细胞筛去除任何血凝块。再加入溶血缓冲液至总体积50 mL，室温孵育5分钟，然后以800 × g离心5分钟。
    3. 吸除上清液，将细胞重悬于10 mL MACS缓冲液中（表1）。再次通过70 µm细胞筛过滤。用40 mL MACS缓冲液冲洗管壁和滤器，最终体积补至50 mL。
  3. 采用标准方案从裂解后的白细胞（WBCs）中富集CD34+细胞。
    1. 以800 × g离心15分钟。检查各管，确保顶部或中部无细胞涡旋现象。若沉淀上方仍有细胞，需以更高转速（最高可达1,000 × g）再次离心，时间最长10分钟。
    2. 吸除上清液，将细胞重悬于10 mL或更少的MACS缓冲液中，并准确记录体积。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪，按1:100或1:1,000稀释比例进行细胞计数。
      注意：此总WBC计数为富集前计数。
    3. 加入MACS缓冲液，调节细胞浓度至1 × 108 cells/mL。如有必要（例如富集前计数偏低），可重复步骤1.3.1–1.3.2。保留5 × 106个细胞于MACS缓冲液中，用于造血干细胞亚群染色（富集前样本）。
    4. 向剩余的富集前细胞中加入未标记的抗CD34抗体（克隆号12.8，材料表）27，终浓度为40 µg/mL（对应细胞浓度为1 × 108 cells/mL）。将细胞悬液置于4 °C下，在试管旋转仪上（见材料表）孵育25–30分钟。
    5. 用MACS缓冲液补至50 mL，以800 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于50 mL MACS缓冲液中，再次以800 × g离心5分钟。
    6. 使用两个滤管对100 mL MACS缓冲液进行脱气处理，进气口用蜡纸包裹，处理25–30分钟或直至使用前备用。
    7. 计算所需磁珠体积：每109个细胞使用1 mL磁珠。加入磁珠后，将细胞重悬至108 cells/mL。例如：3 × 109个细胞 + 3 mL磁珠 + 27 mL MACS缓冲液，总体积为30 mL。
    8. 将细胞悬液置于4 °C下，在试管旋转仪上孵育25–30分钟。
    9. 准备用于分离柱的磁铁；计划每根柱子处理0.6 × 109个细胞。将分离柱置于磁铁上，并在每根柱子下方放置一个50 mL锥形管以收集流穿液。为每根柱子准备一个15 mL锥形管和推杆，用于洗脱（步骤
    10. 当步骤1.3.8的孵育完成后，加入MACS缓冲液至50 mL，以800 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于脱气后的MACS缓冲液中（每根柱子2 mL）。轻柔吹打，避免引入气泡。
    11. 在不使柱子干涸的前提下，向每根柱子先加入1 mL脱气MACS缓冲液，再加入2 mL细胞悬液。用脱气MACS缓冲液冲洗滤器和原试管，并将冲洗液等量分配至各柱子（每柱6 mL）；最后加入7 mL脱气MACS缓冲液进行最终洗涤。
    12. 轻轻将柱子从磁铁上取下（向后推动顶部），将最后一滴液体收集至流穿管中。向每根柱子加入5 mL脱气MACS缓冲液，并使用推杆将细胞洗脱至步骤1.3.9中的无菌锥形管中。一旦出现气泡，即停止收集液体。
  4. 以1:10的稀释比例对富集组和流穿组（FT）收集管中的细胞进行计数。将细胞置于冰上保存。分别从CD34富集组中取1 × 106个细胞，从FT组中取5 × 106个细胞，用于流式细胞术分析。将FT组样本在4 °C保存，直至完成质量控制（步骤2）。
    注意：NHP中实现多谱系植入所需的CD34+细胞数量取决于HSC富集亚群CD34+CD90+CD45RA-的比例。基于该亚群平均频率为3%–5%，且每公斤体重至少需要122,000个CD34+CD90+CD45RA-细胞1，建议每公斤体重至少使用2.5 × 106、最多可达10 × 106个CD34+细胞。
  5. 向CD34+富集组中加入MACS缓冲液，总体积补至50 mL，以800 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞重悬于HSPC培养基中（表1），终浓度为106 cells/mL。
    1. 以106 cells/mL的密度将细胞接种于透气型组织培养（TC）处理的T-75培养瓶中，每瓶10–20 mL，在37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。培养瓶应平放（不可直立）。
      注意：如需要，可将额外的CD34+细胞或CD34-流穿组以1 × 106至5 × 106 cells/mL的浓度，悬浮于90%热灭活胎牛血清（FBS）+ 10%二甲基亚砜（DMSO）中进行冷冻保存，随后在-80 °C缓慢降温（例如使用程序冻存盒）。冻存细胞的平均回收率取决于CD34+纯度，通常在50%至80%之间，细胞活性>80%。

