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Immunology and Infection

रासायनिक अवरोधक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के माध्यम से टी सेल रिसेप्टर संकेतन के मध्यस्थों की पहचान

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58946
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 1,4
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Singapore Immunology Network, A*STAR, 3Curiox Biosystems, 4Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit (KU) Leuven
* These authors contributed equally

Summary

इस कागज एक प्रवाह का उपयोग करता है-cytometry आधारित परख के लिए अवरोधकों की पहचान के लिए रासायनिक अवरोधकों की स्क्रीन पुस्तकालयों और उनके लक्ष्य है कि प्रभाव टी सेल रिसेप्टर संकेतन । यहां वर्णित तरीकों को भी उच्च प्रवाह की जांच के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।

Abstract

टी सेल रिसेप्टर (TCR) मार्ग संकेत मध्यस्थों की एक भीड़ है कि TCR के सक्रियण पर संकेत संचारित शामिल हैं । विभिन्न रणनीतियों का प्रस्ताव किया गया है और TCR संकेतन के नए मध्यस्थों की पहचान के लिए लागू है, जो सक्रियण और thymic चयन सहित टी-सेल प्रक्रियाओं की समझ में सुधार होगा. हम एक स्क्रीनिंग परख का वर्णन है कि अणुओं की पहचान है कि प्रभाव TCR thymocytes विकासशील के सक्रियकरण के आधार पर संकेतन सक्षम बनाता है । मजबूत TCR संकेतों के कारण विकासशील thymocytes एक नकारात्मक चयन के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में अपोप्तोटिक मशीनरी को सक्रिय करने के लिए । कळेनासे अवरोधकों के आवेदन के माध्यम से, उन लक्ष्यों के साथ जो TCR संकेतन को प्रभावित करने के लिए नकारात्मक चयन की प्रक्रिया को ओवरराइड करने में सक्षम हैं । इस पत्र में विस्तृत विधि TCR संकेतन रास्ते में स्थापित भूमिकाओं के साथ विहित kinases के अवरोधकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और भी नए kinases के अवरोधकों अभी तक TCR संकेतन रास्ते में स्थापित किया जाना है । स्क्रीनिंग रणनीति यहां TCR संकेतन में उपंयास druggable लक्ष्य की पहचान के लिए उच्च प्रवाह के स्क्रीन के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

टी कोशिकाओं लिम्फोसाइटों की एक वंश है कि अनुकूली उन्मुक्ति के रखरखाव में एक निर्णायक भूमिका निभा रहे हैं । वे TCR, जो उंहें अपने लाइगैंडों पहचान करने के लिए सक्षम बनाता है एक्सप्रेस, एक बड़े histocompatibility जटिल अणु (MHC) के साथ एक बाध्य पेप्टाइड, जो प्रतिजन की सतहों-पेश कोशिकाओं (APCs) पर पाए जाते है से मिलकर जटिल । TCR/MHC बातचीत के माध्यम से TCR संकेतन मार्ग के ट्रिगर टी सेल सक्रियकरण और विकास के लिए महत्वपूर्ण है1।

टी सेल विकास में, अस्थि मज्जा-व्युत्पंन टेम स्टेम सेल (HSCs) थाइमस, जहां वे भेदभाव से गुजरना और टी सेल वंश प्रगति2के चरणों के माध्यम से जाने के लिए विस्थापित । डबल-पॉजीटिव (DP) thymocytes, दोनों CD4 और सीडी 8 coreceptors को व्यक्त करते हुए, MHC पर स्व-पेप्टाइड/APCs के साथ संलग्न करें । अपने स्वयं के लिए एक उदारवादी संबंध के साथ Thymocytes-पेप्टाइड/MHC लाइगैंडों परिपक्व बनने के लिए सिंगल पॉजिटिव (सपा) CD4 या सीडी 8 Thymocytes, एक प्रक्रिया सकारात्मक चयन के रूप में पद । इसके विपरीत, thymocytes कि स्व के माध्यम से अत्यधिक TCR उत्तेजना प्राप्त पेप्टाइड/MHCs से गुजरना apoptosis के माध्यम से नकारात्मक चयन3,4। उत्तेजना प्रेरित, caspase-निर्भर apoptosis की इस प्रक्रिया thymocytes उत्तेजक द्वारा इन विट्रो में नकल उतारा जा सकता है, उदाहरण के लिए विरोधी के साथ CD3/28 एंटीबॉडी-लेपित मोती5। चयन प्रक्रिया पास करने वाली परिपक्व टी कोशिकाओं APCs से परिधि में गैर-स्व-पेप्टाइड/MHC लाइगैंडों द्वारा सक्रिय किए जाते हैं । स्व-पेप्टाइड/MHCs अभी भी परिधीय टी कोशिकाओं के लिए प्रासंगिक है, अस्तित्व और समस्थिति प्रसार के लिए संकेतन टॉनिक के संदर्भ में, सहायक टी कोशिकाओं के भेदभाव, और टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के लिए गैर-स्व पेप्टाइड/MHCs के माध्यम से coagonism6,7,8,9. उच्च-संबध TCR पेप्टाइड/MHC ligand करने के लिए बाइंडिंग कई बहाव संकेतन रास्ते, जो एक जटिल TCR संकेतन नेटवर्क10बनाने के कई संकेतन अणुओं को शामिल सक्रिय करता है । TCR संकेत रास्ते कई दशकों के लिए अध्ययन किया गया है, और अभी तक मार्ग के नए मध्यस्थों की खोज11,12थमी का कोई संकेत नहीं दिखाता है । TCR संकेतन रास्ते के मॉडुलन नैदानिक प्रासंगिकता है और immunotherapeutic अनुप्रयोगों के लिए potentiating टी सेल प्रतिक्रियाओं या प्रतिरक्षा13के नियंत्रण के लिए टी-सेल प्रतिक्रियाओं के निषेध शामिल कर सकते हैं । टी के मॉडुलन के लिए रणनीति-सेल प्रतिक्रियाओं मुख्य रूप से कळेनासे या फॉस्फेट गतिविधि के विघटन पर निर्भर14,15,16.

हम TCR संकेतन और टी-सेल सक्रियण17मिलाना करने की क्षमता के लिए छोटे रासायनिक यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रवाह-cytometry-आधारित परख के एक आवेदन का वर्णन । परख जब मजबूत TCR संकेतों को उजागर thymocytes apoptosis मार्ग को सक्रिय करने की घटना पर टिका है । परख पर्याप्त उत्तेजना शक्ति में परिवर्तन की पहचान के प्रति संवेदनशील है; ट्रांसजेनिक TCR के साथ पेप्टाइड/MHC tetramers के साथ thymocytes व्यक्त करने के साथ बढ़ती समानता caspase में एक इसी वृद्धि के परिणामस्वरूप सक्रियण-अपोप्तोटिक प्रतिक्रिया5के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया । स्क्रीन के लिए, हम कळेनासे अवरोधकों की एक पुस्तकालय का इस्तेमाल किया और मजबूत TCR संकेतों के लिए thymocyte प्रतिक्रिया मिलाना करने की क्षमता का आकलन.

कई प्रवाह-cytometry-आधारित या प्रतिदीप्ति रिपोर्टर-आधारित रणनीतियाँ विभिन्न टी-सेल सबसेट में परिधीय सक्रियण phenotypes का एक वर्गीकरण का उच्च-प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए वर्णन किया गया है । इस तरह की रणनीतियों आनुवंशिक फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग करने के लिए समय और टी के परिमाण-सेल सक्रियकरण18, साइटोटोक्सिक टी के एक readout के रूप में दानेदार का उपयोग सेल गतिविधि19,20, और का विश्लेषण शामिल सेलुलर सिग्नलिंग में शामिल विभिन्न प्रोटीन्स की फास्फारिलीकरण21.

