Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58946
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 1,4
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Singapore Immunology Network, A*STAR, 3Curiox Biosystems, 4Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit (KU) Leuven
* These authors contributed equally

Summary

Questo documento utilizza un flusso cytometry-test per librerie di schermo di inibitori chimici per l'identificazione di inibitori e ai loro obiettivi che influenzano la segnalazione del ricevitore della T-cellula. I metodi descritti qui possono essere espanso per high throughput screening.

Abstract

T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprende una moltitudine di mediatori che trasmettono i segnali al momento dell'attivazione del TCR. Diverse strategie sono state proposte e attuate per l'identificazione di nuovi mediatori di segnalazione TCR, che migliorerebbe la comprensione dei processi di T-cellula, compreso l'attivazione e selezione timica. Descriviamo un test di screening che consente l'identificazione di molecole che influenzano TCR di segnalazione basato sull'attivazione di sviluppare timociti. Segnali di forte TCR causa timociti in via di sviluppo attivare il macchinario apoptotico in un processo noto come selezione negativa. Attraverso l'applicazione degli inibitori della chinasi, quelli con gli obiettivi che riguardano la segnalazione TCR sono in grado di ignorare il processo di selezione negativa. Il metodo descritto in questo documento può essere utilizzato per identificare gli inibitori delle chinasi canoniche con ruoli stabiliti nelle vie di segnalazione TCR e anche gli inibitori delle chinasi nuove ancora ad essere istituito nelle vie di segnalazione TCR. La strategia di screening qui può essere applicato agli schermi di un throughput più elevato per l'identificazione di nuovi bersagli nella segnalazione di TCR.

Introduction

Le cellule T sono un lignaggio dei linfociti che svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'immunità adattativa. Essi esprimono TCR, che permette loro di riconoscere i loro ligandi, costituito da una molecola di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di complessi con un peptide associato, che si trovano sulle superfici del presentanti l'antigene (APCs) di cellule. L'attivazione del TCR via attraverso l'interazione di TCR/MHC di segnalazione è cruciale per l'attivazione delle cellule T e sviluppo1.

Nello sviluppo delle T-cellule, derivate da midollo osseo di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) migrano al timo, dove subiscono differenziazione e passare attraverso le fasi di progressione di T-cellula lineage2. Timociti di doppio-positivi (DP), che esprimono sia il CD4 e CD8 corecettori, impegnano con self-peptide/MHC sulle APCs. Timociti con una moderata affinità per loro ligandi self-peptide/MHC maturo per diventare timociti (SP) CD4 o CD8 singolo-positivi, un processo definito come selezione positiva. Al contrario, timociti che ricevono un'eccessiva stimolazione del TCR attraverso l'auto-peptide/MHCs subiscono apoptosi tramite selezione negativa3,4. Questo processo di apoptosi indotta da stimolazione, caspasi-dipendente può essere imitato in vitro stimolando i timociti, ad esempio con perline rivestite con anticorpo anti-CD3/285. Cellule T mature che passano il processo di selezione vengono attivate da ligandi non-self-peptide/MHC da APC nella periferia. Self-peptide/MHCs sono ancora rilevanti per cellule di T periferiche, nel contesto del tonico di segnalazione per la sopravvivenza e proliferazione omeostatica, la differenziazione dei linfociti T helper e il potenziamento delle risposte delle cellule T per non-self-peptide/MHCs attraverso coagonism6,7,8,9. Associazione di TCR ad alta affinità per il ligando di peptide/MHC attiva diverse vie di segnalazione a valle, che coinvolgono molte molecole di segnalazione che formano un complesso TCR segnalazione rete10. Le vie di segnalazione TCR sono state studiate per diversi decenni, e ancora la scoperta di nuovi mediatori del pathway non mostra alcun segno di cedimento,11,12. La modulazione delle vie di segnalazione di TCR ha rilevanza clinica e può coinvolgere potenzianti risposte a cellula T per applicazioni immunoterapeutiche o l'inibizione di risposte a cellula T per il controllo di autoimmunità13. Strategie per la modulazione delle risposte a cellula T dipendono principalmente la rottura della chinasi o fosfatasi attività14,15,16.

Descriviamo un'applicazione di un test di base di citometria a flusso per lo screening di piccoli composti chimici per la loro capacità di modulare la segnalazione di TCR e di attivazione delle cellule T17. Il dosaggio si basa sul fenomeno dei timociti attivazione della via di apoptosi quando esposti a forti segnali di TCR. Il dosaggio è sufficientemente sensibile per identificare i cambiamenti nella forza di stimolazione; incubando timociti che esprimono TCR transgenici con tetrameri di peptide/MHC con l'aumento di affinità ha provocato un aumento corrispondente di caspase attivazione-usato come misura della risposta apoptotica5. Per lo schermo, abbiamo usato una biblioteca degli inibitori della chinasi e valutare la loro capacità di modulare la risposta di timociti a forti segnali di TCR.

Diverse strategie di flusso cytometry-basato o fluorescenza-reporter sono state descritte per lo screening di alto-rendimento di un assortimento di fenotipi di attivazione periferica in vari sottoinsiemi a cellula T. Tali strategie includono l'uso di reporter genetici fluorescenti per valutare i tempi e la grandezza di cellula T attivazione18, l'uso del degranulation come una lettura di citotossica delle cellule T attività19,20e l'analisi della fosforilazione di varie proteine coinvolte nella segnalazione21cellulare.

Il test di screening qui presentato è in grado di identificare correttamente i composti che inibiscono molecole canoniche del TCR signaling pathway, nonché potenziali, romanzo composti con effetti inibitori su segnalazione TCR. Ad esempio, abbiamo identificato gli inibitori di GSK3β e Hsp90 come nuovi composti che interessano la cellula T risposte17. Il dosaggio è in grado di distinguere gli inibitori che interferiscono con la trasduzione del segnale, a causa di una riduzione nella risposta apoptotica, dagli effetti TCR-indipendente degli inibitori sulla tossicità cellulare. Oltre l'induzione di apoptosi, misuriamo anche upregulation di CD69 e TCR downregulation come marcatori di attivazione. Come TCR segnalazione reti sono complesse, l'utilizzo di più letture possa aumentare le probabilità di scoprire molecole con effetti specifici su un singolo percorso. Qui, presentiamo anche l'uso di un protocollo di centrifugazione-indipendente come alternativa ad alta produttività per il protocollo originale durante la colorazione delle cellule in preparazione per l'analisi cytometric di flusso. L'analisi descritta in questo articolo utilizza una piccola biblioteca composta degli inibitori della chinasi ma, in linea di principio, può essere utilizzato per lo screening di prestazioni superiore. La biblioteca di scelta può anche incorporare una varietà di inibitori o altre molecole.

