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T细胞受体信号通路中介分子的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选

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DOI：

10.3791/58946

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2019年1月22日

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1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Singapore Immunology Network, A*STAR, 3Curiox Biosystems, 4Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit (KU) Leuven

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文采用基于流式细胞术的检测方法，筛选影响T细胞受体信号传导的化学抑制剂文库，以鉴定抑制剂及其作用靶点。此处描述的方法还可扩展用于高通量筛选。

摘要

T细胞受体（TCR）信号通路包含多种介导分子，可在TCR激活后传递信号。已有多种策略被提出并用于鉴定TCR信号通路中的新介导分子，这将有助于深入理解T细胞的各类过程，包括T细胞活化和胸腺选择。本文描述了一种筛选实验方法，该方法基于发育中胸腺细胞的活化状态，可用于鉴定影响TCR信号通路的分子。强烈的TCR信号会诱导发育中的胸腺细胞启动凋亡机制，这一过程称为阴性选择。通过应用激酶抑制剂，可阻断那些作用于TCR信号通路的靶点，从而逆转阴性选择过程。本文详述的方法不仅可用于鉴定在TCR信号通路中已知具有经典作用的激酶抑制剂，还可用于发现尚未被确认参与TCR信号通路的新激酶抑制剂。此处介绍的筛选策略亦可拓展应用于更高通量的筛选，以发现TCR信号通路中潜在的新型可成药靶点。

引言

T细胞是一类在维持适应性免疫中发挥关键作用的淋巴细胞。它们表达T细胞受体（TCR），使其能够识别配体，即由主要组织相容性复合物分子（MHC）与结合的肽段组成的复合物，这些复合物存在于抗原呈递细胞（APCs）的表面。TCR与MHC相互作用所触发的TCR信号通路，对T细胞的活化和发育至关重要1。

在T细胞发育过程中，源自骨髓的造血干细胞（HSCs）迁移至胸腺，在此经历分化并依次通过T细胞谱系发育的各个阶段2. 双阳性（DP）胸腺细胞表达 CD4 和 CD8 共受体，可与抗原呈递细胞（APC）上的自身肽/MHC 复合物结合。对自身肽/MHC 配体具有中等亲和力的胸腺细胞将发育为单阳性（SP）CD4 或 CD8 胸腺细胞，该过程称为阳性选择。相反，因自身肽/MHC 复合物产生过强 TCR 刺激的胸腺细胞则发生凋亡 通过 阴性筛选3,4该刺激诱导的、依赖半胱天冬酶的细胞凋亡过程可被模拟 体外 通过使用抗CD3/28抗体包被的微珠刺激胸腺细胞5成熟的T细胞在通过选择过程后，由外周抗原提呈细胞（APCs）提供的非自身肽/MHC配体激活。自身肽/MHC分子对外周T细胞仍然具有重要作用，包括在维持细胞存活和稳态增殖中的紧张性信号传导、辅助性T细胞的分化，以及通过共激动作用增强T细胞对非自身肽/MHC配体的应答。6,7,8,9高亲和力TCR与肽/MHC配体结合后，可激活多条下游信号通路，涉及多种信号分子，共同构成复杂的TCR信号网络10TCR 信号通路已被研究数十年，然而新通路介质的发现仍无减缓迹象。11,12TCR信号通路的调控具有临床意义，可通过增强T细胞反应以用于免疫治疗，或抑制T细胞反应以控制自身免疫性疾病。13调节T细胞反应的策略主要依赖于干扰激酶或磷酸酶的活性14,15,16.

我们描述了一种基于流式细胞术的检测方法，用于筛选能够调节TCR信号传导和T细胞活化的小分子化合物17。该检测方法基于这样一个现象：当胸腺细胞受到强烈的TCR信号刺激时，会激活凋亡通路。该方法具有足够的灵敏度，可检测刺激强度的变化；将表达转基因TCR的胸腺细胞与亲和力逐渐增强的肽/MHC四聚体共孵育，可导致作为凋亡反应指标的caspase激活水平相应增加5。在筛选实验中，我们使用了一个激酶抑制剂文库，并评估了这些抑制剂对胸腺细胞响应强TCR信号能力的调节作用。

已有多种基于流式细胞术或荧光报告系统的策略被用于高通量筛选不同T细胞亚群中多种外周激活表型。这些策略包括利用基因编码的荧光报告系统评估T细胞激活的时间和强度18，以脱颗粒作为细胞毒性T细胞活性的检测指标19,20，以及分析细胞信号通路中多种蛋白的磷酸化状态21。

本文所展示的筛选实验能够成功鉴定出抑制TCR信号通路中经典分子的化合物，以及可能具有抑制TCR信号作用的新型化合物。例如，我们鉴定出GSK3β和Hsp90的抑制剂为影响T细胞反应的新化合物17。该实验可通过检测细胞凋亡反应的减弱，区分出干扰信号转导的抑制剂与因细胞毒性而产生的TCR非依赖性效应。除了检测凋亡的诱导外，我们还测量CD69的上调和TCR的下调，作为T细胞活化的标志。由于TCR信号网络十分复杂，采用多种读数指标可提高发现对特定通路具有特异性作用分子的可能性。本文还引入了一种无需离心的实验方案，作为细胞染色以进行流式细胞术分析时的高通量替代方法，替代原有方案。本研究所描述的实验使用了一个小分子激酶抑制剂文库，但原则上也可用于更高通量的筛选。所选用的文库还可包含多种抑制剂或其他分子。