स्क्रीनिंग परख यहां प्रस्तुत सफलतापूर्वक यौगिकों कि TCR संकेतन मार्ग के विहित अणुओं को बाधित की पहचान करने में सक्षम है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में क्षमता, TCR संकेत पर निरोधात्मक प्रभाव के साथ उपंयास यौगिकों । उदाहरण के लिए, हम नए यौगिकों को प्रभावित करने के रूप में GSK3β और Hsp90 के अवरोधकों की पहचान की टी-सेल प्रतिक्रियाओं17. परख अवरोधकों कि संकेत transduction के साथ हस्तक्षेप, अपोप्तोटिक प्रतिक्रिया में कमी के कारण, TCR-सेलुलर विषाक्तता पर अवरोधकों के स्वतंत्र प्रभाव से भेद करने में सक्षम है । apoptosis के प्रेरण के अलावा, हम भी CD69 के विनियमन और सक्रियण के मार्कर के रूप में TCR downregulation उपाय । के रूप में TCR संकेत नेटवर्क जटिल हैं, एकाधिक readouts का उपयोग एक ही मार्ग पर विशिष्ट प्रभाव के साथ अणुओं की खोज की संभावना बढ़ सकती है । यहां, हम भी एक उच्च प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए तैयार करने में कोशिकाओं के धुंधला के दौरान मूल प्रोटोकॉल के लिए विकल्प के रूप में एक केंद्रापसारक-स्वतंत्र प्रोटोकॉल का उपयोग परिचय । इस पत्र में वर्णित परख कळेनासे अवरोधकों की एक छोटी सी यौगिक पुस्तकालय का उपयोग करता है, लेकिन सिद्धांत रूप में, यह उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विकल्प के पुस्तकालय भी अवरोधकों या अंय अणुओं की एक किस्म को शामिल कर सकते हैं ।

Protocol

इस अध्ययन में 6-से 8 सप्ताह की आयु वाले पुरुष और महिला C57Bl/6 चूहों का प्रयोग किया गया । चूहों पशु सुविधा में सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय (सिंगापुर) में नस्ल थे । सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) सभी पशु प्रयोग को मंजूरी दे दी ।

1. Thymocyte निलंबन की तैयारी

  1. एक सह2 चैंबर में चूहों Euthanize ।
  2. सेल संस्कृतियों के किसी भी संक्रमण से बचने के लिए एक ऊतक संस्कृति हूड में बाद के चरणों का प्रदर्शन । विच्छेदन बोर्ड के लिए माउस लोथ सुरक्षित, पिन का उपयोग कर, और ७०% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे ।
  3. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, ventral ओर एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाने, जबड़े की ओर पेट से शुरू. हिंद पैरों में से प्रत्येक के साथ आगे चीरा बनाओ । रिब पिंजरे बेनकाब करने के लिए त्वचा खिंचाव और यह पिन नीचे ।
  4. डायाफ्राम काट और कैंची की एक जोड़ी के साथ पीछे छोर से रिब पिंजरे के दोनों ओर । रिब पिंजरे लिफ्ट और यह नीचे पिन करने के लिए थाइमस बेनकाब । संयोजी ऊतक थाइमस से जुड़े अलग और घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर थाइमस निकालने ।
  5. एक अच्छी तरह से 6 पूरी RPMI मीडिया के 5 मिलीलीटर युक्त थाली के एक कुआं में थाइमस प्लेस ।
    नोट: जोड़ने पर विचार करें 10% चारकोल-छीन भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) मीडिया के लिए thymocyte व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए अगर एक लंबे समय प्रतीक्षा विच्छेदन और उत्तेजना परख के बीच की उंमीद है ।
  6. धीरे थाइमस मैश, एक सिरिंज के कुंद अंत का उपयोग कर, और एक ७० µ मीटर सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को पारित । वैकल्पिक रूप से, एक स्वस्थ हालत में thymocytes इकट्ठा करने के लिए, थाइमस निचोड़ और thymic उपकला से बाहर प्रवाह है कि thymocytes इकट्ठा करने के लिए संदंश के दो जोड़े का उपयोग करने पर विचार करें.
  7. एक hemocytometer या किसी भी स्वचालित सेल गिनती साधन का उपयोग कर, गिनती सेल के लिए आगे बढ़ें ।

2. विषाक्त सांद्रता के लिए कळेनासे अवरोधकों के अनुमापन

नोट: यह खंड टी-सेल सक्रियण स्क्रीन में उपयोग के लिए अवरोधकों की तैयारी पर केंद्रित है । उच्च सांद्रता में इस्तेमाल किया अवरोधकों कोशिका मृत्यु, जो टी सेल सक्रियण स्क्रीन के एक readout है पैदा कर सकता है । अवरोधकों के कमजोर पड़ने की श्रृंखला के लिए व्यक्तिगत अवरोधकों कि TCR उत्तेजना के apoptosis स्वतंत्र पैदा नहीं करना चाहिए की अंतिम एकाग्रता निर्धारित करना है । इस अध्ययन में प्रयुक्त कळेनासे अवरोधकों की लाइब्रेरी एक बाहरी विक्रेता से खरीदी गई थी. अवरोधकों की सूची सामग्री की तालिकामें शामिल है ।

  1. कम सांद्रता पर कळेनासे अवरोधकों की प्लेट की तैयारी
    1. 1 मिमी में अवरोधकों की एक थाली तैयार करने के लिए, सभी अवरोधकों के लिए dimethyl sulfoxide (DMSO) के ९० µ एल के लिए अवरोधकों के 10 µ एल जोड़ें ।
      नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त छोटे-अणु पुस्तकालय से अवरोधकों 10 मिमी के एक शेयर एकाग्रता पर आते हैं. यदि अवरोधकों एक गोली के रूप में कर रहे हैं, आपूर्तिकर्ताओं से अनुशंसित पुनर्गठन चरणों का पालन करें । अवरोधकों 10 मिमी पर प्रदान नहीं कर रहे हैं, बजाय वैकल्पिक उचित सांद्रता पर अवरोधक प्लेटें तैयार है, और एक उपयुक्त कमजोर पड़ने कारक के साथ अवरोधकों के अलग धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करते हैं ।
      सावधानी: विषाक्त अवरोधकों के मामलों में, सुरक्षित हैंडलिंग और निपटान पर निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    2. ०.१ mm पर अवरोधकों की एक थाली तैयार करने के लिए, 1 मिमी अवरोधकों की थाली से अवरोधकों के 10 µ एल जोड़ें DMSO के ९० µ एल.
    3. ०.०१ मिमी पर अवरोधकों की एक थाली तैयार करने के लिए, DMSO के ९० µ एल के लिए ०.१ mm अवरोधकों की थाली से अवरोधकों के 10 µ एल जोड़ें ।
  2. कळेनासे अवरोधकों के साथ thymocytes का उपचार
    1. धारा 1 के अनुसार thymocyte सस्पेंशन तैयार करें ।
    2. पतला thymocytes पूर्ण RPMI में 5 x 106 कोशिकाओं के एक thymocyte निलंबन प्राप्त करने के लिए/
    3. एक ९६-well प्लेट के सभी कुओं के लिए thymocyte निलंबन के २०० µ एल जोड़ें, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर ।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से, 1 mM अवरोधकों (अवरोधकों के अंतिम एकाग्रता 10 µ एम है) युक्त प्लेट की इसी अच्छी तरह से अवरोधकों के 2 µ एल जोड़ें ।
    5. एक ही थाली में, अनुपचारित नियंत्रण के चार कुओं तैयार, 5 µ एम डेक्समेतएसॉनी के चार कुओं-इलाज सकारात्मक नियंत्रण, और वाहन के चार कुओं नकारात्मक नियंत्रण इलाज, DMSO के 2 µ एल जोड़कर ।
    6. एक ३७ ° c, 5% सह 17-20 घंटे के लिए2 मशीन में thymocytes मशीन (या रात भर) ।
  3. व्यक्तिगत अवरोधकों के उपयुक्त सांद्रता का निर्धारण
    1. ३०० x g और 4 ° c पर thymocytes की प्लेट स्पिन, 5 मिनट के लिए FACS वॉश बफर के २५० µ एल में कोशिकाओं resuspend ।
    2. नमूने का प्रवाह cytometric विश्लेषण चलाएं और प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रोग्राम के साथ परिणामों का विश्लेषण करें ।
    3. FSC-SSC गेटिंग पर आधारित लाइव सेल का प्रतिशत निर्धारित करें । गेटिंग रणनीति चित्रा 1bमें दिखाया गया है ।
    4. DMSO-इलाज नियंत्रणों पर आधारित लाइव कक्षों के प्रतिशत के औसत की गणना करें, जो १००% पर सामान्यीकृत हैं । स्वीकार्य कोशिका मृत्यु की एक मनमानी खिड़की सेट (जैसे, 20%) । रोकता है कि इस खिड़की के नीचे रहने की कोशिकाओं का एक प्रतिशत के परिणामस्वरूप (यानी, DMSO का इलाज नियंत्रण के ८०% से नीचे) को कम सांद्रता पर फिर से परीक्षण किया जा रहे हैं ।
    5. अवरोधकों कि कदम 2.3.4 में व्यवहार्यता मानदंड पारित नहीं किया है के लिए, कदम से कदम 2.2.1-2.3.4 दोहराने, लेकिन ०.१ mm पर अवरोधकों की थाली का उपयोग करें 2.2.4 के बजाय प्लेट 1 मिमी अवरोधकों युक्त । यहां इस्तेमाल किया अवरोधकों के अंतिम एकाग्रता है 1 µ एम ।
    6. अवरोधकों के लिए है कि अभी भी 1 µ मीटर में सेल मौत के उच्च स्तर का उत्पादन, ०.१ µ m. दोहराने चरणों में अवरोधकों का परीक्षण 2.2.1-2.3.4, लेकिन चरण 2.2.4 में ०.०१ mM पर अवरोधकों की थाली का उपयोग करें । यहां इस्तेमाल किया अवरोधकों के अंतिम एकाग्रता ०.१ µ एम है ।
  4. कळेनासे अवरोधकों के एक शेयर प्लेट की तैयारी
    1. 10 µ एम पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए अवरोधकों के लिए, DMSO के 10 µ एल के लिए 10 मिमी अवरोधकों के 10 µ एल जोड़ें.
    2. 1 µ मीटर पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए अवरोधकों के लिए, DMSO के 19 µ एल के लिए 10 मिमी अवरोधकों के 1 µ एल जोड़ें.
    3. ०.१ µ मीटर पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए अवरोधकों के लिए, DMSO (चित्रा 1C) के १९९ µ एल के लिए 10 मिमी अवरोधकों के 1 µ एल जोड़ें.
      नोट: अवरोधकों के तैयार स्टॉक प्लेट thymocyte निलंबन करने के लिए जोड़ा जब इरादा अंतिम एकाग्रता की एकाग्रता 500x है. अवरोधकों की स्टॉक प्लेट पीसीआर स्ट्रिप्स या ९६ में अच्छी तरह से प्लेट्स में तैयार किया जा सकता है ।
    4. कळेनासे अवरोधकों की स्टॉक प्लेट एक पारंपरिक केंद्रापसारक-निर्भर प्रणाली में स्क्रीनिंग के लिए thymocytes करने के लिए लागू किया जा सकता है (धारा 3; चित्रा 1a, 1 तरीकों और 2 देखें) या एक वैकल्पिक केंद्रापसारक में-स्वतंत्र प्रणाली (धारा 4; देखें चित्र 1a, विधि 3) ।