Protocol

In questo studio, sono stati utilizzati topi di C57Bl/6 a 8-week-old 6 maschi e femmine. I topi sono stati allevati nella struttura animale presso l'Università nazionale di Singapore (Singapore). La National University of Singapore istituzionali cura degli animali ed uso Committee (IACUC) ha approvato tutte le sperimentazione animale.

1. preparazione della sospensione di timociti

  1. Eutanasia i topi in una camera di CO2 .
  2. Eseguire i passaggi successivi in una cappa di coltura del tessuto per evitare qualsiasi contaminazione delle colture cellulari. Fissare la carcassa del mouse alla scheda di dissezione, con perni e spruzzare il mouse con etanolo al 70%.
  3. Utilizzando un paio di forbici, praticare un'incisione verticale sul lato ventrale, a partire dall'addome verso la mascella. Effettuare ulteriori incisioni lungo ciascuna delle zampe posteriori. Tendere la pelle per esporre la gabbia toracica ed il perno verso il basso.
  4. Con un paio di forbici, tagliare il diaframma ed entrambi i lati della gabbia toracica dall'estremità posteriore. Sollevare la gabbia toracica ed il perno verso il basso per esporre il timo. Separare il tessuto connettivo associato al timo ed Estratto di timo con una pinzetta.
  5. Posto del timo in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenenti 5 mL di multimediale completo RPMI.
    Nota: Considerare l'aggiunta di 10% carbone-spogliato siero bovino fetale (FBS) ai media per migliorare la redditività di timociti se un lungo tempo di attesa è previsto tra la dissezione e l'analisi di stimolazione.
  6. Delicatamente schiacciare il timo, usando l'estremità smussata di una siringa e passare le cellule attraverso un colino di cella di 70 µM. In alternativa, per raccogliere i timociti in una condizione sana, considerare l'utilizzo di due paia di pinze per spremere il timo e raccogliere i timociti quel flusso fuori l'epitelio timico.
  7. Procedere alla cella contando, utilizzando un emocitometro o qualsiasi cella automatizzata strumento di conteggio.

2. titolazione degli inibitori della chinasi a concentrazioni non tossiche

Nota: Questa sezione si concentra sulla preparazione gli inibitori per uso negli schermi di attivazione delle cellule T. Gli inibitori utilizzati a concentrazioni elevate possono causare la morte delle cellule, che è una lettura di schermi di attivazione delle cellule T. La serie di diluizioni degli inibitori mira a determinare la concentrazione finale degli inibitori individuali che non deve indurre apoptosi indipendenti di stimolazione del TCR. La libreria degli inibitori della chinasi utilizzate in questo studio è stata acquistata da un fornitore esterno. L'elenco degli inibitori è incluso nella Tabella materiali.

  1. Preparazione delle piastre degli inibitori della chinasi a concentrazioni più basse
    1. Per preparare un piatto di inibitori a 1 mM, aggiungere 10 µ l di inibitori a 90 µ l di solfossido dimetilico (DMSO) per tutti gli inibitori.
      Nota: Gli inibitori della biblioteca della piccolo-molecola utilizzata in questo studio vengono ad una concentrazione stock di 10 mM. Se gli inibitori sono in forma di pellet, seguire i passaggi di ricostituzione consigliati dai fornitori. Se gli inibitori non vengono forniti a 10mm, preparare le piastre di inibitore a concentrazioni appropriate alternative invece e preparare diluizioni seriali separate degli inibitori con un fattore di diluizione adatto.
      Attenzione: In caso di inibitori tossici, seguire le istruzioni del produttore sulla sicurezza nella manipolazione e lo smaltimento.
    2. Per preparare un piatto di inibitori a 0,1 millimetri, è necessario aggiungere 10 µ l di inibitori dal piatto di inibitori di 1 mM a 90 µ l di DMSO.
    3. Per preparare un piatto di inibitori a 0,01 mM, aggiungere 10 µ l di inibitori dal piatto di inibitori di 0,1 mM a 90 µ l di DMSO.
  2. Trattamento dei timociti con gli inibitori della chinasi
    1. Preparare una sospensione di timociti come previsto al punto 1.
    2. Diluire timociti in RPMI completo per ottenere una sospensione di timociti di 5 x 106 cellule/mL.
    3. Aggiungere 200 µ l della sospensione di timociti in tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, usando una pipetta multicanale.
    4. In ciascun pozzetto, aggiungere 2 µ l di inibitori dal corrispondente bene della piastra contenente inibitori di 1 mM (la concentrazione finale degli inibitori è 10 µM).
    5. Nello stesso piatto, preparare quattro pozzi dei comandi non trattati, quattro pozzi di controlli positivi trattati con desametasone µM 5 e quattro pozzi di veicolo-trattati controlli negativi, aggiungendo 2 µ l di DMSO.
    6. Incubare i timociti in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per 17-20 h (o notte).
  3. Determinazione delle concentrazioni adatte di inibitori individuali
    1. Girare la piastra di timociti a 300 x g e 4 ° C, per 5 min. Risospendere le cellule in 250 µ l di tampone di lavaggio di FACS.
    2. Eseguire un'analisi cytometric di flusso dei campioni e analizzare i risultati con un programma di analisi di citometria a flusso.
    3. Determinare la percentuale di cellule vive, basato su FSC-SSC gating. La strategia di gating è mostrata in Figura 1B.
    4. Calcolo di una media della percentuale di cellule vive basata sui controlli trattati con DMSO, che sono normalizzati a 100%. Impostare una finestra arbitraria accettabile della morte delle cellule (e.g.,20%). Inibitori che ha provocato una percentuale di cellule vive sotto questa finestra (vale a dire., sotto l'80% dei controlli trattati con DMSO) devono essere testati nuovamente alle concentrazioni più basse.
    5. Per gli inibitori che non hanno superato i criteri di redditività al punto 2.3.4, ripetere i passaggi da passaggi 2.2.1 - 2.3.4, ma utilizzare la piastra di inibitori a 0,1 mM per passaggio 2.2.4 invece la piastra che contiene gli inibitori di 1 mM. La concentrazione finale di inibitori usati qui è di 1 µM.
    6. Per gli inibitori che ancora producono alti livelli di morte delle cellule a 1 µM, testare gli inibitori a 0,1 µM. Ripetere i passaggi da 2.2.1 - 2.3.4, ma utilizzare la piastra di inibitori a 0,01 millimetri al punto 2.2.4. La concentrazione finale di inibitori usati qui è 0,1 µM.
  4. Preparazione di un piatto d'archivio degli inibitori della chinasi
    1. Inibitori essere utilizzato a 10 µM, aggiungere 10 µ l di inibitori di 10 mM a 10 µ l di DMSO.
    2. Inibitori essere utilizzato a 1 µM, aggiungere 1 µ l di inibitori di 10 mM a 19 µ l di DMSO.
    3. Inibitori essere utilizzato a 0,1 µM, aggiungere 1 µ l di inibitori di 10mm a 199 µ l di DMSO (Figura 1).
      Nota: Il piatto preparato stock di inibitori è 500 volte la concentrazione di concentrazione finale che intendono quando aggiunto per le sospensioni di timociti. La piastra d'archivio degli inibitori possa essere preparata in strisce PCR o in piastre da 96 pozzetti.
    4. La piastra d'archivio degli inibitori della chinasi può essere applicata a timociti per lo screening in un convenzionale sistema di centrifugazione-dipendente (sezione 3; Vedi Figura 1A, i metodi 1 e 2) o in un sistema alternativo di centrifugazione-indipendente (sezione 4; si veda Figura 1A, metodo 3).