方案

本研究使用6至8周龄的雄性和雌性C57Bl/6小鼠。小鼠于新加坡国立大学（新加坡）的动物实验中心繁育。所有动物实验均经新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 胸腺细胞悬液的制备

  1. 在 CO2 麻醉室中处死小鼠。
  2. 后续步骤均应在组织培养超净台中进行，以避免细胞培养受到任何污染。用图钉将小鼠尸体固定在解剖板上，并用 70% 乙醇喷洒小鼠体表。
  3. 使用剪刀在腹部腹侧做一条垂直切口，从腹部开始向上延伸至下颌。再沿后肢两侧分别做切口。将皮肤拉伸以暴露肋骨，并用图钉固定。
  4. 用剪刀从后端剪开膈肌及肋骨两侧，抬起肋骨并用图钉固定，以暴露胸腺。分离附着在胸腺上的结缔组织，使用弯头镊子取出胸腺。
  5. 将胸腺放入含有 5 mL 完全 RPMI 培养基的 6 孔板的一个孔中。
    注意：如果解剖与刺激实验之间存在较长的等待时间，可考虑在培养基中添加 10% 去炭疽胎牛血清（FBS），以提高胸腺细胞的存活率。
  6. 使用注射器钝端轻轻研磨胸腺，并将细胞通过 70 µM 细胞筛网过滤。或者，为了以更佳状态收集胸腺细胞，可考虑使用两把镊子挤压胸腺，收集从胸腺上皮中流出的胸腺细胞。
  7. 使用血细胞计数板或任何自动细胞计数仪器进行细胞计数。

2. 激酶抑制剂的滴定至无毒浓度

注意：本节重点介绍为T细胞活化筛选实验准备抑制剂的步骤。高浓度的抑制剂可能导致细胞死亡，而细胞死亡是T细胞活化筛选实验中的一个检测指标。通过系列稀释抑制剂，旨在确定每种抑制剂的最终使用浓度，该浓度不应在无TCR刺激的情况下独立诱导细胞凋亡。本研究中使用的激酶抑制剂库购自外部供应商。抑制剂列表详见材料表中。

  1. 激酶抑制剂低浓度培养板的制备
    1. 为制备1 mM的抑制剂平板，将每种抑制剂各取10 µL加入90 µL二甲基亚砜（DMSO）中。
      注意：本研究使用的小分子文库中的抑制剂初始浓度为10 mM。若抑制剂为沉淀形式，请按照供应商推荐的重悬步骤进行操作。若抑制剂的浓度并非10 mM，则应根据实际情况制备相应合适浓度的抑制剂板，并使用适当的稀释倍数制备独立的系列稀释液。
      警告：使用有毒抑制剂时，须遵循制造商提供的安全操作与处置说明。
    2. 准备0.1 mM的抑制剂平板：从1 mM抑制剂平板中取10 µL抑制剂，加入90 µL DMSO中。
    3. 准备0.01 mM的抑制剂平板时，从0.1 mM抑制剂平板中取10 µL抑制剂加入90 µL DMSO中。
  2. 使用激酶抑制剂处理胸腺细胞
    1. 按照第1节制备胸腺细胞悬液。
    2. 用完全RPMI稀释胸腺细胞，制备浓度为5 x 10⁶个/mL的胸腺细胞悬液6 cells/mL
    3. 使用多通道移液器，向96孔板的所有孔中各加入200 µL胸腺细胞悬液。
    4. 向每个孔中加入含有1 mM抑制剂的对应孔中的2 µL抑制剂（抑制剂的终浓度为10 µM）。
    5. 在同一块培养板中，设置四个未处理对照孔、四个5 µM地塞米松处理的阳性对照孔，以及四个溶剂对照孔（每孔加入2 µL DMSO）。
    6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育胸腺细胞2 孵育箱中孵育17 - 20小时（或过夜）。
  3. 确定单个抑制剂的适宜浓度
    1. 以 300 x 离心胸腺细胞悬液 g 4 °C 下孵育 5 分钟。用 250 µL FACS 洗涤缓冲液重悬细胞。
    2. 对样本进行流式细胞术分析，并使用流式细胞术分析软件分析结果。
    3. 根据FSC-SSC设门确定活细胞百分比。设门策略如图所示 图1B.
    4. 根据经DMSO处理的对照组计算活细胞百分比的平均值，该对照组被归一化为100%。设定一个可接受细胞死亡率的任意范围（例如20%）。若抑制剂处理组的活细胞百分比低于该范围（即.，低于DMSO处理对照组80%的样品需在较低浓度下重新测试。
    5. 对于在步骤 2.3.4 中未达到活性标准的抑制剂，重复步骤 2.2.1 至 2.3.4，但在步骤 2.2.4 中使用浓度为 0.1 mM 的抑制剂板，而非含有 1 mM 抑制剂的板。此处所用抑制剂的最终浓度为 1 µM。
    6. 对于在1 µM浓度下仍导致高水平细胞死亡的抑制剂，应在0.1 µM浓度下进行测试。重复步骤2.2.1至2.3.4，但在步骤2.2.4中使用浓度为0.01 mM的抑制剂板。此处所用抑制剂的最终浓度为0.1 µM。
  4. 激酶抑制剂储备板的制备
    1. 对于以10 µM浓度使用的抑制剂，将10 µL的10 mM抑制剂加入10 µL的DMSO中。
    2. 对于以1 µM浓度使用的抑制剂，将1 µL的10 mM抑制剂加入19 µL的DMSO中。
    3. 对于需使用浓度为 0.1 µM 的抑制剂，将 1 µL 的 10 mM 抑制剂加入 199 µL 的 DMSO 中（图1C).
      注意：所制备的抑制剂储备板，其浓度为加入胸腺细胞悬液时预期终浓度的500倍。抑制剂储备板可用PCR条板或96孔板制备。
    4. 激酶抑制剂的储备板可用于胸腺细胞的筛选，采用常规的依赖离心的系统（第3节；参见 图1A，方法1和方法2）或在一种无需离心的替代系统中（第4节；参见 图1A，方法3）。