3. कळेनासे अवरोध करनेवाला पुस्तकालय स्क्रीनिंग (पारंपरिक केंद्रापसारक आधारित परख)

  1. कळेनासे अवरोधकों के साथ thymocytes का उपचार
    1. धारा 1 के अनुसार thymocyte सस्पेंशन तैयार करें ।
    2. पतला thymocytes पूर्ण RPMI में 5 x 106 कोशिकाओं के एक thymocyte निलंबन प्राप्त करने के लिए/
    3. एक ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से thymocytes के २०० µ एल जोड़ें, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर । बर्फ पर प्लेट लगाएं ।
    4. ९६-अवरोधक स्टॉक प्लेट की धारा २.४ में तैयार की इसी कुएं से अच्छी तरह से प्लेट को अवरोधकों के ०.५ µ एल जोड़ें ।
    5. अनुपचारित नियंत्रण के आठ कुओं तैयार करते हैं । DMSO के ०.५ µ l को जोड़कर वाहन-स्वास्थ्यकर्मी नियंत्रणों के चार कुओं को तैयार करें. 5 µ एम डेक्समेतएसॉनी-स्वास्थ्यकर्मी नियंत्रण (चित्रा 2) के चार कुओं को तैयार करें ।
  2. thymocytes की उत्तेजना विरोधी CD3/CD28 मोतियों का उपयोग
    1. मोतियों की 1 मिलीलीटर लें और पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ मोतियों को धो लें । एक चुंबकीय खड़े का उपयोग कर मोती अलग और समाधान महाप्राण । पूरा RPMI के 5 मिलीलीटर में मोतियों को फिर से सस्पेंड ।
      नोट: मोतियों का अनुपात कोशिकाओं के लिए 1 २.५ है । मोतियों की मात्रा को समायोजित कुओं की संख्या को उत्तेजित करने के लिए और इस्तेमाल किया thymocytes की संख्या पर निर्भर करता है, लेने के लिए ।
    2. प्रत्येक अवरोध करनेवाला इलाज नमूना, चार DMSO उपचारित नमूनों के लिए मोतियों की ५० µ एल जोड़ें, और आठ अनुपचारित नमूनों में से चार. शेष चार अनुपचारित कुओं को पूर्ण RPMI का ५० µ l जोड़ें. चित्रा 2 थाली के सामान्य लेआउट से पता चलता है.
    3. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर कुओं की सामग्री को मिलाएं ।
    4. एक ३७ ° c, 5% सह 17-20 घंटे के लिए2 मशीन में thymocytes मशीन (या रात भर) ।
  3. सतह एंटीजन का धुंधला
    1. एंटी-TCRβ, एंटी-CD4, एंटी-सीडी 8, और एंटी-CD69 एंटीबॉडी युक्त एक एंटीबॉडी धुंधला मिश्रण तैयार करें । FACS वॉश बफर में एंटीबॉडी पतला (पंजाब 1:200 के अनुपात में ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन [BSA]) के साथ पूरक (v/
      नोट: एंटीबॉडी titers धुंधला के लिए इस्तेमाल किया अनुकूलन पर विचार करें, बजाय तय एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का उपयोग कर के, विभिन्न प्रयोगों के पार धुंधला में भिन्नता को कम करने के लिए और संकेत करने के लिए शोर अनुपात में सुधार.
    2. 5 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c, पर थाली स्पिन ।
    3. हल छोड़ने के लिए प्लेट को फ़्लिक करें ।
    4. इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल पारंपरिक केंद्रापसारक पर निर्भर प्रोटोकॉल का पालन कर सकते है (3.3.5 कदम आगे बढ़ना; चित्रा 1a, विधि 1 देखें) या वैकल्पिक केंद्रापसारक-स्वतंत्र प्रोटोकॉल (कदम 4.4.4 के लिए आगे बढ़ना; चित्र 1aदेखें, विधि 2).
    5. ७५ µ में कोशिकाओं resuspend एंटीबॉडी चरण 3.3.1 में तैयार मिश्रण के एल ।
    6. मिश्रण एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर नमूने और उंहें बर्फ पर 30 मिनट के लिए गर्मी ।
  4. कोशिकाओं का निर्धारण
    1. FACS धो बफर के २०० µ एल के साथ कुओं धो और ३०० x g और 4 ° c, 5 मिनट के लिए पर थाली स्पिन ।
    2. हल छोड़ने के लिए प्लेट को फ़्लिक करें ।
    3. निर्धारण/permeabilization बफर जोड़ें (सक्रिय caspase-3 apoptosis किट के साथ आता है; 10x पर्म/धोने बफर चरण 3.5.1 और विरोधी caspase-3 एंटीबॉडी में कदम 3.5.2 में उल्लेख के साथ) २०० µ एल पर अच्छी तरह से प्रति ।
    4. 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  5. सक्रिय caspase 3 के लिए Intracellular धुंधला
    1. कमजोर द्वारा 1x पर्म/धो बफर की तैयारी 5 मिलीलीटर ultrapure पानी की ४५ मिलीलीटर में 10x पर्म/
    2. एंटी-caspase-3 एंटीबॉडी के १.३ मिलीलीटर को जोड़कर intracellular एक्टिव caspase दाग तैयार करें 1x पर्म/धो बफर के ६.५ मिलीलीटर । स् पर्म/वॉश बफर करने के लिए एंटीबॉडी का अनुपात 1:5 है ।
    3. ३०० x g और 4 ° c पर थाली स्पिन, 5 मिनट के लिए. हल त्यागने के लिए प्लेट को फ़्लिक करें । २०० µ एल के साथ प्लेट धो 1x पर्म/
    4. दोहराएँ चरण 3.5.3.
    5. ३०० x g और 4 ° c पर थाली स्पिन, 5 मिनट के लिए. हल त्यागने के लिए प्लेट को फ़्लिक करें । Add ७५ µ l के intracellular caspase दाग सभी कुओं को चरण 3.5.2 में तैयार किया.
    6. मिश्रण एक मल्टीचैनल पिपेट और 1 एच के लिए बर्फ पर गर्मी का उपयोग कर नमूने ।
    7. 1x पर्म के २०० µ एल के साथ नमूनों धो/धो बफर और 5 मिनट के लिए ३०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस, पर थाली स्पिन ।
    8. हल छोड़ने के लिए प्लेट को फ़्लिक करें । २०० µ एल के साथ प्लेट धो 1x पर्म/ 5 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c, पर थाली स्पिन ।
    9. प्लेट झटका समाधान छोड़ने के लिए और FACS धोने बफर के २०० µ एल में नमूनों resuspend ।
    10. नमूने का प्रवाह cytometric विश्लेषण चलाएं और FACS विश्लेषण प्रोग्राम के साथ परिणामों का विश्लेषण करें ।
    11. दोनों CD4 और सीडी 8 (चित्रा 2, नीचे आधा) की एक सकारात्मक अभिव्यक्ति के साथ डीपी thymocytes की आबादी पर सीडी 8 भूखंड, गेट बनाम एक CD4 का उपयोग करना । डीपी thymocyte गेट के भीतर, सक्रिय caspase-3 के साथ कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं, नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में डेक्समेतएसॉनी के रूप में उत्तेजित नमूना का उपयोग कर । डीपी thymocyte गेट में CD69 की अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए, नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उत्तेजित नमूना के रूप में उत्तेजित नमूना का उपयोग करें ।
      नोट: जब गेटिंग डीपी thymocytes पर, सत्यापित करें कि डीपी thymocytes की जनसंख्या व्यक्तिगत नमूनों के लिए सही रूप से gated है । उत्तेजित कोशिकाओं downregulate सतह coreceptors, और एक तंग डीपी गेट का उपयोग किया जाता है, तो घटनाओं का एक अवांछित अपवर्जन हो सकता है ।