3. chinasi inibitore biblioteca Screening (test convenzionali basati su centrifuga)

  1. Trattamento dei timociti con gli inibitori della chinasi
    1. Preparare una sospensione di timociti come previsto al punto 1.
    2. Diluire timociti in RPMI completo per ottenere una sospensione di timociti di 5 x 106 cellule/mL.
    3. Aggiungere 200 µ l di timociti in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, usando una pipetta multicanale. Posizionare la piastra sul ghiaccio.
    4. Aggiungere 0,5 µ l di inibitori per la piastra a 96 pozzetti da rispettivi pozzetti della piastra stock inibitore preparato nella sezione 2.4.
    5. Preparare otto pozzetti dei comandi non trattati. Preparare quattro pozzi di comandi veicolo-trattati aggiungendo 0,5 µ l di DMSO. Preparare quattro pozzi di 5 controlli trattati con desametasone µM (Figura 2).
  2. Stimolazione dei timociti usando le perle di anti-CD3/CD28
    1. Prelevare 1 mL di perline e lavare le perle con 2 mL di PBS. Separare le perle utilizzando un supporto magnetico e aspirare la soluzione. Risospendere le sfere in 5 mL di RPMI completo.
      Nota: Il rapporto di perline alle cellule è di 1 a 2,5. Regolare la quantità di perline da prendere, a seconda il numero di pozzetti per stimolare e il numero di timociti utilizzato.
    2. Aggiungere 50 µ l di perline per ogni campione di inibitore-trattati, i quattro campioni trattati con DMSO e quattro di otto campioni non trattati. Aggiungere 50 µ l di RPMI completo per i restanti quattro pozzi non trattati. La figura 2 Mostra il layout generale della piastra.
    3. Mescolare il contenuto dei pozzetti usando una pipetta multicanale.
    4. Incubare i timociti in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per 17-20 h (o notte).
  3. Macchiatura di antigeni di superficie
    1. Preparare una miscela di macchiatura dell'anticorpo che contiene anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 e gli anticorpi anti-CD69. Diluire anticorpi nel tampone di lavaggio di FACS (PBS completata con 0,5% di sieroalbumina bovina [BSA]) con un rapporto di 1: 200 (v/v).
      Nota: Considerare ottimizzando i titoli dell'anticorpo utilizzati per la colorazione, invece di utilizzare diluizioni di anticorpo fisso, per minimizzare la variazione nella macchiatura attraverso diversi esperimenti e migliorare il rapporto segnale-rumore.
    2. Girare la piastra a 300 x g e a 4 ° C, per 5 min.
    3. Scorri la piastra per scartare la soluzione.
    4. A questo punto, il protocollo può seguire il protocollo convenzionale di centrifuga-dipendente (passare al punto 3.3.5; Vedi Figura 1A, metodo 1) o il protocollo alternativo di centrifugazione-indipendente (passare al punto 4.4.4; Vedi Figura 1A, metodo 2).
    5. Risospendere le cellule in 75 µ l della miscela dell'anticorpo che macchia preparata al punto 3.3.1.
    6. Mescolare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e li Incubare in ghiaccio per 30 min.
  4. Fissazione delle cellule
    1. Lavare i pozzetti con 200 µ l di tampone di lavaggio di FACS e girare la piastra a 300 x g e a 4 ° C, per 5 min.
    2. Scorri la piastra per scartare la soluzione.
    3. Aggiungere fissazione/permeabilization buffer (fornito con il kit di apoptosi caspasi-3 attiva; stesso con le 10 x perm/tampone indicato nel passaggio 3.5.1 e l'anticorpo anti-caspasi-3 al punto 3.5.2) a 200 µ l per pozzetto.
    4. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  5. Intracellulare di macchiatura per attiva caspase 3
    1. Preparare 1 tampone di perm/lavaggio x diluendo 5 mL di tampone di lavaggio/perm x 10 in 45 mL di acqua ultrapura.
    2. Preparare caspase attivo intracellulare colorazione aggiungendo 6,5 mL di tampone di lavaggio/perm 1x 1,3 mL di anticorpo anti-caspasi-3. Il rapporto dell'anticorpo a perm/wash buffer è 1:5.
    3. Girare la piastra a 300 x g e 4 ° C, per 5 min, scorri la piastra a scartare la soluzione. Lavare la piastra con 200 µ l di tampone di lavaggio/perm x 1.
    4. Ripetere il punto 3.5.3.
    5. Girare la piastra a 300 x g e 4 ° C, per 5 min, scorri la piastra a scartare la soluzione. Aggiungere 75 µ l di caspasi intracellulari macchia preparata al punto 3.5.2 in tutti i pozzetti.
    6. Mescolare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare in ghiaccio per 1 h.
    7. Lavare i campioni con 200 µ l di tampone di lavaggio/perm x 1 e girare la piastra a 300 x g e a 4 ° C, per 5 min.
    8. Scorri la piastra per scartare la soluzione. Lavare la piastra con 200 µ l di tampone di lavaggio/perm x 1. Girare la piastra a 300 x g e a 4 ° C, per 5 min.
    9. Scorri la piastra per scartare la soluzione e risospendere i campioni in 200 µ l di tampone di lavaggio di FACS.
    10. Eseguire un'analisi cytometric di flusso dei campioni e analizzare i risultati con un programma di analisi di FACS.
    11. Utilizzando una CD4 e CD8 trama, cancello sulla popolazione di timociti DP con un'espressione positiva di CD4 e CD8 (Figura 2, la metà inferiore). All'interno il cancello di timociti DP, determinare la percentuale di cellule con attivato caspase-3, utilizzando l'esempio non stimolata come controllo negativo e desametasone come controllo positivo. Per l'analisi dell'espressione di CD69 nel cancello timociti DP, utilizzare l'esempio non stimolata come controllo negativo e il campione stimolato come controllo positivo.
      Nota: Quando gating sui timociti DP, verificare che la popolazione di timociti DP è recintata correttamente per singoli campioni. Cellule stimolate downregulate corecettori superficiale e un'esclusione non intenzionale di eventi può verificarsi se viene utilizzato un cancello stretto di DP.