3. 激酶抑制剂文库筛选（基于常规离心的检测方法）

  1. 使用激酶抑制剂处理胸腺细胞
    1. 按照第1节的方法制备胸腺细胞悬液。
    2. 用完全RPMI培养基稀释胸腺细胞，获得浓度为5 × 106 个细胞/mL的胸腺细胞悬液。
    3. 使用多通道移液器将200 µL胸腺细胞悬液加入96孔板的每孔中。将该板置于冰上。
    4. 从第2.4节制备的抑制剂储备板的对应孔中，向96孔板每孔加入0.5 µL抑制剂。
    5. 准备8个未处理对照孔。通过加入0.5 µL DMSO制备4个溶剂对照孔。通过加入0.5 µL 5 µM地塞米松制备4个地塞米松处理对照孔（图2）。
  2. 使用抗CD3/CD28磁珠刺激胸腺细胞
    1. 取1 mL磁珠，用2 mL PBS洗涤。使用磁力架分离磁珠并吸弃上清液。将磁珠重悬于5 mL完全RPMI培养基中。
      注：磁珠与细胞的比例为1:2.5。根据需要刺激的孔数和所用胸腺细胞数量，调整磁珠的取用量。
    2. 向每个抑制剂处理样本、4个DMSO处理样本以及8个未处理样本中的4个，各加入50 µL磁珠。向剩余的4个未处理孔中各加入50 µL完全RPMI培养基。图2展示了该板的总体布局。
    3. 使用多通道移液器混匀各孔内容物。
    4. 将胸腺细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育17–20小时（或过夜）。
  3. 表面抗原染色
    1. 制备含有抗TCRβ、抗CD4、抗CD8和抗CD69抗体的抗体染色混合液。将抗体以1:200（v/v）的比例稀释于FACS洗涤缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白[BSA]的PBS）中。
      注：建议优化染色所用抗体的滴度，而非使用固定的抗体稀释比例，以减少不同实验间染色结果的变异，并提高信噪比。
    2. 在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟。
    3. 轻弹板子以弃去上清液。
    4. 此时，实验流程可选择常规依赖离心的方案（继续进行步骤3.3.5；参见图1A，方法1），或选择无需离心的替代方案（继续进行步骤4.4.4；参见图1A，方法2）。
    5. 将细胞重悬于步骤3.3.1中制备的75 µL抗体染色混合液中。
    6. 使用多通道移液器混匀样本，并在冰上孵育30分钟。
  4. 细胞固定
    1. 用200 µL FACS洗涤缓冲液洗涤各孔，并在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。
    2. 轻弹板子以弃去上清液。
    3. 每孔加入200 µL固定/破膜缓冲液（来自活化caspase-3凋亡检测试剂盒；与步骤3.5.1中提到的10×破膜/洗涤缓冲液及步骤3.5.2中的抗caspase-3抗体为同一试剂）。
    4. 在冰上孵育30分钟。
  5. 活化caspase-3的胞内染色
    1. 将5 mL 10×破膜/洗涤缓冲液加入45 mL超纯水中，稀释得到1×破膜/洗涤缓冲液。
    2. 将1.3 mL抗caspase-3抗体加入6.5 mL 1×破膜/洗涤缓冲液中，制备胞内活化caspase染色液。抗体与破膜/洗涤缓冲液的比例为1:5。
    3. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。轻弹板子以弃去上清液。用200 µL 1×破膜/洗涤缓冲液洗涤各孔。
    4. 重复步骤3.5.3。
    5. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。轻弹板子以弃去上清液。向所有孔中加入75 µL步骤3.5.2中制备的胞内caspase染色液。
    6. 使用多通道移液器混匀样本，并在冰上孵育1小时。
    7. 用200 µL 1×破膜/洗涤缓冲液洗涤样本，并在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。
    8. 轻弹板子以弃去上清液。用200 µL 1×破膜/洗涤缓冲液再次洗涤各孔。在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。
    9. 轻弹板子以弃去上清液，将样本重悬于200 µL FACS洗涤缓冲液中。
    10. 对样本进行流式细胞术分析，并使用FACS分析软件处理结果。
    11. 在CD4 vs. CD8散点图中，圈选同时表达CD4和CD8的双阳性（DP）胸腺细胞群体（图2，下半部分）。在DP胸腺细胞门内，以未刺激样本作为阴性对照，地塞米松处理样本作为阳性对照，确定表达活化caspase-3的细胞百分比。在分析DP胸腺细胞门内CD69表达时，以未刺激样本为阴性对照，刺激样本为阳性对照。
      注：在圈选DP胸腺细胞时，应确认各独立样本中DP胸腺细胞群体的圈选是否正确。刺激后的细胞会下调表面共受体的表达，若使用过窄的DP门，可能导致部分事件被意外排除。