4. कळेनासे अवरोधक पुस्तकालय स्क्रीनिंग (केंद्रापसारक-स्वतंत्र परख)

  1. कळेनासे अवरोधकों के साथ thymocytes का उपचार
    1. धारा 1 के अनुसार thymocyte सस्पेंशन तैयार करें ।
    2. पूर्ण RPMI में thymocytes को पतला करने के लिए 25 x 106 कोशिकाओं के thymocyte निलंबन प्राप्त करने के लिए/
    3. एक छोटी मात्रा की थाली की एक अच्छी तरह से thymocytes के ४० µ एल जोड़ें, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर । बर्फ पर प्लेट लगाएं ।
    4. शेयर प्लेट, DMSO से अवरोधकों को पतला, और पूरी तरह से RPMI के चार भागों के अनुपात में पूरी RPMI में डेक्समेतएसॉनी के एक भाग के लिए अवरोधक/DMSO/डेक्समेतएसॉनी (5 के कमजोर कारक) ।
      नोट: के रूप में इस छोटे मात्रा की थाली में प्रयोग किया जाता है 5x पारंपरिक विधि में से छोटे हैं, अवरोधकों और नियंत्रण रिएजेंट उंहें प्लेट में thymocytes को जोड़ने से पहले पंचगुना पतला कर रहे हैं ।
    5. संकोचन के ०.५ µ एल जोड़ें ९६-अवरोध करनेवाला प्लेट के इसी कुएँ से अच्छी तरह से प्लेट 4.1.4 चरण में तैयार.
    6. अनुपचारित नियंत्रण के आठ कुओं तैयार करते हैं । वाहन के चार कुओं को तैयार करने का इलाज किया नियंत्रण चरण 4.1.4 में तैयार DMSO के ०.५ µ l को जोड़कर. कदम 4.1.4 (चित्रा 2) में तैयार पतला डेक्समेतएसॉनी का उपयोग कर, 5 µ एम डेक्समेतएसॉनी-इलाज नियंत्रण के चार कुओं तैयार करते हैं ।
  2. thymocytes की उत्तेजना विरोधी CD3/CD28 मोतियों का उपयोग
    1. सुनिश्चित करें कि मोती समान रूप से resuspend कर रहे हैं । मोतियों की 1 मिलीलीटर लें और उंहें पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो लो । एक चुंबकीय खड़े का उपयोग कर मोती अलग और समाधान महाप्राण । पूरा RPMI के 1 मिलीलीटर में मोतियों को फिर से सस्पेंड ।
      नोट: मोतियों का अनुपात कोशिकाओं के लिए 1 २.५ है । मोतियों की मात्रा को समायोजित कुओं की संख्या पर निर्भर करता है और उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया thymocytes की संख्या ।
    2. प्रत्येक अवरोध करनेवाला इलाज नमूना, चार DMSO उपचारित नमूनों को मनका निलंबन के 10 µ एल जोड़ें, और आठ अनुपचारित नमूनों में से चार. शेष चार अनुपचारित कुओं को पूर्ण RPMI के १० µ एल जोड़ें. चित्रा 2 सामान्य प्लेट लेआउट से पता चलता है.
      नोट: कुएँ की अंतिम मात्रा ५० µ एल है, जो कुएँ की अधिकतम क्षमता के भीतर है. सावधानी बरतना और प्लेटों को पकड़ना, क्रॉस-वेल छलकने से बचने के लिए जरूरी है ।
    3. मिश्रण करने के लिए, एक microplate कक्षीय शेखर का उपयोग कर थाली आंदोलन । वैकल्पिक रूप से, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर कुओं की सामग्री को मिलाएं ।
    4. एक ३७ ° c, 5% सह 17-20 घंटे के लिए2 मशीन में thymocytes मशीन (या रातोंरात) एक विरोधी वाष्पीकरण ढक्कन के साथ ।
  3. प्लेट वॉशर का सेटअप
    नोट: प्लेट वॉशर स्थापित करने के लिए निर्देश निर्माता द्वारा प्रदान की जाती हैं । कदम नीचे संक्षेप में उल्लेख कर रहे हैं । समाधान के लगभग १५० मिलीलीटर प्रत्येक भड़काना कदम के लिए आवश्यक है ।
    1. प्रधानमंत्री ७०% 1% 20 के बीच युक्त इथेनॉल के साथ धो प्रणाली ।
    2. प्रधानमंत्री 1% 20 के बीच युक्त पानी के साथ धो प्रणाली ।
    3. प्राइम वॉश सिस्टम विथ FACS वॉश बफर.
  4. सतह एंटीजन का धुंधला
    1. एंटी-TCRβ, एंटी-CD4, एंटी-सीडी 8, और एंटी-CD69 एंटीबॉडी युक्त एक एंटीबॉडी धुंधला मिश्रण तैयार करें । 1:100 (v/v) के अनुपात में FACS वॉश बफर में एंटीबॉडी पतला ।
    2. प्लेट 9 धो, FACS धोने बफर प्रति धोने के ५५ µ एल का उपयोग कर, स्वचालित लामिना प्रवाह धुलाई प्रणाली का उपयोग कर ।
      नोट: बहाकर के अंत में, प्रत्येक कुआं में अवशिष्ट आयतन के 25 µ l होंगे ।
    3. एंटीबॉडी चरण निमा में तैयार मिश्रण के 25 µ l में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड कर दीजिये ।
    4. यदि नमूने एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट से स्थानांतरित कर रहे हैं (से कदम 3.3.4), 3.3.1 चरण में तैयार एंटीबॉडी मिश्रण के ५० µ एल में कोशिकाओं resuspend, और छोटे मात्रा प्लेट के लिए नमूने हस्तांतरण. यह चरण विधि संख्या 2 के संगत है, जैसा चित्र 1aमें दर्शाया गया है ।
    5. मिश्रण करने के लिए, एक microplate कक्षीय शेखर के साथ थाली आंदोलन या एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर नमूने मिश्रण, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी ।
  5. कोशिकाओं का निर्धारण
    1. प्लेट 9 धो, FACS धोने बफर प्रति धोने के ५५ µ एल का उपयोग कर, स्वचालित लामिना प्रवाह धुलाई प्रणाली का उपयोग कर ।
    2. निर्धारण/permeabilization बफ़र जोड़ें (सक्रिय caspase-3 apoptosis किट के साथ आता है; 10x पर्म के साथ ही/धो चरण 4.6.1 और विरोधी caspase-3 एंटीबॉडी में चरण 4.6.2 में उल्लेख बफर) ५० µ एल पर अच्छी तरह से प्रति ।
    3. 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  6. सक्रिय caspase 3 के लिए Intracellular धुंधला
    1. कमजोर द्वारा 1x पर्म/धो बफर की तैयारी 25 मिलीलीटर 10x पर्म/ultrapure पानी की २२५ मिलीलीटर में बफर ।
    2. एंटी-caspase-3 एंटीबॉडी के 1 मिलीलीटर को जोड़कर intracellular एक्टिव caspase दाग तैयार करें 1x पर्म/धो बफर के 2 मिलीलीटर । स् पर्म/वॉश बफर करने के लिए एंटीबॉडी का अनुपात 1:2 है ।
    3. प्राइम वॉश सिस्टम के साथ 1x पर्म/
    4. एक धोने के लिए ५५ µ एल पर, 1x पर्म/धो बफर के साथ प्लेट 9 धो लें ।
    5. सभी कुओं को चरण 4.6.2 में तैयार intracellular caspase दाग के 25 µ l को जोड़ें ।
    6. मिश्रण करने के लिए, एक microplate कक्षीय शेखर के साथ थाली आंदोलन या एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर नमूने मिश्रण, और 1 ज के लिए बर्फ पर गर्मी ।
    7. एक धोने के लिए ५५ µ एल पर, 1x पर्म/धो बफर के साथ प्लेट 9 धो लें ।
    8. सभी कुओं के लिए FACS वॉश बफर के 25 µ एल जोड़ें ।
    9. pipetting के माध्यम से पर्याप्त मिश्रण के बाद microtiter ट्यूबों के लिए नमूने स्थानांतरण ।
    10. खाली कुओं और दोहराने कदम 4.6.9 करने के लिए FACS धोने बफर के एक और ५० µ एल जोड़ें ।
    11. दोहराएं कदम 4.6.9 और 4.6.10 2x जब तक २०० µ नमूने के एल microtiter ट्यूबों में एकत्र कर रहे हैं ।
      नोट: चरणों 4.6.10 और 4.6.11 में वर्णित प्रक्रियाओं का उद्देश्य छोटे वॉल्यूम प्लेट से कोशिकाओं की अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए है । यदि सेल नंबर एक चिंता का विषय नहीं हैं, कदम 4.6.10 के बाद, बस FACS धोने बफर के साथ २०० µ एल को microtiter ट्यूबों ऊपर ।
    12. नमूनों का प्रवाह cytometric विश्लेषण चलाएँ और FACS विश्लेषण प्रोग्राम के साथ परिणामों का विश्लेषण करें, चरण 3.5.11 के अनुसार. Caspase-3 सक्रियकरण और CD69 अभिव्यक्ति CD4+सीडी 8+डीपी thymocytes युक्त फाटक में विश्लेषण कर रहे हैं ।