4. chinasi inibitore biblioteca Screening (test di centrifuga-indipendente)

  1. Trattamento dei timociti con gli inibitori della chinasi
    1. Preparare una sospensione di timociti come previsto al punto 1.
    2. Diluire i timociti in RPMI completo per ottenere una sospensione di timociti di 25 x 106 cellule/mL.
    3. Aggiungere 40 µ l di timociti in ciascun pozzetto di una piastra di piccolo volume, usando una pipetta multicanale. Posizionare la piastra sul ghiaccio.
    4. Diluire gli inibitori dalla piastra d'archivio, DMSO e desametasone in RPMI completo con un rapporto di quattro parti di RPMI completo a una parte dell'inibitore e DMSO/desametasone (fattore di diluizione di 5).
      Nota: Come i volumi usati in questo piatto piccolo-volume sono 5 x più piccolo nel metodo convenzionale, gli inibitori e i reagenti di controllo sono diluiti cinque volte prima di aggiungerli a timociti in lastra.
    5. Aggiungere 0,5 µ l di inibitori per la piastra a 96 pozzetti da rispettivi pozzetti della piastra inibitore preparata al punto 4.1.4.
    6. Preparare otto pozzetti dei comandi non trattati. Preparare quattro pozzi di comandi veicolo-trattati aggiungendo 0,5 µ l di DMSO preparato al punto 4.1.4. Preparare quattro pozzi di 5 µM trattati con desametasone controlli mediante il desametasone diluito preparato al punto 4.1.4 (Figura 2).
  2. Stimolazione dei timociti usando le perle di anti-CD3/CD28
    1. Assicurarsi che le perle sono risospese in modo uniforme. Prelevare 1 mL di perline e lavarli con 2 mL di PBS. Separare le perle utilizzando un supporto magnetico e aspirare la soluzione. Risospendere le sfere in 1 mL di RPMI completo.
      Nota: Il rapporto di perline alle cellule è di 1 a 2,5. Regolare la quantità di perle, a seconda il numero di pozzetti per stimolare e il numero di timociti utilizzato.
    2. Aggiungere 10 µ l della sospensione di perlina per ogni campione di inibitore-trattati, i quattro campioni trattati con DMSO e quattro di otto campioni non trattati. Aggiungere 10 µ l di RPMI completo per i restanti quattro pozzi non trattati. La figura 2 Mostra il layout di etichetta generale.
      Nota: Il volume finale dei pozzi è 50 µ l, che è alla portata massima dei pozzi. È importante prestare attenzione e a tenere le piastre in posizione verticale, per evitare gli schizzi di croce-pozzo.
    3. Per mescolare, agitare la piastra utilizzando un agitatore per micropiastre orbitale. In alternativa, mescolare il contenuto dei pozzetti usando una pipetta multicanale.
    4. Incubare i timociti in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per 17-20 h (o notte) con un coperchio anti-evaporazione.
  3. Installazione della rondella piastra
    Nota: Le istruzioni per la configurazione la rondella piastra sono fornite dal produttore. I passi sono citati in breve qui di seguito. Circa 150 mL di soluzione è necessaria per ogni fase di adescamento.
    1. Innescare il sistema di lavaggio con etanolo al 70% contenente 1% Tween 20.
    2. Innescare il sistema di lavaggio con acqua deionizzata contenente 1% Tween 20.
    3. Innescare il sistema di lavaggio con tampone di lavaggio di FACS.
  4. Macchiatura di antigeni di superficie
    1. Preparare una miscela di macchiatura dell'anticorpo che contiene anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 e gli anticorpi anti-CD69. Diluire gli anticorpi nel tampone di lavaggio di FACS con un rapporto di 1: 100 (v/v).
    2. Lavare la piastra 9 x, utilizzando 55 µ l di tampone di lavaggio di FACS per lavaggio, utilizzando il sistema di lavaggio automatizzato a flusso laminare.
      Nota: Al termine dei lavaggi, ci saranno 25 µ l di volume residuo in ciascun pozzetto.
    3. Risospendere le cellule in 25 µ l della miscela dell'anticorpo che macchia preparata al punto 4.4.1.
    4. Se i campioni sono trasferiti da una piastra a 96 pozzetti (dal punto 3.3.4), risospendere le cellule in 50 µ l della miscela dell'anticorpo preparata al punto 3.3.1 e trasferire i campioni alla piastra di piccolo volume. Questo passaggio corrisponde al metodo numero 2, come raffigurato in Figura 1A.
    5. Mescolare, agitare la piastra con un agitatore orbitale per micropiastre o mescolare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare in ghiaccio per 30 min.
  5. Fissazione delle cellule
    1. Lavare la piastra 9 x, utilizzando 55 µ l di tampone di lavaggio di FACS per lavaggio, utilizzando il sistema di lavaggio automatizzato a flusso laminare.
    2. Aggiungere fissazione/permeabilization buffer (fornito con il kit di apoptosi caspasi-3 attiva; stesso con le 10 x perm/tampone indicato nel passaggio 4.6.1 e l'anticorpo anti-caspase-3 nel passaggio 4.6.2) a 50 µ l per pozzetto.
    3. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  6. Intracellulare di macchiatura per attiva caspase 3
    1. Preparare 1 x perm/tampone da diluire 25 mL di tampone di lavaggio/perm x 10 in 225 mL di acqua ultrapura.
    2. Preparare colorazione intracellulare caspase attivo aggiungendo 1 mL di anticorpo anti-caspasi-3 a 2 mL di tampone di lavaggio/perm 1x. Il rapporto dell'anticorpo a perm/wash buffer è 1:2.
    3. Preparare il sistema di lavaggio con perm/lavaggio 1X.
    4. Lavare la piastra 9 x con tampone di lavaggio/perm, a 55 µ l per ogni lavaggio 1X.
    5. Aggiungere 25 µ l della macchia di caspasi intracellulari preparata al punto 4.6.2 in tutti i pozzetti.
    6. Mescolare, agitare la piastra con un agitatore orbitale per micropiastre o mescolare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare in ghiaccio per 1 h.
    7. Lavare la piastra 9 x con tampone di lavaggio/perm, a 55 µ l per ogni lavaggio 1X.
    8. Aggiungere 25 µ l di tampone di lavaggio di FACS in tutti i pozzetti.
    9. Trasferire i campioni in provette di microtitolo dopo adeguata miscelazione tramite pipettaggio.
    10. Aggiungere un altro 50 µ l di tampone di lavaggio di FACS pozzetti vuoti e ripetere il passaggio 4.6.9.
    11. Ripetere i passaggi 4.6.9 e 4.6.10 2x fino a 200 µ l dei campioni sono raccolti nei tubi microtitolo.
      Nota: Lo scopo delle procedure descritte nei passaggi 4.6.10 e 4.6.11 è quello di garantire un recupero massimo delle cellule dalla piastra di piccolo volume. Se i numeri delle cellule sono non una preoccupazione, dopo passo 4.6.10, semplicemente ricaricare la micropiastra tubi a 200 µ l con tampone di lavaggio di FACS.
    12. Eseguire un'analisi cytometric di flusso dei campioni e analizzare i risultati con un programma di analisi di FACS, secondo passo 3.5.11. Attivazione di caspase-3 e l'espressione CD69 sono analizzati nel cancello contenente CD4+CD8+DP timociti.

