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方法文章

荧光肽底物酶谱法检测蛋白酶活性

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DOI：

10.3791/58938

⸱

2019年1月20日

 ,  , 
1Comprehensive Cancer Center, James Cancer Hospital and Solove Research Center, Ohio State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Ohio State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的荧光肽底物酶谱法的详细实验方案，该方法采用荧光标记的肽段作为可降解底物，取代传统的天然蛋白质。通过在荧光肽酶谱中对生物样品进行电泳，能够检测到比以往酶谱技术更广泛种类的蛋白酶。

摘要

该方法旨在测定复杂生物样品的蛋白水解活性。样品通过含有可降解底物的分离胶进行电泳，按分子量大小分离。该方法与传统凝胶酶谱法的不同之处在于，将淬灭的荧光肽共价结合到分离胶中，而非使用明胶或酪蛋白等全长蛋白质。使用荧光肽可实现对蛋白水解活性的直接检测，无需额外染色步骤。生物样品中的酶可切割淬灭的荧光肽，导致荧光信号增强。随后使用标准荧光凝胶成像仪对凝胶中的荧光信号进行成像，并通过密度测定法进行定量分析。以肽段作为可降解底物，显著拓展了酶谱技术可检测的蛋白酶种类范围。

引言

凝胶酶谱法是一种用于检测生物样本（如体液或细胞培养基）中蛋白水解活性的生物学技术1,2,3样品通过含有可降解底物的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，根据分子量大小实现分离。常用的可降解底物包括明胶、酪蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白，可用于检测基质金属蛋白酶（MMPs）-1、-2、-3、-7、-8、-9 和 -11 以及多种组织蛋白酶的活性。1,2,4,5,6,7,8电泳结束后，使酶复性，并使其降解凝胶中的蛋白质。在传统的凝胶酶谱法中，凝胶使用蛋白质染料（如考马斯亮蓝）进行染色。 蓝色，蛋白酶活性通过信号减弱来检测， 即， 深蓝色背景上的白色条带（蛋白质降解）。

本文介绍一种凝胶酶谱法的替代方案，该方法使用共价结合于聚丙烯酰胺凝胶中的短链荧光肽作为可降解底物（图1）。与使用天然蛋白质的传统凝胶酶谱法相比，采用合成肽作为可降解底物可检测更广泛种类的蛋白酶9。荧光肽的共价连接可防止此前方法中在凝胶电泳过程中出现的肽段扩散和迁移现象9,10。此外，使用荧光底物可实现对蛋白酶活性的直接检测，无需额外的染色和脱色步骤。该方法的总体目标是通过将荧光肽共价整合至酶谱凝胶中，实现对生物样品中蛋白酶活性的检测。

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方案

1. 分离胶层的制备

  1. 根据表1配制10%聚丙烯酰胺分离胶溶液。在灌胶前立即加入四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（APS），因为它们的加入会启动聚合反应。
  2. 向一个空的1.5 mm小型凝胶夹心中注入一半体积（5 mL）的10%分离胶溶液。
  3. 在聚丙烯酰胺胶上方加入一层薄薄的异丙醇（约500 µL），以形成平整的胶面并防止产生气泡。可利用剩余的聚丙烯酰胺溶液监测聚合反应进程；当离心管中的聚丙烯酰胺完全凝固时，表明反应已完成（约40分钟）。

2. 叠氮-PEG3-马来酰亚胺连接分子的制备

  1. 在第一层分离胶聚合的同时，从 -20 °C 保存条件下取出叠氮-PEG3-马来酰亚胺试剂盒，并让其组分升至室温。每个试剂盒包含两种组分：1 号小瓶含有马来酰亚胺-NHS 酯，为灰白色至灰色固体；2 号小瓶含有叠氮-PEG3-胺，为淡黄色油状物。
    注意：作者建议使用 25 mg 的叠氮-PEG3-马来酰亚胺试剂盒，因其配制后在 -20 °C 下仅能短期保存（1–2 小时），之后即开始降解。25 mg 足以制备 10 个肽凝胶。凝胶应在制备后 3 周内使用。
  2. 将 2 号小瓶中的组分溶解于生产商推荐体积的二甲基亚砜（DMSO）中，并涡旋振荡 30 秒，以确保液体充分混匀。
  3. 将 1 号小瓶中的内容物转移至一个洁净、干燥的 100 mL 圆底烧瓶中，烧瓶内需放置搅拌子。
    注意：使用前应用丙酮冲洗烧瓶并彻底干燥，以防止水分干扰反应。
  4. 立即在烧瓶口插入带有可被注射器穿刺隔膜的橡胶塞。操作应迅速，以防止水分进入烧瓶。
  5. 在隔膜上插入两根 18 号注射器针头，并将其中一根连接至惰性气体钢瓶（例如 氩气）。让惰性气体通入烧瓶 3 分钟。在惰性气体氛围下混合 1 号和 2 号小瓶的组分，以避免产生不期望的副反应产物。
    警告：第二根注射器针头用于排气，使烧瓶内的空气在充满惰性气体时得以排出。切勿遗漏排气针头！
  6. 关闭惰性气体并将其从针头断开。使用注射器将 2 号小瓶的全部内容物注入烧瓶中。
  7. 移除两根针头和注射器，持续搅拌并在室温下反应 30 分钟。
  8. 取下橡胶塞，将反应液转移至一个洁净的 5 mL 离心管中。叠氮-PEG3-马来酰亚胺溶液必须在室温下 1 小时内使用完毕。

3. 肽分离胶层的制备

  1. 第一层分离胶聚合完成后，倒去异丙醇层。用移液器吸取1 mL去离子水冲洗凝胶顶部，然后倒掉水分。
  2. 从-80 °C冰箱中取出巯基功能化的荧光肽，室温下解冻。
    注意：巯基功能化肽的制备方法可参照先前文献11,12。也可使用商业来源的肽，但需添加末端半胱氨酸残基以实现马来酰亚胺-巯基点击反应。将肽溶解至10 mM的储存浓度，并分装为小份（30 µL）于-80 °C保存，以减少反复冻融次数。
  3. 根据表1配制含有叠氮-PEG3-马来酰亚胺连接分子和荧光肽的10%分离胶溶液。在灌胶前立即加入TEMED和APS，因为它们的加入会启动聚合反应。
  4. 用肽分离胶溶液填充剩余凝胶夹层的一半体积（3 mL）。
    注意：采用多层分离胶策略可减少每块凝胶所需的肽和连接分子用量。可根据需要调整肽分离胶层的厚度，以适应更宽范围的分子量。
  5. 在聚丙烯酰胺凝胶顶部覆盖一层薄的异丙醇（约500 µL），以形成平整的胶面并防止气泡产生。利用剩余的聚丙烯酰胺溶液监测聚合反应进程。当离心管中的聚丙烯酰胺完全凝固时，表明反应完成（约40分钟）。
    注意：荧光肽对光敏感。在凝胶制备、电泳、洗涤和显影过程中，应使用铝箔包裹凝胶以防止光漂白。
  6. 倒去异丙醇层，并参照步骤3.1，用去离子水冲洗肽分离胶顶部。
  7. 若立即使用凝胶，则进入步骤4；否则将制备好的凝胶浸入盛有100 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的塑料盒中，于4 °C保存，防止凝胶干燥。用铝箔包裹盒子以避免光漂白。凝胶可在PBS中保存最多3周，以备后续使用。

4. 浓缩胶的制备

  1. 根据表1配制5%浓缩胶溶液。在即将灌胶前加入TEMED和APS，因为它们的加入会启动聚合反应。
  2. 用浓缩胶溶液填充胶板剩余的空余部分（约2 mL）。
  3. 迅速将1.5 mm厚的梳子插入浓缩胶层中，确保加样孔下方无气泡残留。可用少量剩余的聚丙烯酰胺溶液监测聚合反应进程。当离心管中的聚丙烯酰胺完全凝固时，表明聚合反应已完成（约10分钟）。
  4. 轻轻拔出梳子，并撕去胶板背面的封边胶带。

5. 电泳用生物样品的制备

  1. 在非还原条件下，按其他部分所述方法制备条件培养基、细胞裂解物、组织匀浆液以及基质金属蛋白酶（MMP）标准品2不要加热样品。
  2. 例如，按如下步骤制备条件培养基：
    1. 接种40,000个细胞/cm²2 6 孔板中的细胞置于含 10% 胎牛血清（FBS）的培养基中。将细胞在加湿培养箱（5% CO₂）中孵育。2 在37 °C下培养24小时，使其达到70–80%汇合度。
      注意：如果细胞在24小时后未达到预期汇合度，可将其在含10% FBS的培养基中继续培养24小时。
    2. 用 PBS 洗涤细胞两次，加入 2 mL 无血清培养基。将细胞置于加湿培养箱（5% CO₂）中孵育。2 在37 °C下继续培养24小时。
    3. 使用血清移液管收集每个孔中的条件培养基。将培养基在1200 rpm下离心3分钟，以去除细胞碎片。取上清液，并使用15 mL、10 kDa分子量截留的离心过滤装置进行浓缩。将过滤装置在水平转子中以4,000 × g离心15分钟，或在固定角转子中以5,000 × g离心15分钟。
      注意：此步骤为可选步骤，但可增强肽酶谱凝胶中蛋白水解条带的强度。
    4. 将浓缩的滤液转移至新的1.5 mL离心管中。分装后于-80 °C保存，可进行最多三次冻融循环。
  3. 使用标准蛋白质定量检测方法测定蛋白质含量（例如 BCA法，Bradford法 等等。).

6. 肽酶谱凝胶中生物样本的电泳

  1. 将样品溶解于常规明胶酶谱法样品缓冲液中（62.5 mM Tris-HCl，pH 6.8，25% 甘油，4% SDS，0.01% 溴酚蓝）。对于细胞和组织样品，建议每孔上样总蛋白量约为 30 µg，MMP 标准品每孔上样蛋白量为 50–100 ng。
  2. 向电泳装置中加入 400 mL 1× Tris-甘氨酸-SDS 电泳缓冲液。每孔最多上样 35 µL。 在 4 °C 条件下以 120 V 电压电泳 1.5 小时，或直至分子量标准指示目标蛋白酶已进入肽段分离胶层（呈可见橙色）。
    注意：大多数基质金属蛋白酶（MMP）及其变体的分子量范围在 35–100 kDa 之间。当分子量标准显示该范围内的蛋白已进入肽段分离胶层时，即可停止电泳。此原则同样适用于其他已知分子量的蛋白酶类别。若需检测更广分子量范围内多种蛋白酶，可减小分离胶层厚度，并增加肽段分离胶层厚度。
  3. 电泳结束后，从塑料夹板中取出凝胶，并在室温下用复性缓冲液（含 2.5% Triton X-100、1 µM ZnCl2 和 5 mM CaCl2 的 50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5）轻轻振荡洗涤三次，每次 10 分钟。
  4. 将凝胶转移至显色缓冲液（含 1% Triton X-100、1 µM ZnCl2 和 5 mM CaCl2 的 50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5）中，室温孵育 15 分钟。更换新鲜显色缓冲液后，在 37 °C 下轻轻振荡孵育 24 小时，确保凝胶完全浸没于缓冲液中。

7. 肽类酶谱凝胶的成像

  1. 24 小时后，使用配备适当激发和发射滤光片的荧光凝胶扫描仪/成像仪对凝胶进行成像。例如，代表性结果中所示的肽凝胶与荧光素（Fluorescein）偶联，采用 488 nm 激发滤光片和 521 nm 发射滤光片进行成像。使用与您的荧光染料相匹配的适当滤光片可最大程度地检测蛋白水解活性。
    注意：也可使用配备紫外透射仪的凝胶成像系统进行成像，该设备常用于对经溴化乙锭染色的 DNA 凝胶进行成像。此时应使用紫外透射仪（365 nm）设置及 590 nm 发射滤光片对凝胶进行成像。
  2. 按照文献所述方法13，使用 ImageJ 对条带强度进行密度分析。

