本实验方案的目的是演示如何通过将拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗的子叶浸入含糖培养基溶液中，诱导其子叶上形成簇生型气孔，并演示如何利用共聚焦激光显微镜观察簇生气孔保卫细胞中的叶绿体和微管等细胞内结构。
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本文内容
摘要
摘要
气孔运动介导植物的气体交换，这对光合作用和蒸腾作用至关重要。气孔的开放和关闭分别通过保卫细胞体积的显著增加和减少来实现。由于在气孔运动过程中，离子和水在保卫细胞与较大的邻近表皮细胞之间发生穿梭运输，因此植物气孔的间隔分布被认为是有利于气孔运动的最优分布。扰动气孔间隔模式的实验系统有助于研究这种间隔模式的重要性。目前已鉴定出多个与气孔间隔分布相关的关键基因，通过改变这些基因可实验性地诱导产生簇状气孔。此外，也可在不进行遗传修饰的情况下，通过外源处理诱导形成簇状气孔。本文介绍了一种通过将拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗浸入含蔗糖的培养基溶液中，简单诱导其形成簇状气孔的实验方法。该方法操作简便，可直接应用于转基因株系或突变体株系。蔗糖诱导的簇状保卫细胞在细胞生物学上的一个显著特征是含有较大的叶绿体。此外，本文还展示了一张典型的共聚焦显微镜图像，用于观察簇状保卫细胞内的皮层微管结构。结果显示，在簇状保卫细胞中，皮层微管的辐射状排列方向与对照条件下间隔分布的保卫细胞中一致得以维持。
引言
植物气孔是光合作用和蒸腾作用中气体交换的重要器官，气孔的运动通过保卫细胞中由离子驱动的水分吸收与释放所引起的显著变化而实现。在显微镜下，我们可以观察到气孔在叶片和茎表面呈空间分布的模式。这种气孔的空间分布被认为有助于气孔的运动，该过程由保卫细胞与邻近表皮细胞之间的离子和水分交换所调控1,2。诱导气孔成簇分布的实验系统有助于研究气孔空间分布的重要性。
据报道，通过遗传修饰气孔保卫细胞分化相关的关键基因可诱导气孔的空间成簇现象。3,4 或使用化学化合物处理5我们还报道了，用添加了包括蔗糖、葡萄糖和果糖等糖类的培养基溶液进行浸润处理，会导致子叶气孔聚集现象 拟南芥 幼苗6在蔗糖处理的子叶表皮中，观察到分隔分生组织细胞和表皮细胞的新细胞壁中胼胝质减少，表明蔗糖溶液浸润处理对细胞壁产生负面影响，可能导致气孔细胞分化关键基因产物的泄漏和异位作用例如 转录因子）向邻近的表皮细胞6. 类似机制已在相关研究中被提出 gsl8/chor 突变体7,8利用含蔗糖培养基溶液可重复诱导簇状气孔的实验体系操作简便且成本低廉。该体系还可应用于表达标记细胞内结构荧光蛋白的转基因植株，以研究簇状保卫细胞中的细胞器和细胞骨架等亚细胞结构。9,10.
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方案
1. 含3%蔗糖的1/2 Murashige-Skoog培养基溶液的制备
- 向烧杯中加入 1.1 g Murashige-Skoog 培养基盐和 15 g 蔗糖。
- 加入 490 mL 蒸馏水，使用搅拌子充分混匀。
- 用 KOH 调节 pH 至 5.8。
- 用蒸馏水定容至 500 mL，并将溶液转移至培养基瓶中。
- 通过高压灭菌（121 °C，20 分钟）对溶液进行灭菌。若不立即使用，灭菌后可于 4 °C 保存。
2. 通过含蔗糖培养基溶液浸润处理诱导簇状气孔
- 对种子进行灭菌。
- 通过将500 µL含5%有效氯的NaClO溶液和1 µL 10% Triton X-100加入500 µL无菌水中，配制灭菌溶液。
- 取约50粒携带荧光标记（如CT-GFP11或GFP-TUB612）的转基因A. thaliana种子，放入1.5 mL离心管中。
- 加入1 mL 70%乙醇溶液，轻轻颠倒混匀5次，静置1分钟。
- 种子将沉至管底。在超净工作台上，用移液器小心吸除70%乙醇，加入1 mL灭菌溶液，轻轻颠倒混匀5次，静置5分钟。
- 清洗种子。仍在超净工作台的无菌条件下，用移液器小心吸除溶液，加入1 mL无菌水。重复此步骤5次。
- 在超净工作台上，向24孔板的每孔中加入1.5 mL含3%蔗糖的灭菌1/2 Murashige-Skoog培养基溶液。
- 向每孔中接种两粒灭菌后的种子。用两层封口膜将板盖封好。
- 将24孔板转移至培养室中，在23.5 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下培养，白光光照强度为100 µmol m−2 s−1，培养14天。
3. 成簇气孔的显微观察
- 从24孔板的一个孔中取30 µL含3%蔗糖的1/2 Murashige-Skoog培养基溶液，滴加到载玻片（尺寸：76 × 26 mm，厚度：1.0–1.2 mm）中央。
- 用解剖剪取一片14天龄幼苗的子叶，将子叶观察面朝上漂浮于液滴中。
- 按照我们之前的方法13制备子叶样品。具体而言，取30 µL溶液滴加到盖玻片（尺寸：18 × 18 mm，厚度：0.12–0.17 mm）中央。将盖玻片倒置，轻轻覆盖在子叶上，用无绒纸巾擦去多余的缓冲液。
- 将样品置于共聚焦激光显微镜载物台上，使用明场照明选择成簇的保卫细胞进行观察。
- 根据显微镜制造商的操作说明，采集荧光标记的细胞内结构的共聚焦图像。
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结果
此处介绍了一种利用含蔗糖培养基溶液诱导气孔成簇的简易实验方案 A. thaliana 幼苗的展示已完成。在含蔗糖的培养基溶液中培养出成簇的保卫细胞（图1B) 的叶绿体大于在无蔗糖对照条件下培养的保卫细胞的叶绿体（图1A）。通过 CT-GFP 确认了叶绿体的增大11，一种叶绿体基质标记物，以及叶绿素自发荧光（图1C-F)，表明蔗糖处理导致叶绿体中淀粉粒的积累 通过 蔗糖溶液吸收。此外，对GFP-TUB6进行共聚焦观察12 结果显示，即使在蔗糖处理的成簇保卫细胞中，皮层微管仍呈辐射状排列，与无蔗糖对照条件下分散的保卫细胞中的情况相似（
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讨论
我们介绍了通过将拟南芥（A. thaliana）幼苗浸入含蔗糖的培养基溶液中诱导簇状气孔形成的实验方案。如本文所示，该方法非常简便，无需特殊操作技能，却能高效诱导簇状气孔的形成。在使用含3%蔗糖的培养基溶液处理时，超过45%的保卫细胞呈现簇状排列（基于20次以上独立观察的平均值）6。此外，该实验体系可直接应用于转基因株系或突变体株系，例如表达CT-GFP（图1）或GFP-TUB6（图2）的转基因株系。尽管本文仅展示了静态图像，但该系统也适用于在气孔发育过程中进行时间序列的动态观察。
请注意，该方法基于人工外源性处理，因此我们不能排除蔗糖溶液浸泡处理可能引起与气孔分布无直接关联的现象。事实上，处理会导致保卫细胞叶绿体膨大图1这可能是由于淀粉粒在叶绿体中的积累所致 通过 蔗糖溶液吸收。此外，在蔗糖诱导的成簇保卫细胞中观察到较小...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢长泽井正一郎教授对我们工作的大力支持。本研究得到了日本促进科学振兴会（JSPS）科研资助项目（KAKENHI）资助号17K19380和18H05492、住友财团基础科学研究项目资助号160146以及佳能基金会向T.H.提供的资助。本实验体系的建立获得了日本促进科学振兴会（JSPS）KAKENHI资助号26891006对K.A.的经费支持。我们感谢Edanz集团（www.edanzediting.com/ac）的Robbie Lewis理学硕士对稿件初稿进行的编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm 激光器 | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm 激光器 | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm 长通滤光片 | 奥林巴斯 | BA510IF | |
| 524 - 546 nm 带通滤光片 | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm短通滤光片 | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm 激光器 | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm 带通滤光片 | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| 共聚焦激光扫描头 | 横河 | CSU10 | |
| 共聚焦激光扫描头 | Olympus | FV300 | |
| 冷却CCD相机 | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| 图像采集软件 | Molecular Devices | MetaMorph 版本 7.8.2.0 | |
| 图像采集软件 | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| 浸油 | 奥林巴斯 | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 （23 摄氏度） |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX-70 | |
| 倒置显微镜 | 奥林巴斯 | IX-71 | |
| Murashige和Skoog植物盐混合物 | 富士胶片和光纯药株式会社 | 392-00591 | Murashige T 和 Skoog F（1962）用于烟草组织培养快速生长和生物测定的改良培养基。Physiologia Plantarum 15(3), 473-497。 |
| 物镜 | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA 油镜虹膜 1.35 | NA = 1.35 |
| 物镜 | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| 蔗糖 | 富士胶片和光纯药株式会社 | 196-00015 |
参考文献
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重印与许可