4. 激酶抑制剂文库筛选（无需离心的检测方法）

  1. 使用激酶抑制剂处理胸腺细胞
    1. 按照第1节制备胸腺细胞悬液。
    2. 用完全RPMI培养基稀释胸腺细胞，制备浓度为25 × 10⁶个/mL的胸腺细胞悬液6 cells/mL
    3. 使用多通道移液器，将40 µL胸腺细胞加入小体积板的每孔中。将板置于冰上。
    4. 将储存板中的抑制剂、DMSO 和地塞米松用完全 RPMI 培养基稀释，比例为 4 份完全 RPMI 培养基加 1 份抑制剂/DMSO/地塞米松（稀释倍数为 5）。
      注意：由于本小体积培养板中使用的体积比常规方法小5倍，因此在将抑制剂和对照试剂加入培养板中的胸腺细胞之前，需将其稀释5倍。
    5. 从步骤 4.1.4 中制备的抑制剂板的相应孔中，向 96 孔板中加入 0.5 µL 抑制剂。
    6. 准备8个未处理对照孔。通过加入4.1.4步骤中配制的DMSO溶液0.5 µL，准备4个溶剂对照孔。使用4.1.4步骤中稀释的5 µM地塞米松溶液，准备4个地塞米松处理对照孔。图2).
  2. 使用抗CD3/CD28磁珠刺激胸腺细胞
    1. 确保珠子充分重悬均匀。取1 mL珠子，用2 mL PBS洗涤。使用磁力架分离珠子后吸除上清液。将珠子重悬于1 mL完全RPMI培养基中。
      注意：珠子与细胞的比例为1:2.5。根据刺激的孔数和使用的胸腺细胞数量，调整珠子的用量。
    2. 向每个抑制剂处理的样本、四个DMSO处理的样本以及八个未处理样本中的四个，各加入10 µL磁珠悬浮液。向剩余的四个未处理孔中各加入10 µL完全RPMI培养基。 图2 显示了总体的板布局。
      注意：各孔最终体积为 50 µL，处于孔的最大容量范围内。操作时需谨慎，保持板子直立，以避免孔间液体溢出。
    3. 使用微量板轨道摇床振荡混匀。或者，使用多通道移液器吹打混匀各孔中的溶液。
    4. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育胸腺细胞2 使用防蒸发盖，在培养箱中孵育17至20小时（或过夜）。
  3. 洗板机的设置
    注意：酶标仪洗板机的设置说明由制造商提供，以下简要提及各步骤。每次启动冲洗需约150 mL溶液。
    1. 用含有1% Tween 20的70%乙醇预冲洗洗涤系统。
    2. 用含1% Tween 20的去离子水预冲洗洗涤系统。
    3. 用FACS洗涤缓冲液预冲洗洗涤系统。
  4. 表面抗原染色
    1. 配制含有抗TCRβ、抗CD4、抗CD8和抗CD69抗体的抗体染色混合液。将抗体用FACS洗涤缓冲液按1:100（v/v）的比例稀释。
    2. 使用自动化层流洗涤系统，每次用 55 µL FACS 洗涤缓冲液，洗涤 9 次。
      注意：洗涤结束后，每孔将残留 25 µL 液体。
    3. 将细胞重悬于步骤4.4.1中制备的25 µL染色抗体混合液中。
    4. 如果样品来自96孔板（步骤3.3.4），则将细胞重悬于50 µL步骤3.3.1中配制的抗体混合液中，并将样品转移至低体积反应板。此步骤对应于图示中的方法2。 图1A.
    5. 通过微量板轨道摇床振荡混匀，或使用多通道移液器混匀样品，然后在冰上孵育30分钟。
  5. 细胞固定
    1. 使用自动化层流洗涤系统，每次用 55 µL FACS 洗涤缓冲液，洗涤 9 次。
    2. 每孔加入 50 µL 固定/透化缓冲液（来自活化型 caspase-3 凋亡检测试剂盒；与步骤 4.6.1 中提到的 10x 透化/洗涤缓冲液及步骤 4.6.2 中的抗 caspase-3 抗体相同）。
    3. 冰上孵育30分钟。
  6. 活化型caspase 3的细胞内染色
    1. 通过将25 mL 10x穿膜/洗涤缓冲液加入225 mL超纯水中，配制1x穿膜/洗涤缓冲液。
    2. 通过将1 mL抗caspase-3抗体加入2 mL 1×破膜/洗涤缓冲液中，配制细胞内活化caspase染色液。抗体与破膜/洗涤缓冲液的比例为1:2。
    3. 用1×透化/洗涤缓冲液预润洗洗涤系统。
    4. 用 1× 破膜/洗涤缓冲液洗涤平板 9 次，每次 55 µL。
    5. 向所有孔中加入25 µL在步骤4.6.2中配制的细胞内caspase染色液。
    6. 通过微量板轨道摇床振荡混匀，或使用多通道移液器混匀样品，然后将样品置于冰上孵育1小时。
    7. 用 1× 破膜/洗涤缓冲液洗涤平板 9 次，每次 55 µL。
    8. 向所有孔中加入 25 µL FACS 洗涤缓冲液。
    9. 充分混匀后，将样品转移至微量滴定管中 通过 移液
    10. 向空孔中再加入 50 µL FACS 洗涤缓冲液，并重复步骤 4.6.9。
    11. 重复步骤 4.6.9 和 4.6.10 两次，直至在微量滴定板管中收集到 200 µL 样品。
      注意：步骤 4.6.10 和 4.6.11 中所述操作的目的是确保从小体积培养板中最大程度地回收细胞。如果无需关注细胞数量，在完成步骤 4.6.10 后，可直接用 FACS 洗涤缓冲液将微量离心管中的体积补至 200 µL。
    12. 按照步骤 3.5.11 对样品进行流式细胞术分析，并使用 FACS 分析程序分析结果。在包含 CD4 的门内分析 Caspase-3 活化和 CD69 表达+CD8+DP 胸腺细胞