Representative Results

L'approccio al test di screening è riassunto nella Figura 1A. Gli inibitori di chinasi in primo luogo sono stati schermati per i loro effetti latenti sulla vitalità di timociti. Come controllo positivo per apoptosi, desametasone è stato usato come agente proapoptotici. Il gating per la popolazione di cellule vive è stato determinato in base ai comandi negativi non trattati e i controlli positivi trattati con desametasone (Figura 1B). Gli inibitori sono stati analizzati a 10 µM su timociti, e la percentuale di cellule vitali è stata misurata dopo incubazione per 18 h. Una finestra di 20% per la morte delle cellule è stato scelto tale che i composti che ha indotto una più grande del 20% perdita di cellule nel cancello cellule vive, rispetto ai campioni trattati con DMSO, sono stati testati a concentrazioni più basse (Figura 1B). Appezzamenti di FACS rappresentativi di campioni trattati con inibitore selezionati sono mostrati per illustrare l'analisi di attuabilità. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), un inibitore di PI3K22, non ha notevolmente aumentato la morte delle cellule a 10 µM e l'inibitore è stato usato a 10 µM per le analisi successive. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), un inibitore doppio di PI3Kα/mTOR23, indotta da alti livelli di morte delle cellule a 10 µM e 1 μm, ma non a 0,1 µM e 0,1 µM è stata determinata per essere la concentrazione adatta per applicazione nelle analisi a valle. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), un inibitore di chinasi C pan-proteina con una consolidata capacità di indurre apoptosi24, ha indotto la morte cellulare significativo a tutte le concentrazioni testate, anche a 0,1 µM. Nelle successive analisi a 0,1 µM fungeva un ulteriore controllo positivo.

Le concentrazioni finali degli inibitori sono state selezionate sulle più alte concentrazioni in cui hanno non amplificare la morte delle cellule di oltre il 20% dei campioni trattati con DMSO. Con le concentrazioni finali degli inibitori determinati, una piastra d'archivio degli inibitori è stata preparata tale che tutti gli inibitori erano 500 volte la concentrazione quando applicato alle celle. Figura 1 illustra il layout della piastra della piastra d'archivio, con le concentrazioni finali degli inibitori. Nel protocollo alternativo di incubando le cellule direttamente nelle piastre di piccolo volume per il dosaggio di lavaggio a flusso laminare, l'utilizzo di piccoli volumi hanno reso necessaria un'ulteriore diluizione degli inibitori. Per garantire che il contenuto di DMSO delle culture dopo aggiunta di inibitore non sarebbe troppo alto per le cellule, gli inibitori sono stati diluiti ulteriormente in RPMI completo, per un fattore di diluizione di 5, tale che si trovavano a 100 volte la concentrazione prevista quando applicato alla cellule.

Gli inibitori, diluiti a concentrazioni non tossiche, sono stati utilizzati nell'analisi per TCR-stimolazione-induced apoptosis in timociti5,17. La stimolazione è stata effettuata utilizzando anti-CD3/CD28 perline per 18 h, e le cellule sono state successivamente macchiate per attivazione di caspase-3 il CD4+ e CD8+ DP popolazione timociti (Figura 2). Un aumento nell'attivazione di caspase-3 e CD69 espressione e anche un downregulation TCR, sono stati osservati in anti-CD3/CD28-stimolata e i campioni anti-CD3/28-stimolata con DMSO-mock-trattati, rispetto ai campioni nonstimulated. I campioni trattati con desametasone hanno mostrato un aumento nell'attivazione di caspase-3 indipendente di CD69 upregulation, che ci si aspetta dall'effetto di induzione è indipendente di stimolazione del TCR.

Figura 3A riassume i risultati della biblioteca lo screening test per inibitori selezionati. Sia l'attivazione di caspase-3 e CD69 può essere utilizzato per identificare potenziali inibitori di interesse dovuto la soppressione dell'espressione. Come previsto, inibitori della canoniche mediatori di segnalazione TCR si presentò come risultati positivi nelle schermate. Tali inibitori, che hanno esibito vari gradi di potenza inibitoria, inclusi gli inibitori ad ampio spettro che target chinasi multiple e, inoltre, più inibitori specifici. Alcuni inibitori sono stati in grado di sopprimere l'attivazione di caspase-3 e la upregulation di CD69 (Figura 3B, riga superiore, pannelli a sinistra). Una tale inibitore è bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), che inibisce tutte le isoforme di proteina chinasi C, oltre a chinasi di proteina A e PDK125,26,27. Un altro inibitore in questa categoria è CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), un inibitore della proposta di IKK228.

C'erano composti che hanno inibito il upregulation di CD69 ma non hanno alterato l'attivazione di caspasi-3 (Figura 3B, riga superiore, pannelli di destra). CAY10626, un inibitore della PI3Kα e mTOR23e U-0126 (2,3-bis [ammino [(2-aminophenyl) thio] metilene]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), un inibitore MEK29, erano alcuni degli inibitori identificati. I risultati mostrano che diversi inibitori targeting diverse chinasi da rami specifici del pathway di segnalazione TCR, specialmente quelli targeting chinasi in fase avanzata, possono provocare il danno selettivo dei fenomeni di attivazione delle cellule T.