2. CD34富集细胞的质量控制（第-1天）

  1. 准备流式细胞术样品。
    1. 将上述各分离阶段（预富集、FT 和 CD34 富集组分）保留的样品用 FACS 缓冲液重悬，浓度为 10 × 10⁶ 细胞/mL6 细胞/mL，并将每种细胞悬液的100 µL转移至表1) 加入流式管中。
      注意： 对照样本应包括来自每个分离阶段的未染色细胞（例如，5 x 105 细胞）用于调整前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）以及每个荧光通道的自发荧光。此外，每种荧光染料偶联抗体均需使用单独染色的补偿微珠，以调整相邻通道之间的补偿表2 和 表3).
    2. 加入适量抗体（例如抗-CD45、抗-CD34、抗-CD45RA 和抗-CD90），根据生产商说明书推荐用量，用于一次检测（1 × 106 细胞（100 µL）（表3）。在 4 °C 下孵育 20 分钟。加入 3 mL FACS 缓冲液，以 800 x g 孵育5分钟，吸除上清液，加入100 µL FACS缓冲液重悬细胞，然后在适当的流式细胞仪上进行分析（步骤2.2）。
  2. 准备流式细胞仪/细胞分选仪以进行分析。
    注意：     建议在步骤2.3中用于细胞分选的同一台仪器上进行分析。
    1. 生成包含FSC/SSC、CD45/CD34和CD45RA/CD90（三个流式图）的实验方案。右键单击流式图并添加 种群层级 布局
    2. 左键单击FSC/SSC图，选择多边形门控功能，绘制门控以排除碎片和死细胞。选中新建的门控并将其重命名为 散射 在检查器窗口中。
      注意： 这被自动称为P1。
    3. 在CD45/CD34流式图中心右键单击，导航至 显示种群，并根据散射光对图进行设门。在CD45周围绘制一个矩形门intCD34+ 细胞以排除非CD34细胞、非造血细胞以及残留的血小板和红细胞（CD45-）。将门重命名为 CD34+.
    4. 在CD34设门的基础上对CD45RA/CD90流式图进行圈门+ 群体。围绕 CD90 绘制三个独立的子门+CD45RA- 细胞（富含造血干细胞），CD90-CD45RA- 细胞（富含多能性及红系-髓系祖细胞 [MPPs/EMPs]）和 CD90-CD45RA+ 细胞（富集淋巴-髓系祖细胞 [LMPs]）。将门控重命名为 HSC, MPP-EMP，以及 LMP分别。
    5. 当完成时，确保 种群层级 包含六个按层级顺序排列的条目，顺序如下：1）所有事件；2）散点图；3）CD34+；4）HSC；5）MPP-EMP；6）LMP。确保流式图谱和设门形状如图所示 图 4.
    6. 运行未染色的预富集白细胞以调整FSC、SSC及所有荧光通道的电压（表 2，样本5）。运行单染补偿微珠以调整相邻通道间的补偿表 2，样品1-4）。使用调整并补偿后的方案运行所有剩余的未染色和染色样品，以记录CD34富集效率（表 2，样品6-9）。
      注意： 保留最终样品（表2，样本10）用于步骤2.4中的同时流式分析和细胞分选。
  3. 配置细胞分选仪，用于将CD34+细胞亚群分选纯化至集落形成细胞（CFC）检测。
    注意：     如果使用了不同的仪器进行分析（步骤 2.2），则按照之前步骤 2.2.1 - 2.2.5 中所述，在细胞分选仪上设置相应的实验方案。
    1. 在细胞分选软件中调整细胞分选仪左右侧流的偏转角度/电压，以将细胞沉积至含有CFC培养基的15 mL离心管中。调节侧向流的角度以防止错位。逐步精细调节偏转侧流的角度，直至分选后的细胞准确落入CFC培养基中而非管壁上，因为分选的细胞数量极少。
    2. 在浏览器中，打开全局工作表文件夹，然后使用浏览器窗口顶部菜单中的按钮创建新的分选布局。将“采集设备”下拉菜单中的条目更改为 2 支试管，精确度下拉菜单中的条目 四向纯度 或 单细胞 并将目标事件数设置为 800 - 1,200 个细胞。左键单击分选位置字段（左侧或右侧），选择 进入添加 在菜单中选择要排序的群体。
  4. 进行细胞分选以用于集落形成细胞（CFC）实验。
    注意：     CFC检测的分选仅使用CD34富集产品中的细胞进行表 2，样品10）。
    1. 上样样本10，记录2,000 - 3,000个事件，并微调分选门以匹配信号强度和目标细胞群。
    2. 当设置完成后，获取细胞（表 2，样本10）。按照步骤2.2.3所述采集数据，调节流速至500 - 1,000个细胞/秒，从i）散射光门控，ii）CD34+ 门，iii）HSC门，iv）MPP-EMP门，以及v）LMP门分别收集到含有3.6 mL CFC培养基的离心管中。
      注意： CFC检测的分选仅使用CD34富集产物中的细胞进行表3，样品10）。来自Scatter和CD34的细胞+ 造血干细胞（HSCs）、多能祖细胞-早期髓系祖细胞（MPP-EMPs）和淋巴样祖细胞（LMPs）可同时分选至左右两侧试管架位置，而细胞门控需单独分选。
    3. 涡旋并分装1 mL细胞悬液至3个3.5 cm无菌、非组织培养处理的培养皿中。将细胞置于次级容器中，在37 °C孵育10–14天例如，一个15 cm的培养皿）。
    4. 在铺板后的第10至11天，根据菌落形态，对每种条件下三个培养皿中的单个菌落进行计数。

3. CD34+ HSPC 的基因修饰及过夜恢复（第 0 天）

  1. 将2.5 mL浓度为1 µg/µL的CH-296溶液用50 mL Hank’s平衡盐溶液（HBSS，参见）稀释至50 µg/mL 材料表).
  2. 准备用于慢病毒转导的培养瓶。
    1. 确定所需未经组织培养（non-TC）处理的培养瓶的大致数量（通常根据步骤1.4中测定的细胞计数确定）。计划接种 1 × 107 每T-75培养瓶中加入10 mL培养基，细胞数量为1 × 10⁶8 总细胞量需要10个培养瓶），并包括一个未经TC处理的12孔板（模拟转导条件）。将无菌HBSS和步骤3.1中的50 µg/mL CH-296储备液以2 µg/cm²的浓度加入每个培养瓶/板中2对于T-75培养瓶，使用3 mL的50 µg/mL CH-296与7 mL HBSS混合液；对于12孔板，每孔使用160 µL的50 µg/mL CH-296与340 µL HBSS混合液。
    2. 将培养皿置于洁净台或通风橱内的室温环境下静置，避免扰动，持续2小时。吸除CH-296，加入等体积的无菌HBSS + 2% 牛血清白蛋白（BSA）。室温孵育30分钟，吸除HBSS/BSA，用等体积含2.5% 1 M HEPES（pH 7.0）的无菌HBSS洗涤培养皿。在进行细胞接种前（步骤3.4）立即吸除洗涤液。
      注意： 在完成步骤 3.2.2 后，切勿让培养板/培养瓶干燥。含有无菌 HBSS + 2.5% 1 M HEPES 的培养板需在 4 °C 下过夜保存（即, 在第-1天准备。
  3. 收获并转导 CD34+ 第-1天的细胞
    1. 使用10 mL移液管，用无菌HBSS反复轻柔冲洗每个培养瓶，以洗去松散贴壁的细胞。确保所有细胞均脱落（必要时轻敲或拍打培养瓶以松动细胞）。
    2. 以 800 x 离心细胞 g 5分钟，吸除上清液，将细胞重悬于转导培养基中，调整细胞浓度至1 x 106 个/mL。收集全部细胞后，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。
    3. 加入1 mL细胞悬液（1 × 10⁶ cells/mL）6 细胞）加入至一个CH-296包被的12孔板孔中（用于空载转导对照样本）。将剩余细胞分装至T-75培养瓶中（步骤3.2.2），每瓶加入约10 mL（1 × 107 每瓶细胞数量。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育，使其贴附于CH-296包被表面。2 30分钟，打开瓶盖通风。
    4. 解冻病毒条件培养基（VCM， 材料表并确定每毫升的感染单位滴度（IU/mL）28,29,30,31,32向步骤 3.3.3 中的每个 T-75 培养瓶加入适量体积的 VCM，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2.
      注意： 若进行单次转导，过夜孵育；若进行两次转导，则在首次转导后约6–8小时重复此步骤，无需洗涤或恢复阶段，随后过夜孵育。例如，对于一个培养瓶（1 × 107 细胞）以期望的感染复数（MOI）为10进行感染，加入1 mL滴度为1 x 10的病毒液8 IU/mL