Representative Results

स्क्रीनिंग परख के लिए दृष्टिकोण आंकड़ा 1aमें संक्षेप है । कळेनासे अवरोधकों पहले thymocyte व्यवहार्यता पर उनके अव्यक्त प्रभाव के लिए जांच की गई । apoptosis के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, डेक्समेतएसॉनी एक proapoptotic एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था । लाइव सेल जनसंख्या के लिए गेटिंग अनुपचारित नकारात्मक नियंत्रण और डेक्समेतएसॉनी-इलाज सकारात्मक नियंत्रण (आंकड़ा 1b) के आधार पर निर्धारित किया गया था । अवरोधकों पहले thymocytes पर 10 µ मीटर पर परीक्षण किया गया, और व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत 18 एच के लिए मशीनिंग के बाद मापा गया था । सेल मौत के लिए एक 20% खिड़की इस तरह चुना गया था कि यौगिकों कि लाइव सेल गेट में कोशिकाओं की एक बड़ी से 20% नुकसान प्रेरित, DMSO-इलाज के नमूनों की तुलना में, कम सांद्रता पर परीक्षण किया गया (आंकड़ा 1b) । प्रतिनिधि चयनित अवरोधक के FACS भूखंडों का इलाज नमूनों व्यवहार्यता परख वर्णन दिखाया जाता है । LY294002 (2-(4-morpholinyl) -8-फिनाइल-4H-1-benzopyran-4-एक; कैस 154447-36-6), एक PI3K अवरोधक22, बहुत सेल मौत 10 µ मीटर में वृद्धि नहीं किया था, और अवरोध करनेवाला बाद में परख के लिए 10 µ मीटर पर इस्तेमाल किया गया था । CAY10626 (n-[2-(dimethylamino) एथिल]-n-मिथाइल-4-[[[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2, २, २-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo [२, ३-डी] pyrimidin-२-yl] फिनाइल] एमिनो] carbonyl] अमीनो]-benzamide; कैस 1202884-94-3), PI3Kα के एक दोहरे अवरोधक/mTOR23, सेल मौत के उच्च स्तर प्रेरित 10 µ मीटर में और 1 µ m पर नहीं बल्कि ०.१ µ m पर, और ०.१ µ m को बहाव परख में आवेदन के लिए उपयुक्त एकाग्रता निर्धारित किया गया था । Staurosporine (2, 3, 10, 11, 12, 13-hexahydro-10R-methoxy-9एस-मिथाइल-11R-methylamino-9एस, 13R-epoxy-१, 9H-diindolo [1, 2, 3-gh; 3 ', 2 ', 1 '-lm] pyrrolo [3, 4-j] [1, 7] benzodiazonin-1-एक; कैस 62996-74-1), एक पैन प्रोटीन कळेनासे सी अवरोधक एक की स्थापना के लिए प्रेरित करने की क्षमता के साथ apoptosis24, परीक्षण सभी सांद्रता पर महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु प्रेरित, यहां तक कि ०.१ µ मीटर पर । यह एक अतिरिक्त सकारात्मक नियंत्रण के रूप में ०.१ µ मीटर पर बाद में परख में इस्तेमाल किया गया था ।

अवरोधकों के अंतिम सांद्रता उच्चतम सांद्रता के आधार पर चयन किया गया जिसमें वे DMSO-इलाज नमूनों के 20% से अधिक द्वारा सेल मौत बढ़ाना नहीं था । अवरोधकों के अंतिम सांद्रता निर्धारित के साथ, अवरोधकों के एक शेयर प्लेट ऐसी है कि सभी अवरोधकों ५०० बार एकाग्रता जब कोशिकाओं के लिए लागू किया गया था तैयार किया गया था । चित्रा 1C अवरोधकों के अंतिम सांद्रता के साथ, स्टॉक प्लेट की थाली लेआउट दिखाता है । लामिना प्रवाह धुलाई परख के लिए छोटे मात्रा में प्लेटों में सीधे कोशिकाओं की मशीन के वैकल्पिक प्रोटोकॉल में, छोटी मात्रा के उपयोग के एक और अवरोधकों के कमजोर पड़ने आवँयक है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि अवरोधक इसके अलावा संस्कृतियों के DMSO सामग्री कोशिकाओं के लिए बहुत अधिक नहीं होगा, अवरोधकों और पूरा RPMI में पतला थे, 5 की एक कमजोर पड़ने कारक द्वारा, ऐसे कि वे १०० बार इरादा एकाग्रता पर थे जब लागू कक्षों.

अवरोधकों, विषाक्त सांद्रता को पतला, TCR-उत्तेजना-प्रेरित apoptosis के लिए परख में इस्तेमाल किया गया thymocytes में5,17। उत्तेजना विरोधी CD3/CD28 मोतियों का उपयोग 18 ज के लिए किया गया था, और कोशिकाओं को बाद में caspase के लिए दाग थे-CD4 में 3 सक्रियण+ और सीडी 8+ डीपी thymocyte जनसंख्या (चित्रा 2) । caspase-3 सक्रियण और CD69 अभिव्यक्ति में वृद्धि, और यह भी एक TCR downregulation, दोनों विरोधी CD3/CD28-उत्तेजित और DMSO-नकली व्यवहार विरोधी CD3/28-उत्तेजित नमूनों की तुलना में, में मनाया गया था । । । डेक्समेतएसॉनी-इलाज के नमूनों में वृद्धि से पता चला caspase-3 सक्रियकरण CD69 के ऊपर से स्वतंत्र है, जो apoptosis-उत्प्रेरण प्रभाव TCR उत्तेजना से स्वतंत्र होने की उंमीद है ।

3 ए चित्रा चयनित अवरोधकों के लिए पुस्तकालय स्क्रीनिंग परख के परिणाम संक्षेप । दोनों caspase-3 सक्रियण और CD69 अभिव्यक्ति के दमन के कारण ब्याज की संभावित अवरोधकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में की उंमीद है, TCR संकेतन के विहित मध्यस्थों के अवरोधकों स्क्रीन में सकारात्मक हिट के रूप में दिखाया । इस तरह के अवरोधकों, जो निरोधात्मक शक्ति की डिग्री बदलती प्रदर्शन, व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोधकों कि लक्ष्य कई kinases और भी, अधिक विशिष्ट अवरोधकों शामिल थे. कुछ अवरोधकों दोनों caspase को दबाने में सक्षम थे-3 सक्रियण और CD69 विनियमन (आंकड़ा बी1, शीर्ष पंक्ति, बाएं पैनलों) । ऐसा ही एक अवरोधक है bisindolylmaleimide द्वितीय (3-(1-Indol-3-yl)-4-[१-[2-(१-मिथाइल-2-pyrrolidinyl) एथिल]-1-Indol-3-yl]-एक -1-pyrrole-2, 5-दिोनों; कैस 137592-45-1), जो प्रोटीन कळेनासे ए और PDK125,26,27के अलावा सभी प्रोटीन कळेनासे सी isoforms को रोकता है । इस श्रेणी में एक और अवरोधक है CAY10657 (3-[(aminocarbonyl) अमीनो]-5-[4-(4-morpholinylmethyl) फिनाइल] -2-thiophenecarboxamide; कैस 494772-86-0),28IKK2 के एक प्रस्तावित अवरोधक ।