C'erano anche gli inibitori che non sopprimere sia upregulation di CD69 e attivazione di caspase-3 (Figura 3B, riga inferiore, pannelli a sinistra). Paclitaxel (βS-(benzoylamino) - αR - idrossi-acido benzenepropanoic, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl estere; CAS 33069-62-4), un disgregatore di microtubule dynamics30e necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), un inibitore della chinasi di RIP131, sono due inibitori identificati per essere in questa categoria. In tali casi dove upregulation di CD69 e attivazione di caspase-3 non sono state alterate, questo può essere dovuto gli inibitori non targeting una chinasi pertinente del TCR via di segnalazione.

Come accennato in precedenza, è stato utilizzato staurosporine nelle schermate, ad una concentrazione che ancora ha indotto gli apoptosi nei timociti. Come previsto, il campione staurosporine-trattati ha mostrato alti livelli di attivazione di caspase-3 (Figura 3B, riga inferiore, la colonna di destra). I bassi livelli di espressione CD69 possono essere attribuiti all'inibizione staurosporine-mediata di PKC, come bisindolylmaleimide II, un altro inibitore PKC-pan, inoltre ha soppresso l'espressione di CD69. In alternativa, staurosporine indotto apoptosi nelle cellule prima che fossero in grado di aumentare l'espressione CD69.

Per aumentare il throughput e l'automazione del protocollo, sono stati preparati protocolli paralleli che comportava l'uso di una piastra automatizzato di lavaggio sistema tramite flusso laminare. Due protocolli separati utilizzando questo dispositivo di lavaggio automatico piastra erano sperimentati e rispetto al metodo convenzionale della coltura delle cellule in piastre da 96 pozzetti e macchiatura le cellule in un protocollo di centrifugazione-dipendente. Un metodo ha coinvolto coltivando le cellule in piastre da 96 pozzetti, come da procedura standard, e quindi, trasferire le cellule a placche compatibili con la rondella piastra automatizzati per la macchiatura passaggi (Figura 4, campioni DA lavare). L'altro metodo ha coinvolto coltura le cellule direttamente nelle piastre piastra-rondella-compatibile e continuando con il protocollo di colorazione sulla stessa piastra (Figura 4, campioni DA-Culture). I protocolli di centrifugazione-indipendente non danno molte differenze percepibili in attiva caspase-3, CD69 o TCRβ colorazione attraverso i diversi campioni testati, rispetto al protocollo convenzionale di centrifugazione-dipendente (Figura 4). Differenze nell'intensità di colorazione possono essere attribuite a usando gli anticorpi alle concentrazioni leggermente differenti durante la procedura di colorazione.

Figure 1
Figura 1 : Redditività thymocyte dopo trattamento con inibitori. (A) struttura sperimentale dei passaggi principali nel test di screening. Ci sono tre metodi proposti per la stimolazione e la macchiatura dei timociti usati per il test di attivazione, vale a dire (1) alla coltura di timociti in piastre standard da 96 pozzetti, seguite dalla macchiatura utilizzando un protocollo basato su centrifugazione convenzionale, (2) i coltura di timociti in piastre standard da 96 pozzetti, seguite dalla macchiatura utilizzando un protocollo di lavaggio indipendente dalla centrifugazione e (3) la coltura dei timociti in piastre di piccolo volume, seguita dalla macchiatura delle piastre stesse utilizzando un protocollo di lavaggio indipendente dalla centrifugazione. (B) Gating strategie utilizzate nei saggi di vitalità. Il cancello di tensione delle cellule è stato derivato dal forward scatter (FSC) e tracciati a dispersione laterale (SSC), come descritto in precedenza17. Inibitori che sono stati ritenuti per essere troppo tossico alla concentrazione testata erano soggette a ulteriori saggi di vitalità alle concentrazioni più basse di 10 volte. Campioni rappresentativi di inibitore-trattati sono mostrati. Nota il controllo comune (DMSO-trattati [DMSO]) utilizzato per la 1 µM e 0,1 µM campioni. (C) layout di piastra di inibitori diluiti. Una rappresentazione schematica delle piastre di inibitori diluiti in DMSO a una concentrazione di 500 x la concentrazione finale prevista. Ognuno rappresenta anche un unico inibitore; i pozzetti grigi siano vuoti. Le concentrazioni mostrate sono la concentrazione finale quando aggiunto a colture cellulari, vale a dire 10 µM (rosso scuro), 1 µM (fucsia) e 0,1 µM (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Layout di piastra del dosaggio attivazione timociti. (In alto) Le colonne 1 e 12 sono riservate per i controlli, mentre le colonne 2 e 11 sono campioni trattati con inibitore (beige). Il controllo negativo (nonstimulated [NS]; grigio) occupa pozzetti A1 a D1, e il controllo positivo per la morte delle cellule (trattati con desametasone [DEX]; viola) occupa pozzetti E1 H1. Le colonne 2 e 12 contengono timociti stimolati con anti-CD3/CD28 perline. Il controllo positivo per l'attivazione di timociti (campioni stimolati [α-CD3/CD28]; verde) occupa pozzi A12 a D12 e controllo del veicolo (stimolato e trattati con DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]; rosso) occupa pozzi E12 a H12. (In basso) Flusso cytometry appezzamenti di attiva caspase-3 (ActCasp3), CD69 e TCRβ la macchiatura dei timociti recintati all'interno del cancello (DP) doppio-positivi. Appezzamenti rappresentativi di diversi controlli vengono visualizzati. NS = nonstimulated; DEX = campioni trattati con desametasone; Α-CD3/CD28 + DMSO = campioni stimolati con perline CD3/CD28-rivestito e trattati con DMSO; Α-CD3/CD28 = campioni stimolati con perline CD3/CD28-rivestito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Screening della libreria inibitore sull'attivazione di timociti. (A) i dati del test attivazione di riepilogo. Questi sono i risultati di un esperimento rappresentanza mostrando i valori normalizzati delle cellule con attivato caspase-3 e l'espressione CD69 inibitori selezionati. Normalizzazione è stato fatto confrontando la percentuale di cellule nel cancello di CD69-positivi per il valore del controllo trattati con DMSO, che è impostato su un valore pari a 0 nel grafico relativo o attivo-caspase-3-positive. (B) selezionato FACS trame. Flusso cytometry trame di inibitori che ha soppresso l'attivazione di caspase-3 e la CD69 upregulation (in alto a sinistra), soppresso solo CD69 upregulation (in alto a destra), o non ha avuto effetto sull'attivazione di caspase-3 e CD69 upregulation (in basso a sinistra). Trame del campione staurosporine-trattati sono mostrati per illustrare gli effetti dell'utilizzo di un inibitore alle concentrazioni tossiche (in basso a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Confronto tra i protocolli di analisi differenti. Flusso cytometry appezzamenti di attiva caspase-3 (ActCasp3), CD69, e TCRβ la macchiatura dei timociti DP seguendo tre diverse analisi di protocolli. Quattro diverse condizioni sono testate, vale a dire il controllo negativo (nonstimulated [NS]), il controllo positivo per la morte delle cellule (trattati con desametasone [DEX]), il controllo del veicolo (stimolato e trattati con DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]) e trattati con un inibitore campione (stimolato e PIK-75-trattati [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Convenzionale = la coltura dei timociti in piastre standard da 96 pozzetti e la colorazione con un protocollo basato su centrifugazione convenzionale; DA lavare = alla coltura dei timociti in piastre standard da 96 pozzetti e che macchia usando un flusso laminare lavaggio protocollo; DA-Culture = alla coltura dei timociti in piastre di piccolo volume e colorazione delle piastre stesse utilizzando un protocollo di lavaggio a flusso laminare.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La strategia di screening proposta qui valuta la capacità di piccole molecole per sopprimere gli effetti apoptotici in timociti dopo stimolazione, oltre alle più convenzionali marcatori di cellula T upregulation di attivazione-CD69 e downregulation TCR . Ulteriori marcatori possono anche essere inclusi per consentire l'analisi di timociti diversi sottoinsiemi32. Un aspetto interessante del dosaggio attuale sta nel fatto che gli inibitori che ostacolano la segnalazione TCR rallenterebbe anche l'induzione di apoptosi, evidenziando ulteriormente la distinzione degli effetti di TCR-indipendente che gli inibitori possono avere sull'induzione della morte delle cellule. Inoltre, un'analisi di citometria a flusso-base consente l'utilizzo di più letture come marcatori di attivazione distinte, che potrebbero riferire gli effetti degli inibitori sui rami separati singoli di segnalazione TCR. Nel caso presentato qui, c'erano gli inibitori che hanno mostrato un'inibizione differenziale dell'attivazione di caspase-3 e CD69 upregulation. Poiché alcuni composti potrebbero influire sulle funzioni di pulizia come la sintesi proteica o traffico vescicolare dei suini, non è sorprendente osservare effetti sul upregulation del de novo sintetizzati gli indicatori (ad es., CD69) ma non su posttranslational modifiche (ad esempio, l'attivazione proteolitica di caspase-3).