4. 细胞收获与输注前准备（第1天）

  1. 收集细胞。
    1. 按照步骤 3.3.1 - 3.3.2 所述收集转导细胞和对照细胞。用 10 mL HBSS 进行连续洗涤，并将洗涤液转移至含有细胞的锥形管中。确保将所有细胞从培养瓶中完全脱离，必要时轻敲或拍打培养瓶。
    2. 将细胞悬液在800 x g 5分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL HBSS中。合并相同条件下的细胞管，每管用10 mL HBSS冲洗一次，并将冲洗液加入细胞悬液中。使用血细胞计数板测定细胞数量。用HBSS将细胞总体积调至50 mL，于800 x g 5 分钟。
  2. 脉冲式前列腺素E2（PGE2）并配制输注产品的试剂。
    1. 吸弃上清液，将转导细胞（非对照组）重悬于 5 x 106/mL HSPC 培养基中（不含细胞因子），加入 PGE2 至终浓度为 10 µM。将细胞置于冰上孵育 2 小时，每 30 分钟轻轻摇晃一次。
    2. 在步骤 4.2.1 中，对自体血清进行热灭活（材料表），用蜡纸包裹容器，并在 56 °C 下孵育 30 分钟。配制 2% 自体血清 HBSS 溶液（500 µL 热灭活血清 + 24.5 mL HBSS），充分混匀后置于冰上保存备用。同时，在步骤 4.2.1 期间，通过反复吹打收集 12 孔板中的模拟转导细胞。将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥管中，用 1 mL HBSS 洗涤细胞 3 次，并将每次洗涤液均加入同一 15 mL 圆锥管中。
    3. PGE2 孵育 2 小时后，以 800 × g 离心洗涤细胞 2 次 g 5 分钟，弃去上清液。第二次洗涤后，用适量 HBSS 重悬细胞，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行计数。
      注意： 细胞在PGE2刺激后常出现聚团现象，可能导致细胞计数不够准确。若出现此情况，应使用步骤4.1.2的细胞计数结果，而非步骤4.2.3的计数结果。
  3. 保留模拟转导细胞和转导细胞用于输注产品的质量控制（步骤5）：5 x 105 至 1 × 106 用于流式细胞术/细胞分选的细胞（步骤 5.1 和 5.3）以及约 1 x 106 用于液体培养（步骤5.2）和菌落聚合酶链式反应（PCR）（步骤5.4）的细胞
  4. 制备输注产品。
    1. 用剩余的转导细胞，在50 mL HBSS中进行第三次洗涤，吸除上清液后，将细胞重悬于10 mL HBSS + 2%自体血清（步骤4.2.2中制备）中。将10 mL悬液吸入一支配有16.5 G针头的20 mL注射器中。用10 mL HBSS + 2%自体血清冲洗原管，并将冲洗液也吸入同一注射器中，使总体积达到20 mL。用针帽盖住注射器针头，标记注射器，并置于冰上用于运输或输注。
    2. 将转导后的细胞产物输注至位于经认证的动物研究设施内的自体宿主中 通过 中心静脉导管33,34监测移植动物的全血细胞计数（CBC）和血液生化指标，并根据项目需求开展特定的基因标记检测1,6,19.

5. 质量控制

注意：流式细胞术和细胞分选是在细胞输注到动物体内后进行的，属于步骤 4.4.2 所述随访的一部分。移植后立即采集流式细胞术数据，用于确定输注产物中表型定义的干细胞和前体细胞亚群的组成（步骤 5.1 和 5.3）；而集落形成细胞（CFC）实验的分析则在输注后 12 至 14 天进行，通过集落 PCR 检测基因修饰效率（步骤 5.4）。

  1. 对输注产品进行流式细胞术和集落形成细胞（CFC）分选。
    1. 通过流式细胞术分析细胞，并按第2节所述分选纯化CD34亚群用于集落形成细胞（CFC）检测。分别从模拟处理和转导后的CD34细胞（PGE2脉冲处理后的输注产物）中接种CFC检测。
    2. 每种条件下分选最多800个细胞，涡旋混匀后，按步骤2.4所述进行铺板、培养并计数CFC实验。计数后，从CFC实验中挑取菌落，按步骤5.4所述进行菌落PCR。
  2. 液体培养
    1. 将细胞以1 x 10的密度接种于HSPC培养基中进行液体培养6/mL，在未使用TC处理的培养板中培养。在转导后的第2、5和12天，收集细胞并进行计数，用于流式细胞术分析。进行集落形成细胞（CFC）实验时无需细胞分选。
    2. 在第2天和第5天，将33%的细胞重新接种至新鲜的HSPC培养基中，密度为1 × 106/mL。将33%的细胞在DNA提取缓冲液中冻存，用于定量实时PCR。将33%的细胞用于流式细胞术分析，具体步骤如2.1和2.2所述。
    3. 使用步骤 5.2.2 中的数据分析造血后代的表型组成。确定每个样本中 CD34+ 细胞的频率以及步骤 2.2.2 中所述的表型定义的亚群。比较 CD34 的组成+ 不同条件下细胞的比较，以确定基因修饰的影响。
      注意： CD34+ 细胞应在整个培养过程中维持其表达，并包含所有表型亚群。CD90的丢失+CD45RA- 细胞或表型亚群的比例异常可能表明基因修饰的直接或间接效应。
  3. 定量分析外源基因表达（例如.，绿色荧光蛋白 [GFP]）通过流式细胞术检测（可选，取决于实验设计），自第 2.2 步调整实验方案。
    1. 添加三个显示SSC/转基因（例如SSC/GFP）的流式图。第一个图圈选HSCs，第二个图圈选MPPs-EMPs，第三个图圈选LMPs。分别绘制每个 与 转基因（例如 GFP）并创建名为 HSC-GFP 的门控+MPP-EMP-GFP+，以及 LMP-GFP+分别。
    2. 当完成时， 种群层级 必须包含九个按层级顺序排列的条目，顺序如下：1）所有事件；2）散点图；3）CD34+；4）HSC；5）HSC-GFP+；6）MPP-EMP；7）MPP-EMP-GFP+；8）LMP；9）LMP-GFP+.
      注意： 液体培养中较晚时间点的任何转基因表达（例如第5天和第12天）将更能准确反映步骤5.4中通过菌落PCR所确定的基因修饰效率。液体培养的早期时间点可能会高估转基因表达，这是由于未整合的慢病毒（LVs）所致。同样，通过流式分选GFP+ 第1天用于CFC检测的细胞将导致大量假阳性菌落。
  4. 进行菌落PCR。
    1. 在步骤 2.4.4 和 5.1.1 计数后，使用 10 µL 或 20 µL 移液器将单个菌落挑取至 50 µL DNA 提取缓冲液中，反复吹打混匀，将菌落转移至 8 孔 PCR 排管盖中的一个管内。从模拟处理组中挑取 8 个菌落，从转导处理组中挑取 88 个菌落，以制备一个完整的 96 孔板。向每个孔中加入 50 µL DNA 提取缓冲液。
    2. 从菌落中提取DNA，使用PCR仪并按照以下程序操作：65 °C 20分钟，99 °C 10分钟，然后4 °C保存。为获得最佳DNA质量，应尽快将提取的DNA转移至-20 °C保存。
    3. 通过菌落PCR定量LV转导细胞，比较LV转导细胞的数量+ 使用Lenti F/R引物检测的菌落数与使用Actin F/R及对照引物检测的总菌落数之比材料表).