वहां यौगिकों कि बाधित CD69 विनियमन थे, लेकिन caspase-3 सक्रियकरण ख़राब नहीं था (1बी, शीर्ष पंक्ति, सही पैनलों) । CAY10626, PI3Kα और mTOR23, और U-०१२६ के एक अवरोधक (2, 3-बीआईएस [अमीनो [(2-aminophenyl) thio] methylene]-butanedinitrile; कैस 109511-58-2), एक खल्क अवरोधक29, पहचान अवरोधकों में से कुछ थे । परिणाम दिखाने के लिए कि अलग kinases TCR संकेतन मार्ग की विशिष्ट शाखाओं से अलग अवरोधक लक्ष्यीकरण, विशेष रूप से उन देर से मंच kinases लक्ष्यीकरण, टी सेल सक्रियण घटना के चयनात्मक हानि में परिणाम कर सकते हैं ।

वहां भी अवरोधकों कि दोनों CD69 विनियमन और caspase-3 सक्रियण (आंकड़ा बी1, नीचे पंक्ति, बाएं पैनलों) को दबाने नहीं किया गया । Paclitaxel (βS-(benzoylamino)-αR-hydroxy-benzenepropanoic अम्ल, (2aR, 4s, 4aS, 6R, 9एस, 11S, 12S, 12aR, 12bS)-6, 12b-बीआईएस (acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 12a, 12b-dodecahydro-4, 11-dihydroxy-4a, 8, 13, 13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1-cyclodeca [3, 4] बेंज [१, 2-बी] oxet-9-yl एस्टर; कैस 33069-62-4), microtubule गतिशीलता30के एक अवरोधक, और necrostatin-5 (2-[[3, 4, 5, 6, 7, 8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl) -4-oxo [1] benzothieno [2, 3-d] pyrimidin-2-yl] thio]-acetonitrile; कैस 337349-54-9), RIP1 कळेनासे31के एक अवरोधक, दो इस श्रेणी में होने की पहचान अवरोधक हैं । ऐसे मामलों में जहां CD69 विनियमन और caspase-3 सक्रियण ख़राब नहीं थे, इस TCR संकेतन मार्ग के एक प्रासंगिक कळेनासे लक्ष्यीकरण नहीं अवरोधकों के कारण हो सकता है ।

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, staurosporine स्क्रीन में इस्तेमाल, एक एकाग्रता है कि अभी भी thymocytes में apoptosis प्रेरित पर था । उम्मीद के रूप में, staurosporine-इलाज नमूना caspase-3 सक्रियण के उच्च स्तर दिखाई दिया (चित्रा ३ बी, नीचे पंक्ति, दाएँ स्तंभ). CD69 अभिव्यक्ति के निम्न स्तर PKC के staurosporine मध्यस्थता निषेध के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता, bisindolylmaleimide द्वितीय के रूप में, एक और पान PKC अवरोध करनेवाला, भी CD69 की अभिव्यक्ति दबा. वैकल्पिक रूप से, staurosporine प्रेरित apoptosis कोशिकाओं में इससे पहले कि वे CD69 अभिव्यक्ति को विनियमित करने में सक्षम थे ।

का प्रवाह और प्रोटोकॉल का स्वचालन बढ़ाने के लिए, समानांतर प्रोटोकॉल है कि लामिना प्रवाह के माध्यम से एक स्वचालित प्लेट धोने प्रणाली के उपयोग में शामिल तैयार थे । दो अलग प्रोटोकॉल इस स्वचालित प्लेट धोने डिवाइस का उपयोग परीक्षण किया गया और ९६ में संवर्धन कोशिकाओं के पारंपरिक विधि की तुलना में अच्छी तरह से प्लेटें और एक केंद्रापसारक पर निर्भर प्रोटोकॉल में कोशिकाओं धुंधला । एक विधि ९६ में कोशिकाओं संवर्धन शामिल-अच्छी तरह से प्लेटें, मानक प्रक्रिया के अनुसार, और फिर, धुंधला कदम (चित्रा 4, दा-धोने के नमूने के लिए स्वचालित प्लेट वॉशर के साथ संगत प्लेटों के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित) । अंय शामिल विधि प्लेट में सीधे कोशिकाओं संवर्धन-वॉशर-संगत प्लेटों और एक ही थाली (चित्रा 4, दा संस्कृति के नमूने) पर दाग प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने के । इस केंद्रापसारक-स्वतंत्र प्रोटोकॉल सक्रिय caspase में कई अनुभव अंतर नहीं देते-3, CD69, या TCRβ विभिंन नमूनों का परीक्षण भर धुंधला, के रूप में पारंपरिक केंद्रापसारक पर निर्भर प्रोटोकॉल (चित्रा 4) की तुलना में । दाग तीव्रता में अंतर धुंधला कदम के दौरान थोड़ा अलग सांद्रता पर एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : अवरोधकों के साथ उपचार के बाद Thymocyte व्यवहार्यता । (क) स्क्रीनिंग परख में प्रमुख कदमों की प्रयोगात्मक रूपरेखा । वहां उत्तेजना और सक्रियकरण परख में इस्तेमाल thymocytes के धुंधला के लिए तीन प्रस्तावित तरीके हैं, अर्थात् (1) मानक ९६ में thymocytes के संवर्धन-अच्छी तरह से प्लेटें, एक पारंपरिक केंद्रापसारक आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग दाग के बाद, (2) मानक ९६ में thymocytes के संवर्धन-अच्छी तरह से प्लेटें, एक केंद्रापसारक-स्वतंत्र वाशिंग प्रोटोकॉल का उपयोग दाग के बाद, और (3) छोटी मात्रा में thymocytes के संवर्धन, एक ही प्लेट में दाग के बाद एक का उपयोग केंद्रापसारक-स्वतंत्र धुलाई प्रोटोकॉल । (ख) गेटिंग व्यवहार्यता परख में इस्तेमाल किया रणनीतियों । लाइव सेल गेट को फॉरवर्ड कैटरिंग (FSC) और साइड कैटरिंग (एसएससी) के भूखंडों से निकाला गया, जैसा कि पहले17बताया गया था. रोकता है कि परीक्षण एकाग्रता में भी विषाक्त समझा रहे थे 10 में आगे व्यवहार्यता परख के अधीन थे कम सांद्रता गुना । प्रतिनिधि अवरोधक-इलाज नमूने दिखाए जाते हैं । नोट सामान्य नियंत्रण (DMSO-स्वास्थ्यकर्मी [DMSO]) 1 µ m और ०.१ µ m नमूने के लिए उपयोग किया जाता है । (ग) पतला अवरोधकों की थाली लेआउट । DMSO में 500x का इरादा अंतिम एकाग्रता की एकाग्रता के लिए पतला अवरोधकों की प्लेटों का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । एक अच्छी तरह से एक अद्वितीय अवरोध करनेवाला का प्रतिनिधित्व करता है; ग्रे कुएँ खाली हैं. दिखाया सांद्रता अंतिम एकाग्रता जब सेल संस्कृतियों, अर्थात् 10 µ मीटर (डार्क रेड), 1 µ एम (फूहड़), और ०.१ µ मीटर (नीला) को जोड़ा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : thymocyte सक्रियकरण परख के प्लेट लेआउट । शीर्ष कॉलम 1 और 12 नियंत्रण के लिए आरक्षित हैं, जबकि कॉलम 2 से 11 अवरोधक उपचार नमूने (बेज रंग) हैं । नकारात्मक नियंत्रण (उत्तेजित [NS]; धूसर) वेल्स A1 से D1 में रह रहे हैं, और कोशिका मृत्यु के लिए सकारात्मक नियंत्रण (डेक्समेतएसॉनी-स्वास्थ्यकर्मी [DEX]; जामुनी) वेल्स E1 से H1 में रह रहे हैं । कॉलम 2 से 12 thymocytes विरोधी CD3/CD28 मोतियों के साथ उत्तेजित होते हैं । thymocyte सक्रियण के लिए सकारात्मक नियंत्रण (उत्तेजित नमूनों [α-CD3/CD28]; हरा) A12 के लिए वेल्स D12 में रह रहे हैं, और वाहन नियंत्रण (उत्तेजित और DMSO-इलाज [α-CD3/CD28 + DMSO]; लाल) E12 करने के लिए वेल्स H12 में रह रहे हैं । नीचे डबल पॉजिटिव (डीपी) गेट के भीतर TCRβ thymocytes के एक्टिव caspase-3 (ActCasp3), CD69, और gated धुंधला के cytometry प्लॉट्स को फ्लो करें । अलग नियंत्रण के प्रतिनिधि भूखंडों दिखाया जाता है । एनएस = उत्तेजित; DEX = डेक्समेतएसॉनी-उपचारित नमूने; α-CD3/CD28 + DMSO = CD3/CD28-लेपित मोतियों के साथ प्रेरित नमूने और DMSO के साथ इलाज; α-CD3/CD28 = CD3/CD28-लेपित मोतियों के साथ प्रेरित नमूने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : thymocyte सक्रियण पर अवरोधक पुस्तकालय की स्क्रीनिंग । (क) सक्रियण परख के सारांशित डेटा । इन चयनित अवरोधकों के लिए सक्रिय caspase-3 और CD69 अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के सामान्यीकृत मूल्यों दिखा एक प्रतिनिधि प्रयोग के परिणाम हैं. सामान्यीकरण सक्रिय-caspase-3-धनात्मक या CD69-धनात्मक gate में कक्षों के प्रतिशत की तुलना करके DMSO-व्यवहार नियंत्रण के मान पर किया गया था, जो ग्राफ़ में 0 के सापेक्ष मान पर सेट होता है. (ख) चयनित FACS भूखंड. अवरोधकों के प्रवाह cytometry भूखंडों कि दोनों caspase-3 सक्रियण और CD69 विनियमन (ऊपर छोड़ दिया) दबा, केवल CD69 विनियमन दबा (ऊपर सही), या caspase पर कोई प्रभाव नहीं था-3 सक्रियण और CD69 विनियमन (नीचे बाएं) । staurosporine-इलाज नमूना के भूखंडों विषाक्त सांद्रता (नीचे सही) में एक अवरोधक का उपयोग कर के प्रभाव को वर्णन करने के लिए दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : अलग परख प्रोटोकॉल की तुलना । सक्रिय caspase के cytometry भूखंडों प्रवाह-3 (ActCasp3), CD69, और डीपी TCRβ के धुंधला thymocytes तीन अलग परख प्रोटोकॉल निंनलिखित । चार विभिंन स्थितियों का परीक्षण कर रहे हैं, अर्थात् नकारात्मक नियंत्रण (उत्तेजित [एन एस]), कोशिका मृत्यु के लिए सकारात्मक नियंत्रण (डेक्समेतएसॉनी-इलाज [DEX]), वाहन नियंत्रण (उत्तेजित और DMSO-इलाज [α-CD3/CD28 + DMSO]), और एक अवरोध करनेवाला इलाज नमूना (उत्तेजित और पिक-७५-इलाज [α-CD3/CD28 + पिक-७५]) । पारंपरिक = मानक ९६ में thymocytes के संवर्धन-अच्छी तरह से प्लेटें और एक पारंपरिक केंद्रापसारक आधारित प्रोटोकॉल के साथ धुंधला; डीए-धुलाई = मानक ९६ में thymocytes की संवर्धन-अच्छी तरह से प्लेटें और एक लामिना फ्लो वाशिंग प्रोटोकॉल का उपयोग दाग; दा-कल्चर = छोटी मात्रा वाली प्लेटों में thymocytes का संवर्धन और एक लामिना फ्लोर वाशिंग प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करते हुए एक ही प्लेट में दाग लगा ।  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यहां प्रस्तावित स्क्रीनिंग की रणनीति छोटे-अणु अवरोधकों की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उत्तेजना के बाद thymocytes में अपोप्तोटिक प्रभाव को दबाने के लिए, टी सेल सक्रियण के अधिक पारंपरिक मार्कर के अलावा-CD69 और TCR downregulation . अतिरिक्त मार्कर भी अलग thymocyte सबसेट३२के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए शामिल किया जा सकता है । वर्तमान परख का एक दिलचस्प पहलू तथ्य यह है कि अवरोधकों कि TCR भी apoptosis की प्रेरण, और TCR के अंतर को उजागर-स्वतंत्र प्रभाव अवरोधकों सेल मौत उत्प्रेरण पर हो सकता है में बाधा उत्पंन करना होगा में निहित है । इसके अलावा, एक प्रवाह cytometry आधारित परख अलग सक्रियण मार्करों के रूप में एकाधिक readouts के उपयोग की अनुमति देता है, जो TCR संकेतन के अलग अलग शाखाओं पर अवरोधकों के प्रभाव की रिपोर्ट सकता है । मामले में यहां प्रस्तुत है, वहां अवरोधकों कि caspase के एक अंतर अवरोध-3 सक्रियण और CD69 विनियमन दिखाया गया । कुछ यौगिकों ऐसे प्रोटीन संश्लेषण या vesicular तस्करी के रूप में साफसफाई कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं, क्योंकि यह डी नोवो संश्लेषित मार्करों (जैसे, CD69) पर नहीं posttranslational पर प्रभाव का पालन करने के लिए आश्चर्य की बात नहीं है संशोधन (जैसे, caspase के proteolytic सक्रियण-3)।