Come il saggio presentato qui misure apoptosi come una lettura, è imperativo che gli effetti tossici latenti degli inibitori non oscurare i risultati. Ad esempio, nella schermata, abbiamo non diluire staurosporine oltre 1 nM, nonostante fosse ancora tossico per le cellule a quella concentrazione. I risultati rappresentativi sono d'accordo con staurosporine essendo un inibitore della chinasi promiscua e un induttore di apoptosi33. Senza una sufficiente diluizione dei composti testati a concentrazioni non tossiche, è possibile trascurare potenziali hit.

La strategia di screening dettagliata qui sarebbe difficilmente applicabile agli esseri umani dovuto le complicazioni connesse con l'ottenimento di un numero sufficiente di timociti per high throughput screening. Tuttavia, è possibile ottenere campioni di timo umano da biopsie cardiache pediatrica34,35 o da feti36,37. Ciò nonostante, come TCR segnalazione percorsi e le sequenze di aminoacidi delle proteine di segnalazione sono in gran parte conservate tra topi e nell'uomo, il dosaggio di timociti fornisce una strategia di screening preliminare utile, e tutti i risultati ottengono con questo test utilizzando il mouse timociti, quindi, verificabile in linfociti umani primari.

Una limitazione del protocollo dipendente dalla centrifugazione convenzionale riguarda la prospettiva di perdita delle cellule, che può essere attribuita alla natura più fasi del processo, che prevede misure quali la permeabilizzazione delle cellule e centrifugazione. Ogni centrifugazione e risospensione passo inevitabilmente comporta la perdita delle cellule. Mentre tali perdite potrebbero non essere fondamentale per gli studi che coinvolgono un numero limitato di campioni, si potrebbero porre dei problemi quando applicato nello screening di throughput più elevato, in particolare col progredire della analisi formato da 96 - a 384 - a 1536-bene. Un modo per aggirare questo problema è attraverso l'uso di sensori cellula-permeabile caspase fluorescente38 che permettono il rilevamento di attivazione delle caspasi, evitando le complicazioni di permeabilizzazione delle cellule e più lavaggi5. In alternativa, impiegando un metodo di centrifugazione indipendente di lavaggio celle di flusso laminare è anche possibile per minimizzare la perdita delle cellule. Con una piastra automatizzata stazione in combinazione con un piatto di parete-meno di lavaggio, le cellule vengono lavate da flusso laminare senza l'uso di una centrifuga. La diluizione esponenziale dei reagenti permette per la pulizia accurata ed efficiente di cellule in meno di 3 min, che rappresenta una diluizione equivalente a due giri di centrifuga lavaggio. Senza sollecitazioni esterne a causa di centrifugazione, le cellule sono più vitali e le perdite delle cellule sono ridotti al minimo.