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结果

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上述方案旨在分离并进行基因修饰非人灵长类动物（NHP）的CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs），随后可将这些细胞回输至自体宿主体内（图1 和 图2）。按照本方案操作时，我们通常可从经动员的食蟹猴骨髓中获得最多约 8 × 109 个总白细胞（WBCs），有时从恒河猴中获得的数量可达此数值的两倍。在这两个物种中，我们富集得到的CD34+ HSPCs数量与输入的总WBC数量成正比（图3）。先前的研究结果表明，总的CD34+ HSPC产物中包含并非真正具有长期植入能力的造血干细胞（HSCs）。因此，我们开发了基于流式细胞术的分析方法（图4），并利用集落形成细胞（CFC）检测（图5-6）来鉴定培养物中的长期HSCs及定向祖...

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讨论

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慢病毒（LV）载体工程技术是目前对CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs）等细胞类型进行基因修饰并用于后续体内移植的特征最明确的方法。本文所述方案旨在最大化在体内长期存留的基因修饰HSPCs数量，从而为患有多种恶性疾病、感染性疾病和遗传性疾病的患者提供临床获益。尽管过去十年中基因编辑策略不断涌现，但LV修饰的细胞在体外、动物模型以及患者中的研究最为充分1,8,20,21,22。

根据我们对该方案的丰富经验，纯化CD34+ HSPCs的富集（即分选后细胞产物中CD34+细胞比例>80%）是成功的关键因素。由于这些细胞来源于骨髓总白细胞的混合群体，低纯度的培养物可能包含无法长期植入的细胞，...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢Helen Crawford协助准备本手稿，Jim Woolace提供平面设计，以及Veronica Nelson和Devikha Chandrasekaran参与本实验方案的开发。本方案的开发得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家过敏与传染病研究所（R01 AI135953和AI138329，授予H.P.K.）和国家心肺血液研究所（R01 HL136135、HL116217、P01 HL122173和U19 HL129902，授予H.P.K.）的资助，同时也获得了NIH P51 OD010425的支持，部分资助来自NIH/NCI癌症中心支持基金P30 CA015704。H.P.K.是Markey分子医学研究员，并作为首届José Carreras/E. Donnall Thomas癌症研究讲席教授和Fred Hutch细胞与基因治疗讲席教授获得资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Stemspam SFEM II（"HSPC"）培养基StemCell09655
汉克斯平衡盐溶液Gibco14175095
磷酸盐缓冲液Gibco14190-144
青霉素/链霉素Gibco15140-122
二甲基亚砜Sigma AldrichD2650-100
100% 乙醇Decon labsM18027161M
环孢素Sigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
热灭活胎牛血清Sigma AldrichPS-0500-A
CH-296/RetroNectin（2.5 mL，1 µg/µL）TaKaRAT100B
牛血清白蛋白SigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
大鼠抗小鼠IgM磁珠Miltenyi Biotec130-047-301
重组人干细胞因子（SCF）Peprotech300-07
重组人血小板生成素（TPO）Peprotech300-18
重组人FMS样酪氨酸激酶3（FLT-3）Peprotech300-19
硫酸鱼精蛋白SigmaP-4505
14 mL 聚丙烯圆底管Corning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
QuadroMACS 分离器Miltenyi Biotec130-090-976