结果

筛选实验的流程总结见图1A。首先对激酶抑制剂进行筛选，评估其对胸腺细胞存活率的潜在影响。为诱导凋亡，使用地塞米松作为促凋亡试剂，作为阳性对照。活细胞群体的设门依据未经处理的阴性对照以及地塞米松处理的阳性对照确定（图1B）。抑制剂首先以10 µM浓度作用于胸腺细胞，孵育18小时后测定活细胞百分比。设定20%的细胞死亡窗口，即与DMSO处理的样本相比，若化合物导致活细胞门内细胞损失超过20%，则需在更低浓度下进一步测试（图1B）。部分经抑制剂处理样本的代表性流式细胞术图示用于说明存活率检测结果。LY294002（2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；CAS 154447-36-6），一种PI3K抑制剂22，在10 µM时未显著增加细胞死亡，因此在后续实验中采用10 µM浓度。CAY10626（N-[2-(二甲氨基)乙基]-N-甲基-4-[[[[4-[4-(4-吗啉基)-7-(2,2,2-三氟乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基]苯基]氨基]羰基]氨基]-苯甲酰胺；CAS 1202884-94-3），一种PI3Kα/mTOR双靶点抑制剂23，在10 µM和1 µM时诱导高水平细胞死亡，但在0.1 µM时无此效应，因此确定0.1 µM为适用于后续实验的合适浓度。星形孢菌素（2,3,10,11,12,13-六氢-10R-甲氧基-9S-甲基-11R-甲氨基-9S,13R-环氧-1H,9H-二吲哚[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]吡咯并[3,4-j][1,7]苯并二氮杂卓-1-酮；CAS 62996-74-1），一种广谱蛋白激酶C抑制剂，已知具有诱导凋亡的能力24，在所有测试浓度下均引起显著细胞死亡，即使在0.1 µM时亦如此。因此在后续实验中将其以0.1 µM浓度用作额外的阳性对照。

抑制剂的终浓度选择依据为：在不使细胞死亡率比DMSO处理组高出20%以上的前提下所能使用的最高浓度。在确定抑制剂的终浓度后，制备了抑制剂储备板，使所有抑制剂的浓度均为作用于细胞时浓度的500倍。图1C展示了该储备板的孔板布局及抑制剂的终浓度。在替代方案中，细胞直接在小体积板中孵育以进行层流冲洗实验，由于使用小体积液体，需要对抑制剂进行进一步稀释。为确保加入抑制剂后培养体系中的DMSO含量不会对细胞造成过高毒性，将抑制剂用完全RPMI培养基进一步稀释5倍，使其浓度达到作用于细胞时浓度的100倍。

将抑制剂稀释至无毒浓度后，用于检测TCR刺激诱导的胸腺细胞凋亡5,17。刺激过程采用抗CD3/CD28磁珠处理18小时，随后对CD4+和CD8+双阳性（DP）胸腺细胞群体进行caspase-3活化染色（图2）。与未刺激样本相比，在抗CD3/CD28刺激组以及DMSO模拟处理的抗CD3/28刺激组中，均观察到caspase-3活化和CD69表达升高，同时伴有TCR下调现象。地塞米松处理组表现出caspase-3活化增加，且不依赖于CD69上调，这符合其诱导凋亡的作用机制独立于TCR刺激的预期。

图3A总结了针对选定抑制剂的文库筛选实验结果。由于表达受到抑制，caspase-3活化和CD69均可用于鉴定潜在的感兴趣抑制剂。正如预期，TCR信号通路经典介质的抑制剂在筛选中呈阳性结果。这些抑制剂表现出不同程度的抑制效力，包括靶向多种激酶的广谱抑制剂以及更具特异性的抑制剂。部分抑制剂能够同时抑制caspase-3活化和CD69上调（图3B，顶行，左侧面板）。其中一种抑制剂为双吲哚马来酰亚胺II（3-(1H-吲哚-3-基)-4-[1-[2-(1-甲基-2-吡咯烷基)乙基]-1H-吲哚-3-基]-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS 137592-45-1），该化合物除蛋白激酶A和PDK1外，还可抑制所有蛋白激酶C亚型25,26,27。本类别中的另一种抑制剂是CAY10657（3-[(氨甲酰基)氨基]-5-[4-(4-吗啉代甲基)苯基]-2-噻吩甲酰胺；CAS 494772-86-0），据称可抑制IKK228。

某些化合物可抑制 CD69 的上调，但并不影响 caspase-3 的活化（图 3B，上排，右侧面板）。CAY10626（PI3Kα 和 mTOR 的抑制剂23）以及 U-0126（2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈；CAS 109511-58-2，一种 MEK 抑制剂29）是其中鉴定出的部分抑制剂。结果表明，靶向 TCR 信号通路中特定分支的不同激酶（尤其是靶向晚期激酶）的多种抑制剂，可导致 T 细胞活化现象的选择性受损。

还存在一些抑制剂未能同时抑制 CD69 上调和 caspase-3 激活（图 3B，底行，左侧面板）。紫杉醇（βS-(苯甲酰氨基)-αR-羟基-苯基丙酸，(2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-双(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-4,11-二羟基-4a,8,13,13-四甲基-5-氧代-7,11-亚甲基-1H-环癸[3,4]苯并[1,2-b]氧杂环丁-9-基酯；CAS 33069-62-4），一种微管动力学破坏剂30，以及坏死抑制素-5（2-[[3,4,5,6,7,8-六氢-3-(4-甲氧基苯基)-4-氧代[1]苯并噻吩[2,3-d]嘧啶-2-基]硫代]-乙腈；CAS 337349-54-9），一种 RIP1 激酶抑制剂31，是被鉴定属于此类别的两种抑制剂。在 CD69 上调和 caspase-3 激活未受抑制的情况下，其原因可能是这些抑制剂并未靶向 TCR 信号通路中的相关激酶。

如前所述，在筛选中使用了星形孢菌素（staurosporine），其浓度仍可诱导胸腺细胞发生凋亡。正如预期，经星形孢菌素处理的样本显示出高水平的caspase-3活化（图3B，底行，右列）。CD69表达水平较低可归因于星形孢菌素对蛋白激酶C（PKC）的抑制作用，因为另一种广谱PKC抑制剂双吲哚马来酰胺II（bisindolylmaleimide II）同样抑制了CD69的表达。或者，星形孢菌素可能在细胞上调CD69表达之前即已诱导其发生凋亡。

为提高该方案的通量和自动化程度，采用自动化板洗系统进行平行操作 通过 层流已制备完成。采用该自动化板洗仪尝试并比较了两种独立的实验方案，与传统的在96孔板中培养细胞并通过依赖离心的染色方案进行操作的方法相对照。其中一种方法涉及按照标准操作在96孔板中培养细胞，随后将细胞转移至适用于自动化板洗仪的板中进行染色步骤（图4，DA-洗涤样本）。另一种方法是将细胞直接在适用于板式洗涤仪的板中培养，并在同一块板上继续进行染色实验步骤（图 4，DA-培养样本）。与传统的离心依赖性方案相比，离心非依赖性方案在不同样本中检测活性caspase-3、CD69或TCRβ染色时，未表现出明显的可察觉差异。图4染色强度的差异可归因于染色步骤中使用的抗体浓度略有不同。

激酶抑制剂筛选；流式细胞术数据；实验设置示意图；浓度分析。
图1：经抑制剂处理后胸腺细胞的存活率。（A）筛选实验中主要步骤的实验流程图。激活实验中胸腺细胞刺激与染色有三种建议方法：（1）在标准96孔板中培养胸腺细胞，随后采用基于离心的传统洗涤染色流程；（2）在标准96孔板中培养胸腺细胞，随后采用无需离心的洗涤染色流程；（3）在小体积孔板中培养胸腺细胞，随后在同一孔板中采用无需离心的洗涤染色流程。（B）存活率检测中的设门策略。活细胞门控依据前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）图确定，方法如前所述17。在测试浓度下被认为毒性过高的抑制剂，进一步在低10倍的浓度下进行存活率检测。图中显示代表性经抑制剂处理的样本。注意1 µM与0.1 µM样本所共用的对照（DMSO处理 [DMSO]）。（C）稀释后抑制剂的板式布局。示意图展示将抑制剂用DMSO稀释至目标终浓度500倍浓度的板孔分布。每孔对应一种独特抑制剂；灰色孔为空孔。图中所示浓度为加入细胞培养体系后的终浓度，分别为10 µM（深红色）、1 µM（品红色）和0.1 µM（蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。

ELISA 板实验；CD4/CD8、CD69、ActCasp3 表达及抑制剂效应的流式细胞术结果。
图 2：胸腺细胞激活实验的板式布局。（上图）第 1 列和第 12 列用于对照，第 2 至第 11 列为经抑制剂处理的样本（米色）。阴性对照（未刺激 [NS]；灰色）位于 A1 至 D1 孔，细胞死亡阳性对照（地塞米松处理 [DEX]；紫色）位于 E1 至 H1 孔。第 2 至第 12 列包含经抗 CD3/CD28 磁珠刺激的胸腺细胞。胸腺细胞激活的阳性对照（刺激样本 [α-CD3/CD28]；绿色）位于 A12 至 D12 孔，溶剂对照（刺激并经 DMSO 处理 [α-CD3/CD28 + DMSO]；红色）位于 E12 至 H12 孔。（下图）在双阳性（DP）门内圈选的胸腺细胞中，活化型半胱天冬酶-3（ActCasp3）、CD69 和 TCRβ 染色的流式细胞术图谱。展示了不同对照组的代表性图谱。NS = 未刺激样本；DEX = 地塞米松处理样本；α-CD3/CD28 + DMSO = 经 CD3/CD28 包被磁珠刺激并用 DMSO 处理的样本；α-CD3/CD28 = 经 CD3/CD28 包被磁珠刺激的样本。请点击此处查看该图的放大版本。

经处理细胞中 CD69 和活化半胱天冬酶-3 标记物表达的流式细胞术分析图
图 3：胸腺细胞激活过程中抑制剂文库的筛选结果。（A）激活实验的汇总数据。这些结果来自一次代表性实验，展示了所选抑制剂处理下活化半胱天冬酶-3阳性及CD69阳性细胞的归一化数值。归一化方法是将活化半胱天冬酶-3阳性或CD69阳性细胞群的百分比与DMSO处理对照组的值进行比较，图中将对照组设为相对值0。（B）所选流式细胞术（FACS）图。抑制剂对活化半胱天冬酶-3表达和CD69上调均有抑制作用（左上）、仅抑制CD69上调（右上），或对两者均无影响（左下）的流式图。右下图为经星形孢菌素处理的样本图，用于展示在毒性浓度下使用抑制剂所产生的效应。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术分析 TCRβ 与活化型半胱天冬酶-3（ActCasp3）和 CD69，显示细胞凋亡与活化结果。
图 4：不同检测方案的比较。 采用三种不同检测方案处理后，对双阳性（DP）胸腺细胞进行活化型半胱天冬酶-3（ActCasp3）、CD69 和 TCRβ 染色的流式细胞术图谱。共测试四种不同条件，分别为阴性对照（未刺激 [NS]）、细胞死亡阳性对照（地塞米松处理 [DEX]）、溶剂对照（刺激并二甲基亚砜 [DMSO] 处理 [α-CD3/CD28 + DMSO]）以及抑制剂处理样本（刺激并 PIK-75 处理 [α-CD3/CD28 + PIK-75]）。常规方法 = 在标准 96 孔板中培养胸腺细胞，并采用基于离心的传统染色流程；DA-洗涤 = 在标准 96 孔板中培养胸腺细胞，并采用层流冲洗染色流程；DA-培养 = 在小体积孔板中培养胸腺细胞，并在同一孔板中采用层流冲洗染色流程。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

