本文介绍了一种改良的荧光肽底物酶谱法的详细实验方案，该方法采用荧光标记的肽段作为可降解底物，取代传统的天然蛋白质。通过在荧光肽酶谱中对生物样品进行电泳，能够检测到比以往酶谱技术更广泛种类的蛋白酶。
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本文内容
摘要
摘要
该方法旨在测定复杂生物样品的蛋白水解活性。样品通过含有可降解底物的分离胶进行电泳，按分子量大小分离。该方法与传统凝胶酶谱法的不同之处在于，将淬灭的荧光肽共价结合到分离胶中，而非使用明胶或酪蛋白等全长蛋白质。使用荧光肽可实现对蛋白水解活性的直接检测，无需额外染色步骤。生物样品中的酶可切割淬灭的荧光肽，导致荧光信号增强。随后使用标准荧光凝胶成像仪对凝胶中的荧光信号进行成像，并通过密度测定法进行定量分析。以肽段作为可降解底物，显著拓展了酶谱技术可检测的蛋白酶种类范围。
引言
凝胶酶谱法是一种用于检测生物样本（如体液或细胞培养基）中蛋白水解活性的生物学技术1,2,3样品通过含有可降解底物的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，根据分子量大小实现分离。常用的可降解底物包括明胶、酪蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白，可用于检测基质金属蛋白酶（MMPs）-1、-2、-3、-7、-8、-9 和 -11 以及多种组织蛋白酶的活性。1,2,4,5,6,7,8电泳结束后，使酶复性，并使其降解凝胶中的蛋白质。在传统的凝胶酶谱法中，凝胶使用蛋白质染料（如考马斯亮蓝）进行染色。 蓝色，蛋白酶活性通过信号减弱来检测， 即， 深蓝色背景上的白色条带（蛋白质降解）。
本文介绍一种凝胶酶谱法的替代方案，该方法使用共价结合于聚丙烯....
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方案
1. 分离胶层的制备
- 根据表1配制10%聚丙烯酰胺分离胶溶液。在灌胶前立即加入四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（APS），因为它们的加入会启动聚合反应。
- 向一个空的1.5 mm小型凝胶夹心中注入一半体积（5 mL）的10%分离胶溶液。
- 在聚丙烯酰胺胶上方加入一层薄薄的异丙醇（约500 µL），以形成平整的胶面并防止产生气泡。可利用剩余的聚丙烯酰胺溶液监测聚合反应进程；当离心管中的聚丙烯酰胺完全凝固时，表明反应已完成（约40分钟）。
2. 叠氮-PEG3-马来酰亚胺连接分子的制备
- 在第一层分离胶聚合的同时，从 -20 °C 保存条件下取出叠氮-PEG3-马来酰亚胺试剂盒，并让其组分升至室温。每个试剂盒包含两种组分：1 号小瓶含有马来酰亚胺-NHS 酯，为灰白色至灰色固体；2 号小瓶含有叠氮-PEG3-胺，为淡黄色油状物。
注意：作者建议使用 25 mg 的叠氮-PEG3-马来酰亚胺试剂盒，因其配制后在 -20 °C 下仅能短期保存（1–2 小时），之后即开始降解。25 mg 足以制备 10 个肽凝胶。凝胶应在制备后 3 周内使用。 - 将 2 号小瓶中的组分溶解于生产商推荐体积的二甲基亚砜（DMSO）中，并涡旋振荡 30 秒，以确保液体充分混匀。
- 将 1 号小瓶中的内容物转移至一个洁净、干燥....
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结果
采用此处所述方法，将两种荧光蛋白酶可降解肽段整合到聚丙烯酰胺凝胶中：GGPQG↓IWGQK(PEG)2C（在全文和图示中简称为QGIW）和GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2C（在全文和图示中简称为LACW）。↓表示切割位点。QGIW是一种来源于I型胶原的序列，设计用于检测细胞胶原酶14。LACW是一种已优化的序列，可用于检测MMP-14和MMP-1115。这些肽段通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯-胺化学法标记了达比西尔（淬灭剂）和荧光素（荧光团）11。开发新的荧光肽段时，往往难以实现充分的荧光淬灭效果并保证其在标准缓冲液中的溶解性。因此，将 commercially available 荧光蛋白酶底物中的肽序列进行改造，引入C端半胱氨酸，通常是开发新型荧光传感器的有效策略。为了展示肽段zymography分离复杂蛋白酶混合物的能力，收集了两种不同癌细胞.......
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讨论
目前的酶谱技术依赖于将天然底物掺入聚丙烯酰胺凝胶中以检测蛋白水解活性。尽管这些技术已得到广泛应用，但其可检测的蛋白酶种类仍然有限。本文描述了一种将荧光标记的、可被蛋白酶降解的肽段掺入聚丙烯酰胺分离胶中的实验方案。利用叠氮-PEG3-马来酰亚胺连接分子进行共价偶联，能够比使用天然底物检测到更多种类的蛋白酶。荧光肽的高度可调特性使研究人员能够设计出针对特定目标蛋白酶的底物。通过肽库筛选，已为多种蛋白酶鉴定出相应的肽底物，同时，提供定制肽合成服务的商业来源也日益增多。开发新型荧光肽时，常面临荧光淬灭效果不足以及在标准缓冲液中溶解度差等问题。因此，将市售荧光蛋白酶底物的肽序列进行改造，添加一个C端半胱氨酸，通常是成功构建新型荧光探针的有效策略。
在完成本实验方案时，操作荧光标记肽凝胶需格外小心，避免过度暴露于光照，因为这会显著降低检测到的荧光信号。此外，目前每个凝胶中使用的肽浓度为 75 µM。可根据需要调整为更低浓度以节约肽用量，但需注意，叠氮-PEG3-马来酰亚胺溶液的加入量必须至少为肽摩尔数的 20 倍以上。叠氮-PEG3-马来酰亚胺试剂盒有三种规格可购（25 mg、100 mg 和.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
由俄亥俄州立大学工程学院、生物医学工程系以及综合癌症中心——亚瑟·G·詹姆斯癌症医院和理查德·J·索洛夫研究研究所提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mm 空胶板 | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm，10 孔空胶板梳子 | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1× 磷酸盐缓冲液 | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS 溶液 | Ambion | AM9820 | |
| 3× 明胶电泳样品缓冲液 | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 孔组织培养板 | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 离心过滤单元（10 kDa 截留分子量） | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 叠氮-PEG3-马来酰亚胺试剂盒 | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| 氯化钙 | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| 二甲基亚砜 | Fisher Scientific | BP231 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA 蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic 电源供应器 | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein 双色蛋白标准品 | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide 皮下注射针头 | Fisher Scientific | 14-826 | |
| 圆底烧瓶 (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| 橡胶隔垫塞 | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| 无菌滑动接头注射器 (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma 盐酸盐 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 分子成像仪 | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| 氯化锌 | Sigma-Aldrich | 208086 |
参考文献
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods ....
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