के रूप में परख यहां प्रस्तुत एक readout के रूप में apoptosis उपाय है, यह जरूरी है कि अवरोधकों के अव्यक्त विषाक्त प्रभाव परिणाम अस्पष्ट नहीं है । उदाहरण के लिए, स्क्रीन में, हम 1 एनएम से परे staurosporine पतला नहीं था, इसके बावजूद यह अभी भी है कि एकाग्रता में कोशिकाओं को विषाक्त किया जा रहा है । प्रतिनिधि परिणाम staurosporine के साथ समझौते में है एक अनेक कळेनासे अवरोध करनेवाला जा रहा है और apoptosis३३के एक उत्प्रेरण । विषाक्त सांद्रता के लिए परीक्षण यौगिकों के एक पर्याप्त कमजोर पड़ने के बिना, यह संभावित हिट को नजरअंदाज करने के लिए संभव है.

यहां विस्तृत स्क्रीनिंग रणनीति उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए thymocytes की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के साथ जुड़े जटिलताओं के कारण मनुष्यों पर लागू करने के लिए मुश्किल होगा । हालांकि, यह बाल चिकित्सा कार्डियक बायोप्सी३४,३५ या से भ्रूण३६,३७से मानव थाइमस नमूने प्राप्त करने के लिए संभव है । बहरहाल, TCR संकेत रास्ते और संकेत प्रोटीन के एमिनो एसिड दृश्यों के रूप में मोटे तौर पर चूहों और मनुष्यों के बीच संरक्षण कर रहे हैं, thymocyte परख एक उपयोगी प्रारंभिक स्क्रीनिंग रणनीति प्रदान करता है, और किसी भी इस माउस का उपयोग परख के साथ प्राप्त परिणाम thymocytes, तो प्राथमिक मानव लिम्फोसाइटों में सत्यापित किया जा सकता है ।

पारंपरिक केंद्रापसारक के एक सीमा निर्भर प्रोटोकॉल कोशिका हानि की संभावना से संबंधित है, जो प्रक्रिया है, जो इस तरह के सेल permeabilization और केंद्रापसारक के रूप में कदम शामिल है की multistep प्रकृति के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । प्रत्येक केंद्रापसारक और निलंबन कदम अनिवार्य रूप से कोशिकाओं के नुकसान में परिणाम है । हालांकि इस तरह के घाटे के नमूनों की एक सीमित संख्या में शामिल अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण नहीं हो सकता है, यह समस्याओं जब उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग में लागू किया, विशेष रूप से परख प्रारूप ९६ से प्रगति-३८४-१५३६ के लिए-अच्छी तरह से कर सकते हैं । एक तरह से इस समस्या को दरकिनार सेल के उपयोग के माध्यम से है-पारगंय फ्लोरोसेंट caspase सेंसर३८ कि caspase सक्रियण का पता लगाने के सक्षम है जबकि सेल permeabilization और कई बहाकर5की जटिलताओं से परहेज । वैकल्पिक रूप से, लामिना प्रवाह द्वारा कोशिकाओं को धोने के एक केंद्रापसारक-स्वतंत्र विधि को रोजगार सेल नुकसान को कम करने के लिए भी संभव है । एक दीवार से कम प्लेट के साथ संयोजन के रूप में एक स्वचालित थाली धोने स्टेशन के साथ, कोशिकाओं को एक केंद्रापसारक के उपयोग के बिना लामिना प्रवाह से धोया जाता है । रिएजेंट के घातीय कमजोर पड़ने के लिए अनुमति देता है की पूरी तरह से और कुशल कोशिकाओं के धोने से कम 3 मिनट, जो केंद्रापसारक धोने के दो दौर के लिए एक समकक्ष कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करता है । बाहरी केंद्रापसारक के कारण तनाव के बिना, कोशिकाओं को और अधिक व्यवहार्य है और कोशिका हानि कम से अधिक कर रहे हैं ।

हम भी ९६ में thymocytes संवर्धन के बाद स्वचालित प्लेट वाशिंग स्टेशन का उपयोग करने की संभावना का पता लगाया-अच्छी तरह से U-नीचे प्लेटों और, भी, सीधे दीवारों कम स्वचालित प्लेट वाशिंग स्टेशन के साथ संगत प्लेटों में कोशिकाओं की संवर्धन । दीवार कम प्लेटों में कोशिकाओं के संवर्धन सभी केंद्रापसारक कदम के उंमूलन और प्लेटों में एक नमूना हस्तांतरण के लिए की आवश्यकता को नष्ट करने से कम सेल नुकसान सक्षम होना चाहिए । आम तौर पर, तीन अलग प्रोटोकॉल दोनों उत्तेजना दक्षता और धुंधला में तुलनीय हैं । स्वचालित वाशिंग स्टेशन स्वचालन, गति और दक्षता का लाभ प्रदान करता है, जो उच्च-प्रवाह विश्लेषण के लिए आसान बनाता है । इसके अलावा, वृद्धि हुई स्वचालन के साथ, धोने कदम बाहर तेजी से किया जा सकता है, और प्रयोगों या प्रयोगकर्ता के बीच एक बड़ी निरंतरता है । हालांकि, वाशिंग स्टेशन कुछ कमियां हैं: वाशिंग बफ़र्स के बड़े खंड वॉशर भड़काना के लिए आवश्यक हैं (बफर परिवर्तन के प्रति १५० मिलीलीटर, जिनमें से ५० मिलीलीटर धोने के लिए प्रयोग किया जाता है); छोटी मात्रा की प्लेट के कुओं के बीच सीमित विभाजन के कारण कुओं के किसी भी पार संदूषण से बचने के लिए प्लेट हैंडलिंग करते समय अतिरिक्त देखभाल की जरूरत है; आवश्यक धोने के बाद कुओं में 25 µ एल के अवशिष्ट बफर एक उच्च 1x से अधिक एकाग्रता में तैयार एजेंट का उपयोग करें । के लिए अवशिष्ट मात्रा और प्लेट की सीमित मात्रा क्षमता, एक गौण ७० µ l से १५० µ एल के लिए गर्मी की मात्रा का विस्तार करने के मुद्दों का पता जोड़ा जा सकता है, पारंपरिक प्रोटोकॉल की गोद लेने की सुविधा । जबकि स्वचालित प्लेट हैंडलिंग सिस्टम वर्तमान में उपलब्ध हैं, वे लामिना वॉश सिस्टम है, जो की एक छोटी इकाई है की तुलना में एक महत्वपूर्ण पदचिह्न है ~ 1 घन फुट (~ ०.०२८ एम3) । इसके अलावा, स्वचालित प्लेट हैंडलिंग सिस्टम में केंद्रापसारक के एकीकरण चुनौतीपूर्ण है, सेल धोने में उनके उपयोग सीमित । वहां वर्तमान में कोई अंय केंद्रापसारक-स्वतंत्र सेल वाशिंग उपकरण उपलब्ध हैं, जहां तक हम जानते हैं ।

स्क्रीनिंग रणनीति यहां प्रस्तुत छोटे अणुओं की पहचान करने में सक्षम है, और उनके कथित लक्ष्य kinases, कि TCR संकेतन और टी सेल सक्रियण प्रभावित करते हैं । पुस्तकालय यहां इस्तेमाल मुख्य रूप से छोटे kinases के अणु अवरोधकों शामिल है और संभावित दिलचस्प हिट के एक नंबर उत्पंन करने में सक्षम था । प्रोटोकॉल भी आसानी से अंय एंजाइम वर्गों के अवरोधक पुस्तकालयों या छोटे अणुओं के अंय प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही साथ अंय यौगिकों के पुस्तकालयों के लिए (जैसे, विभिंन अणुओं) । प्रोटोकॉल का उपयोग अंय सेल प्रकारों, जैसे कि परिधीय T लिम्फोसाइटों या अमर कोशिकाओं के रूप में भी किया जा सकता है, जिसमें ट्रांसजेनिक TCRs या ले जाने वाले रिपोर्टर सिस्टम शामिल हैं । की पहचान और निस्र्पक टी के नए मध्यस्थों-सेल संकेतन मार्ग के हमारे ज्ञान में सुधार और भी प्रतिरक्षा रोगों में लक्षित चिकित्सा के विकास में सहायता कर सकते है13,14,15, 16. सभी में, यह अध्ययन टी के मध्यस्थों का पता लगाने के लिए उपलब्ध विकल्पों की सीमा के लिए कहते हैं, उच्च प्रवाह जांच परख के द्वारा संकेत सेल ।

Disclosures

लेखक Chyan यिंग Curiox के एक कर्मचारी है, जो डीए सेल वॉशर और डीए सेल इस लेख में इस्तेमाल प्लेटें पैदा करता है ।

Acknowledgments

यह काम सिंगापुर स्वास्थ्य मंत्रालय के राष्ट्रीय आयुर्विज्ञान अनुसंधान परिषद, NMRC CBRG15may017, और सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय, २०१४-टी 2-1-136 (N.R.J.G.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI HyClone SH30027FS
FBS HyClone SH3007103
L-Glutamine HyClone SH3003401
Sodium pyruvate HyClone SH3023901
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
b-mercaptoethanol Sigma Aldrich 516732 
10X PBS Vivantis PB0344 – 1L
Kinase Screening Library (96-Well) Cayman Chemical 10505 Exact contents of the library may vary
DMSO Sigma Aldrich D2650
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 
anti-CD3/CD28 beads Thermo Fisher Scientific 11452D
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit BD Pharmingen 550480 Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody
DA-Cell Washer CURIOX HT1000
96-well DA-Cell Plate CURIOX 96-DC-CL-05
Antibodies
CD3e BioLegend 100236
TCRb BD Biosciences 553174
CD4 BD Biosciences 740007
CD8 BD Biosciences 563786
CD69 eBioscience 25-0699-42
Inhibitors
TG003 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PKC 412 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Doramapimod Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Paclitaxel Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erlotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-5 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-BEZ235 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Phthalazinone pyrazole Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-879 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
1-NA-PP1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Torin 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide II Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIBF 1120 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SMI-4a Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10657 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-703026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Chelerythrine chloride Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Tunicamycin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
GSK 1059615 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Ruxolitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 505124 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
INK128 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Canertinib (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 431542 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 173074 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Valproic Acid (sodium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 0325901 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
VX-702 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Emodin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CHIR99021 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIO Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Imatinib (mesylate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sunitinib Malate Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Gefitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
3-Methyladenine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide I Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IV Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide V Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 663284 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D 4476 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NU 7026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-9 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Indirubin-3'-monoxime Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-62 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-93 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CGP 57380 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Iso-Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VIII (acetate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ST638 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6656 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY364947 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10621 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
YM-201636 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 447439 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-041164 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP242 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ABT-869 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10622 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
17β-hydroxy Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10626 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6668 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10572 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
N,N-Dimethylsphingosine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY294002 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
U-0126 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Staurosporine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-92 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 (potassium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
O-1918 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 98059 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 169316 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TGX-221 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
OSU03012 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
JNJ-10198409 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Arachidonic Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lauric Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-252424 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10505 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI-103 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PIK-75 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sphingosine Kinase Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Piceatannol Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(R)-Roscovitine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BAY-43-9006 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10561 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-604850 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI3-Kinase α Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ML-9 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Triciribine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erbstatin Analog Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Kenpaullone Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-494 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-825 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1478 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 216763 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 415286 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-17 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-8 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LFM-A13 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-514 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Apigenin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10554 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
DRB Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-13022 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-14620 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-490 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-82 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-99 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-213 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-183 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lavendustin C Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 336372 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
5-Iodotubercidin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 202190 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10571 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Nilotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SP 600125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
L-threo-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-89 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
HA-1077 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-370 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1296 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KT 5823 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Janex 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10574 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10575 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10576 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NH125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TWS119 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 210902 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10577 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10578 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 184161 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CCT018159 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Myricetin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ Caspase-3 सक्रियण कळेनासे अवरोधकों पुस्तकालय स्क्रीनिंग TCR संकेतन टी सेल सक्रियण thymocyte चयन
रासायनिक अवरोधक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के <em>माध्यम</em> से टी सेल रिसेप्टर संकेतन के मध्यस्थों की पहचान
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Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).

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