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结果

采用此处所述方法，将两种荧光蛋白酶可降解肽段整合到聚丙烯酰胺凝胶中：GGPQG↓IWGQK(PEG)2C（在全文和图示中简称为QGIW）和GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2C（在全文和图示中简称为LACW）。↓表示切割位点。QGIW是一种来源于I型胶原的序列，设计用于检测细胞胶原酶14。LACW是一种已优化的序列，可用于检测MMP-14和MMP-1115。这些肽段通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯-胺化学法标记了达比西尔（淬灭剂）和荧光素（荧光团）11。开发新的荧光肽段时，往往难以实现充分的荧光淬灭效果并保证其在标准缓冲液中的溶解性。因此，将 commercially available 荧光蛋白酶底物中的肽序列进行改造，引入C端半胱氨酸，通常是开发新型荧光传感器的有效策略。为了展示肽段zymography分离复杂蛋白酶混合物的能力，收集了两种不同癌细胞...

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讨论

目前的酶谱技术依赖于将天然底物掺入聚丙烯酰胺凝胶中以检测蛋白水解活性。尽管这些技术已得到广泛应用，但其可检测的蛋白酶种类仍然有限。本文描述了一种将荧光标记的、可被蛋白酶降解的肽段掺入聚丙烯酰胺分离胶中的实验方案。利用叠氮-PEG3-马来酰亚胺连接分子进行共价偶联，能够比使用天然底物检测到更多种类的蛋白酶。荧光肽的高度可调特性使研究人员能够设计出针对特定目标蛋白酶的底物。通过肽库筛选，已为多种蛋白酶鉴定出相应的肽底物，同时，提供定制肽合成服务的商业来源也日益增多。开发新型荧光肽时，常面临荧光淬灭效果不足以及在标准缓冲液中溶解度差等问题。因此，将市售荧光蛋白酶底物的肽序列进行改造，添加一个C端半胱氨酸，通常是成功构建新型荧光探针的有效策略。

在完成本实验方案时，操作荧光标记肽凝胶需格外小心，避免过度暴露于光照，因为这会显著降低检测到的荧光信号。此外，目前每个凝胶中使用的肽浓度为 75 µM。可根据需要调整为更低浓度以节约肽用量，但需注意，叠氮-PEG3-马来酰亚胺溶液的加入量必须至少为肽摩尔数的 20 倍以上。叠氮-PEG3-马来酰亚胺试剂盒有三种规格可购（25 mg、100 mg 和...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

由俄亥俄州立大学工程学院、生物医学工程系以及综合癌症中心——亚瑟·G·詹姆斯癌症医院和理查德·J·索洛夫研究研究所提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mm 空胶板ThermoFisher ScientificNC2015
1.5 mm，10 孔空胶板梳子ThermoFisher ScientificNC3510
1× 磷酸盐缓冲液Fisher Scientific10-010-049
20% SDS 溶液AmbionAM9820
3× 明胶电泳样品缓冲液Bio-Rad1610764
40% (w/v) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (19:1)AmbionAM9022
6 孔组织培养板ThermoFisher Scientific087721B
Amicon Ultra-2 离心过滤单元（10 kDa 截留分子量）Sigma-AldrichUFC201024
过硫酸铵Sigma-AldrichA3678
叠氮-PEG3-马来酰亚胺试剂盒Click Chemistry ToolsAZ107
氯化钙ThermoFisher ScientificBP510100
二甲基亚砜Fisher ScientificBP231
异丙醇Fisher ScientificA416P
Micro BCA 蛋白检测试剂盒ThermoFisher Scientific23235
N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)Sigma-AldrichT9281
PowerPac Basic 电源供应器Bio-Rad1645050
Precision Plus Protein 双色蛋白标准品Bio-Rad161-0374
PrecisionGlide 皮下注射针头Fisher Scientific14-826
圆底烧瓶 (100 mL)Fisher Scientific50-873-144
橡胶隔垫塞Fisher Scientific50-872-546
无菌滑动接头注射器 (1 mL)Fisher Scientific14-823-434
吐温 X-100Sigma-AldrichX100
Trizma 盐酸盐Sigma-AldrichT5941
Typhoon 9410 分子成像仪GE Amersham8149-30-9410
氯化锌Sigma-Aldrich208086

参考文献

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