此处提出的筛选策略不仅评估小分子抑制剂在刺激后抑制胸腺细胞凋亡效应的能力，还结合了T细胞活化更常规的标志物——CD69上调和TCR下调。此外，还可加入其他标志物，以实现对不同胸腺细胞亚群的分析。32当前检测方法的一个有趣之处在于，那些抑制TCR信号传导的抑制剂同样会减弱凋亡的诱导，从而进一步凸显出这些抑制剂在诱导细胞死亡方面可能具有的TCR非依赖性效应。此外，基于流式细胞术的检测方法可利用多种读出指标作为不同的活化标志物，从而报告抑制剂对TCR信号通路中各个独立分支的影响。在本案例中，某些抑制剂对caspase-3活化和CD69上调表现出差异性抑制作用。由于某些化合物可能影响细胞基本生命活动，如蛋白质合成或囊泡运输，因此观察到其对CD69上调等过程产生影响并不意外。 从头合成 合成标记物（例如， CD69），但不涉及翻译后修饰（例如， caspase-3 的蛋白水解激活.

由于本实验以细胞凋亡作为检测指标，因此必须确保抑制剂的潜在毒性效应不会干扰实验结果。例如，在筛选过程中，尽管1 nM浓度下星形孢菌素仍对细胞具有毒性，但我们并未将其进一步稀释。代表性结果与星形孢菌素作为一种广谱激酶抑制剂并可诱导细胞凋亡的特性一致33。若未将测试化合物充分稀释至无毒浓度，则有可能遗漏潜在的阳性结果。

由于获取足量胸腺细胞用于高通量筛选存在困难，此处详述的筛选策略难以应用于人类。然而，可通过小儿心脏活检34,35或胎儿组织36,37获得人类胸腺样本。尽管如此，由于TCR信号通路及信号蛋白的氨基酸序列在小鼠与人类之间高度保守，胸腺细胞检测仍可作为一种有效的初步筛选策略，且利用小鼠胸腺细胞在此检测中获得的任何结果，均可进一步在原代人类淋巴细胞中加以验证。

传统依赖离心的实验方案存在一个局限性，即可能导致细胞丢失，这可归因于该过程的多步骤特性，包括细胞通透化和离心等步骤。每一次离心和重悬操作都不可避免地造成细胞损失。尽管此类损失在处理少量样本的研究中可能并不关键，但在高通量筛选中应用时可能成为问题，尤其是当检测体系从小孔板（如96孔）向中高密度孔板（如384孔和1536孔）发展时。解决这一问题的一种方法是使用可穿透细胞膜的荧光半胱天冬酶（caspase）探针38，这类探针能够在避免细胞通透化处理及多次洗涤步骤所带来的复杂性的同时，实现对caspase激活的检测5。另一种可行策略是采用不依赖离心的层流洗涤方法来减少细胞损失。通过自动化洗板仪结合无壁微孔板，可在无需离心的情况下利用层流对细胞进行清洗。试剂的指数级稀释使得细胞在不到3分钟内即可完成彻底而高效的冲洗，其稀释效果相当于两次离心洗涤。由于不存在由离心引起的外部应力，细胞活力更高，细胞损失也得以最小化。

我们还探索了在96孔U型底板中培养胸腺细胞后使用自动洗板机的可能性，以及直接在适用于自动洗板机的无壁培养板中进行细胞培养的可行性。在无壁培养板中培养细胞可完全省去所有离心步骤，并因无需在不同培养板之间转移样品而最大限度地减少细胞损失。总体而言，这三种不同方案在刺激效率和染色效果方面具有可比性。自动洗板机具有自动化、速度快和效率高的优势，更有利于高通量分析。此外，随着自动化程度的提高，洗涤步骤可更快完成，且不同实验或操作者之间的实验一致性也更高。然而，洗板机也存在一些缺点：每次更换洗涤缓冲液时需要大量缓冲液用于灌注（每次150 mL，其中50 mL用于洗涤）；由于小体积培养板的孔间分隔有限，在操作培养板时需格外小心以避免孔间交叉污染；洗涤后每孔残留25 µL缓冲液，因此必须使用浓度高于1x的试剂。为解决残留体积及培养板体积容量有限的问题，可加装附件将孵育体积从70 µL扩展至150 µL，从而便于采用常规实验方案。尽管目前已有自动化的培养板处理系统，但其占用空间显著大于层流洗板系统（后者为约1立方英尺（~0.028 m3）的小型设备）。此外，在自动化培养板处理系统中整合离心功能具有挑战性，限制了其在细胞洗涤中的应用。据我们所知，目前尚无其他无需离心的细胞洗涤仪器可用。

此处介绍的筛选策略能够鉴定出影响 TCR 信号传导和 T 细胞活化的小分子及其假定靶向的激酶。本研究所用文库主要包含激酶的小分子抑制剂，已成功获得多个潜在有意义的阳性 hits。该实验方案也可便捷地应用于其他酶类的抑制剂文库或其他类型的小分子文库，以及其它化合物文库例如, 各种大分子）。该方案还可用于筛选其他细胞类型，例如外周T淋巴细胞或永生化细胞，包括表达转基因TCR或携带报告系统的细胞。鉴定和表征T细胞信号传导的新介质，有助于加深我们对信号通路的理解，并推动免疫相关疾病靶向治疗的发展。13,14,15,16总之，本研究扩展了可用于检测T细胞信号转导介质的方法选择范围。 通过 高通量筛选实验

披露

作者 Chyan Ying Ke 是 Curiox Biosystems 的员工，该公司生产本文中使用的 DA-cell 洗板仪和 DA-cell 培养板。

致谢

本工作获得了新加坡卫生部国家医学研究理事会（NMRC CBRG15may017）以及新加坡教育部（2014-T2-1-136）资助（资助对象：N.R.J.G.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMIHyCloneSH30027FS
FBSHyCloneSH3007103
L-谷氨酰胺HyCloneSH3003401
丙酮酸钠HyCloneSH3023901
青霉素/链霉素HyCloneSV30010
β-巯基乙醇Sigma Aldrich516732 
10X PBSVivantisPB0344 – 1L
激酶筛选文库（96孔）Cayman Chemical10505文库具体成分可能有所变化
DMSOSigma AldrichD2650
地塞米松Sigma AldrichD4902 
抗CD3/CD28磁珠Thermo Fisher Scientific11452D
FITC活性Caspase-3凋亡检测试剂盒BD Pharmingen550480包含固定/透化缓冲液、10X透化/洗涤缓冲液及抗caspase-3抗体
DA-细胞清洗仪CURIOXHT1000
96孔DA-细胞板CURIOX96-DC-CL-05
抗体
CD3eBioLegend100236
TCRbBD Biosciences553174
CD4BD Biosciences740007
CD8BD Biosciences563786
CD69eBioscience25-0699-42
抑制剂
TG003Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PKC 412Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
多拉替尼Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
紫杉醇Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
厄洛替尼Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
坏死抑制素-5Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
NVP-BEZ235Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
邻苯二甲酰亚胺吡唑Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-879Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
1-NA-PP1Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
Torin 1Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
双吲哚马来酰亚胺IICayman Chemical-来自激酶筛选文库
BIBF 1120Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SMI-4aCayman Chemical-来自激酶筛选文库
双吲哚马来酰亚胺XI（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10657Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AS-703026Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
氯化小檗碱Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
衣霉素Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
GSK 1059615Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
鲁索利替尼Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
坏死抑制素-1Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SB 505124Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
INK128Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
卡奈替尼（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SB 431542Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PD 173074Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
丙戊酸（钠盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PD 0325901Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SB 203580Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
VX-702Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
大黄素Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CHIR99021Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
BIOCayman Chemical-来自激酶筛选文库
伊马替尼（甲磺酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
舒尼替尼苹果酸盐Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
吉非替尼Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PP2Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
3-甲基腺嘌呤Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
双吲哚马来酰亚胺ICayman Chemical-来自激酶筛选文库
双吲哚马来酰亚胺IVCayman Chemical-来自激酶筛选文库
双吲哚马来酰亚胺VCayman Chemical-来自激酶筛选文库
NSC 663284Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
D 4476Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
NU 7026Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
H-9（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
靛红-3'-单肟Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
KN-62Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
KN-93Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CGP 57380Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
异-羟基鸢尾素Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
(S)-甘氨酰-H-1152（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
双吲哚马来酰亚胺VIII（乙酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
ST638Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SU 6656Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
LY364947Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SB 203580（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10621Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
YM-201636Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
ZM 447439Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AS-041164Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
NVP-AEW541（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PP242Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
ABT-869Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10622Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
17β-羟基渥曼宁Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10626Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SU 6668Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10572Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
N,N-二甲基鞘氨醇Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
LY294002Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
U-0126Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
星形孢菌素Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
KN-92（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AS-605240（钾盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
O-1918Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
Y-27632（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
柳胺Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PD 98059Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PD 169316Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
TGX-221Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
(S)-H-1152（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AS-605240Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
D-赤式-鞘氨醇C-18Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
OSU03012Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
JNJ-10198409Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
柳胺（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
花生四烯酸柳胺Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
月桂酸柳胺Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AS-252424Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10505Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PI-103Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PIK-75（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
鞘氨醇激酶抑制剂2Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
紫檀芪Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SC-1Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
(R)-洛伐他汀Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
BAY-43-9006Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10561Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AS-604850Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PI3-激酶 α 抑制剂2Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
ML-9Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
曲西立滨Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
erbstatin类似物Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
肯帕乌龙Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
羟基鸢尾素Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-494Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-825Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-1478Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SB 216763Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SB 415286Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-17Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
H-8（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
LFM-A13Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SC-514Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
芹菜素Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-18Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10554Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
DRBCayman Chemical-来自激酶筛选文库
RG-13022Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
RG-14620Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-490Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-82Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-99Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-213Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-183Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
蓝靛玉红素CCayman Chemical-来自激酶筛选文库
ZM 336372Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
5-碘代管胞菌素Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SB 202190Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10571Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
尼洛替尼Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
SP 600125Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
L-苏式-鞘氨醇C-18Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
H-89Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
HA-1077（盐酸盐）Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-370Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
渥曼宁Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
AG-1296Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
KT 5823Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
Janex 1Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10574Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10575Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10576Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
NH125Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
TWS119Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
NSC 210902Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10577Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CAY10578Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
PD 184161Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
CCT018159Cayman Chemical-来自激酶筛选文库
杨梅素Cayman Chemical-来自激酶筛选文库

参考文献

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