MACS L25 柱Miltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Cayman Chemical14753-5mg
经组织培养处理的T-75培养瓶BioexpressT-3001-2
未经组织培养处理的T-75培养瓶Thermo-Fisher13680-57
20 mL 注射器BD Biosciences302830
16.5 G 针头BD Precision305198
注射器针帽BD Biosciences305819
QuickExtract DNA 溶液EpicentreQE09050
8管条带盖PCR管USA scientific1402-2708
96孔热循环仪Thermo-Fisher4375786
预分离滤器Miltenyi Biotec130-041-407
细胞滤网；BD Falcon；无菌；尼龙网；孔径：70 µm；颜色：白色；50个/箱fisher scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix 管旋转仪Miltenyi130-090-753
3 mL 鲁尔锁注射器Thermo-Fisher14823435
35 mm × 10 mm 细胞培养皿Corning430165
60 mm × 15 mm 细胞培养皿Corning430196
150 mm × 25 mm 细胞培养皿Corning430599
未经组织培养处理的培养瓶Falcon353133
Qiagen DNA 提取试剂盒Qiagen51104
PE抗人CD90（Thy1）克隆：5E10Biolegend328110
PE-CF594小鼠抗人CD34克隆：563BD horizon562449
APC-H7小鼠抗人CD45RA克隆：5H9BD Pharmingen561212
V450小鼠抗非人灵长类CD45克隆：d058-1283BD Biosciences561291
自体血清从自体宿主采集并在动员及CD34+ HSPC采集前冷冻保存N/ABeard, B. C. 等. 非人灵长类中MGMT介导的长期重建造血干细胞的高效稳定筛选. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
病毒条件培养基（VCM）Kiem 实验室，FHCRC 血液学卓越合作中心（CCEH）N/ABeard, B. C. 等. 非人灵长类中MGMT介导的长期重建造血干细胞的高效稳定筛选. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
抗CD34抗体，克隆12.8Kiem 实验室N/ABeard, B. C. 等. 非人灵长类中MGMT介导的长期重建造血干细胞的高效稳定筛选. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F 引物：AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. 等. 艾滋病非人灵长类模型中SHIV感染后Cal-1基因修饰细胞的多谱系多克隆植入及体内筛选. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R 引物：TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. 等. 艾滋病非人灵长类模型中SHIV感染后Cal-1基因修饰细胞的多谱系多克隆植入及体内筛选. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F 引物：TCCTGTGGCACTCACGAAACTIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. 等. 艾滋病非人灵长类模型中SHIV感染后Cal-1基因修饰细胞的多谱系多克隆植入及体内筛选. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R 引物：GAAGCATTTGCGGTGGACGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. 等. 艾滋病非人灵长类模型中SHIV感染后Cal-1基因修饰细胞的多谱系多克隆植入及体内筛选. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

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CD34 HSPC

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