Abbiamo anche esplorato la possibilità di utilizzare la piastra automatizzata stazione di lavaggio dopo la coltura i timociti in fondo U 96 pozzetti piastre e, anche, alla coltura delle celle direttamente in placche a muro-meno compatibili con la piastra automatizzata stazione di lavaggio. La coltura delle cellule nelle placche a muro-meno abilitato l'eliminazione di tutte le fasi di centrifugazione e ridotto al minimo la perdita delle cellule eliminando la necessità di un trasferimento di campione attraverso piastre. Generalmente, i tre protocolli differenti sono paragonabili in efficienza di stimolazione e la macchiatura. La stazione di lavaggio automatico fornisce il vantaggio di automazione, velocità ed efficienza, che rende più facile per un throughput più elevato analisi. Inoltre, con una maggiore automazione, i passaggi di lavaggio possono essere effettuati più velocemente, e c'è una maggiore coerenza tra gli esperimenti o sperimentatori. Tuttavia, la stazione di lavaggio presenta alcuni inconvenienti: grandi volumi di buffer di lavaggio sono necessari per la rondella di adescamento (150 mL ogni cambiamento di buffer, di cui 50 mL è utilizzato per il lavaggio); cura supplementare è necessaria quando si maneggia la piastra per evitare qualsiasi contaminazione dei pozzi a causa di partizionamento limitato tra i pozzetti della piastra piccolo-volume; buffer di residuo di 25 µ l nei pozzetti dopo lavaggio richiede l'uso di reagenti preparati a un più elevato di concentrazione di 1 x. Per risolvere i problemi di volume residuo e capacità di volume limitato della piastra, può essere aggiunto un accessorio per espandere il volume di incubazione da 70 µ l a 150 µ l, facilitando l'adozione di protocolli convenzionali. Mentre i sistemi di movimentazione automatizzata piastra sono attualmente disponibili, che hanno un'impronta significativa rispetto al sistema di lavaggio laminare, che è una piccola unità di ~ 1 piede cubico (~0.028 m3). Inoltre, l'integrazione di centrifugazione in piastra automatizzato, sistemi di movimentazione è impegnativo, limitando il loro uso nel lavaggio delle cellule. Non ci sono attualmente nessun altra cella centrifuga-indipendente lavaggio degli strumenti disponibili, per quanto sappiamo.

La strategia di screening qui presentata è in grado di identificare piccole molecole e loro chinasi destinazione presunta, che colpiscono TCR di segnalazione e attivazione delle cellule T. La libreria utilizzata qui comprende principalmente piccole molecole inibitori delle chinasi ed era in grado di generare un numero di hit potenzialmente interessanti. Il protocollo può anche essere prontamente applicato librerie inibitore di altre classi di enzimi o ad altri tipi di piccole molecole, così come librerie di altri composti (per esempio, varie macromolecole). Il protocollo è utilizzabile anche per altri tipi di cellule, quali i linfociti T periferici o cellule immortalizzate, compresi quelli che esprimono TCR transgenici o che trasportano sistemi reporter a schermo. Identificare e caratterizzare nuovi mediatori del T-cell signaling può migliorare la nostra conoscenza del pathway di segnalazione e anche un aiuto nello sviluppo della terapia mirata in malattie immuni13,14,15, 16. nel complesso, questo studio aggiunge alla gamma di opzioni disponibili per la rilevazione dei mediatori di segnalazione tramite HTS saggi di T-cellulare.

Disclosures

L'autore Chyan Ying Ke è un dipendente di Curiox Biosystems, che produce la cellula DA lavatrice e piastre DA-cellulare utilizzati in questo articolo.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Consiglio del Singapore Ministero della sanità nazionale delle ricerche mediche, NMRC CBRG15may017 e il Ministero dell'istruzione, 2014 Singapore-T2-1-136 (a N.R.J.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI HyClone SH30027FS
FBS HyClone SH3007103
L-Glutamine HyClone SH3003401
Sodium pyruvate HyClone SH3023901
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
b-mercaptoethanol Sigma Aldrich 516732 
10X PBS Vivantis PB0344 – 1L
Kinase Screening Library (96-Well) Cayman Chemical 10505 Exact contents of the library may vary
DMSO Sigma Aldrich D2650
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 
anti-CD3/CD28 beads Thermo Fisher Scientific 11452D
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit BD Pharmingen 550480 Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody
DA-Cell Washer CURIOX HT1000
96-well DA-Cell Plate CURIOX 96-DC-CL-05
Antibodies
CD3e BioLegend 100236
TCRb BD Biosciences 553174
CD4 BD Biosciences 740007
CD8 BD Biosciences 563786
CD69 eBioscience 25-0699-42
Inhibitors
TG003 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PKC 412 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Doramapimod Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Paclitaxel Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erlotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-5 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-BEZ235 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Phthalazinone pyrazole Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-879 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
1-NA-PP1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Torin 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide II Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIBF 1120 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SMI-4a Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10657 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-703026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Chelerythrine chloride Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Tunicamycin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
GSK 1059615 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Ruxolitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 505124 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
INK128 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Canertinib (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 431542 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 173074 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Valproic Acid (sodium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 0325901 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
VX-702 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Emodin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CHIR99021 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIO Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Imatinib (mesylate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sunitinib Malate Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Gefitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
3-Methyladenine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide I Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IV Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide V Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 663284 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D 4476 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NU 7026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-9 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Indirubin-3'-monoxime Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-62 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-93 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CGP 57380 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Iso-Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VIII (acetate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ST638 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6656 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY364947 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10621 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
YM-201636 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 447439 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-041164 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP242 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ABT-869 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10622 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
17β-hydroxy Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10626 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6668 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10572 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
N,N-Dimethylsphingosine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY294002 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
U-0126 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Staurosporine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-92 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 (potassium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
O-1918 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 98059 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 169316 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TGX-221 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
OSU03012 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
JNJ-10198409 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Arachidonic Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lauric Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-252424 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10505 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI-103 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PIK-75 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sphingosine Kinase Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Piceatannol Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(R)-Roscovitine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BAY-43-9006 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10561 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-604850 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI3-Kinase α Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ML-9 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Triciribine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erbstatin Analog Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Kenpaullone Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-494 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-825 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1478 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 216763 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 415286 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-17 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-8 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LFM-A13 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-514 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Apigenin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10554 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
DRB Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-13022 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-14620 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-490 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-82 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-99 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-213 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-183 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lavendustin C Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 336372 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
5-Iodotubercidin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 202190 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10571 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Nilotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SP 600125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
L-threo-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-89 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
HA-1077 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-370 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1296 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KT 5823 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Janex 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10574 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10575 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10576 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NH125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TWS119 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 210902 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10577 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10578 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 184161 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CCT018159 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Myricetin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
  2. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
  3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
  4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
  5. Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
  6. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  7. Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
  8. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  9. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
  10. Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
  11. Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
  12. Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
  13. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  14. Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
  15. Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
  16. Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
  17. Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
  18. Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
  19. Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
  20. Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
  21. Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
  22. Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
  23. Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
  24. Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
  25. Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
  26. Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
  27. Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
  28. Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. Novel compounds. , (2003).
  29. Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
  30. Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
  31. Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
  32. Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
  33. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
  34. Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
  35. Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
  36. Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
  37. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
  38. Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).

Tags

Immunologia e infezione numero 143 attivazione di Caspase-3 inibitori delle chinasi biblioteca di screening TCR segnalazione attivazione a cellula T selezione di timociti
Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione <em>tramite</em> lo Screening di librerie chimiche inibitore
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek,… More

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter