一种从人死后小脑激光捕获显微切割浦肯野细胞中提取高质量RNA的可靠方案

摘要

本方案采用免染色方法，通过激光显微切割技术在人死后小脑的新鲜冷冻组织中可视化并分离浦肯野细胞。本方案的目的是获得足量的高质量RNA，用于RNA测序。

摘要

激光捕获显微切割（LCM）是一种有利的工具，可从异质组织中收集细胞学和/或表型相关的细胞或区域。所捕获的产物可用于多种分子生物学方法，以分离蛋白质、DNA或RNA。然而，从死后人脑组织中保存RNA尤其具有挑战性。LCM常用的可视化技术需要组织学或免疫组织化学染色步骤，而这些步骤可能进一步降解RNA。因此，我们设计了一种无染色的LCM可视化方案，旨在保持死后人脑组织中RNA的完整性。由于浦肯野细胞体积较大且具有特征性位置，是实现无染色可视化的理想候选细胞。小脑皮层具有明显的分层结构，各层在细胞密度上存在差异，因此在高倍显微镜下易于识别，是理想的形态学模型。浦肯野细胞是位于颗粒细胞层与分子层之间的大型神经元：颗粒细胞层由大量小型神经元密集排列而成，而分子层的细胞体则较为稀疏。由于这种独特的结构，无染色可视化方法在此具有可行性。其他具有类似表型特征的器官或细胞系统也同样适用该方法。本无染色方案采用乙醇固定新鲜冷冻组织，并使用二甲苯去除脂质，以提高高倍光学显微镜下的形态学可视性。该方案不适用于其他固定方法，专为使用紫外（UV）-LCM系统捕获的新鲜冷冻组织样本设计。本文中，我们提供了一套完整的操作流程，包括新鲜冷冻的死后人脑小脑组织切片与固定，以及通过UV-LCM分离浦肯野细胞后进行RNA纯化，同时保持RNA质量以满足后续RNA测序的要求。在我们的实验条件下，该方案可在无需染色试剂的情况下实现优异的细胞可视化效果，并获得高质量的RNA（RNA完整性数值≥8），完全满足转录组分析实验的需求。

引言

激光捕获显微切割（LCM）是一种有价值的研究工具，可分离具有病理学意义的细胞，用于后续以分子为导向的分析评估。在这些异质性组织样本中进行分子分析，并将其与病理学和临床数据相关联，是评估生物学研究转化意义的必要步骤¹。在分析来自RNA的基因表达数据时，强烈推荐使用冷冻组织切片，因其可获得高质量且最大量的RNA²。已有充分证据表明，高质量和高产量的RNA对于获得有意义的RNA测序数据至关重要³。然而，在使用新鲜冷冻的死后组织RNA进行LCM时，RNA降解是一个主要挑战，因为降解在死亡后立即发生，其程度受组织采集方法相关多种因素的影响^4,5。此外，当需要染色技术以识别组织学细节和细胞鉴定时，RNA降解会进一步加剧。特殊的染色技术，如苏木精与伊红（hematoxylin & eosin）、尼氏染色（Nissl stain）、免疫荧光和免疫组织化学，有助于将细胞与周围间质区分开来，但已被证明会降解RNA并改变转录表达谱⁶。因此，本实验室建立了一套严格的方案，专门用于在LCM分离浦肯野神经元后，对死后人小脑组织中的RNA进行保存，以用于RNA测序。

在对新鲜冷冻组织进行激光显微切割（LCM）处理时，固定方法对RNA和组织完整性均可能产生不同程度的影响。福尔马林固定是形态学保存的标准方法，但会引起交联反应，可能导致RNA断裂并干扰后续的RNA扩增⁷。乙醇固定则是RNA提取更理想的替代方案，因其属于凝固性固定剂，不会诱导交联反应¹。为了增强组织形态的可视化效果，二甲苯是最佳选择，因为它能够去除组织中的脂质成分。然而，在LCM中使用二甲苯存在已知局限性：组织容易脱水变脆，导致激光捕获时发生组织碎片化⁷。此外，二甲苯具有挥发性和毒性，必须在通风橱中规范操作。尽管如此，已有研究表明二甲苯在增强组织可视性的同时，仍可较好地维持RNA的完整性⁸。因此，本实验方案的核心在于采用70%乙醇进行固定和乙醇脱水，随后经二甲苯孵育以获得清晰的组织形态。

需要注意的是，基于激光的显微切割系统有多种不同类型，它们在速度、精度和RNA质量方面已显示出差异。红外（IR）激光捕获显微切割和紫外（UV）激光束显微切割系统是两种几乎同时出现的新型LCM平台⁸。IR-LCM系统采用一种"接触式系统"，通过将透明热塑性膜直接放置在组织切片上，利用红外激光的聚焦脉冲使目标细胞选择性地黏附到膜上。相比之下，UV-LCM系统是一种"非接触式系统"，其聚焦激光束可切割组织中特定的细胞或区域；根据目前两种商用平台的配置（分别采用倒置或正置显微镜设计），组织可通过激光诱导的压力波克服重力弹射进入收集装置，或依靠重力自然落入收集装置。UV-LCM系统的主要优势包括细胞获取速度更快、非接触方式避免污染，以及由于激光束直径更小而实现更精确的切割⁹。本实验方案专为UV-LCM系统设计，尚未在IR-LCM系统中进行测试。在任一种UV-LCM系统中，当将细胞累积至收集帽时，不宜使用可增强显微镜下细胞清晰度的盖玻片，因为细胞将无法进入收集帽。因此，为了增强组织可视化效果，我们比较了不透明收集帽与液体填充收集帽的使用效果，其中不透明收集帽专为在UV-LCM系统中实现显微观察时充当盖玻片而设计。而液体填充收集帽可能存在操作困难，因其内部液体容易蒸发，需在显微镜操作过程中频繁补充。时间成为影响RNA稳定性的关键因素，因为捕获的组织会立即溶解⁷。

本实验室研究伴有原发性震颤（ET）及相关小脑神经退行性疾病患者死后小脑的神经病理学改变。我们已证实，与对照组相比，ET病例中存在以浦肯野细胞为中心的形态学改变，包括浦肯野细胞数量减少、树突退化增加以及多种轴突改变，由此我们提出，浦肯野细胞变性是ET发病机制中的核心生物学特征^10,11,12,13。转录谱分析已被广泛应用于多种神经系统疾病，以探索变性细胞改变的潜在分子基础。然而，来自异质性样本（如脑组织区域）的转录谱可能有效掩盖低丰度转录本的表达，和/或削弱仅在少数受影响细胞（如小脑皮层中的浦肯野细胞）中发生的分子变化的检出能力。例如，小脑皮层中浦肯野细胞的数量远远少于丰富的颗粒细胞，比例约为1:3000；因此，要有效靶向其转录组，必须对这些神经元进行特异性分离。小脑皮层具有不同细胞密度和细胞大小的明确分层结构。这种细胞架构非常适合在新鲜冷冻组织样本中进行可视化观察，无需使用含染料的染色试剂。理论上，本方案也可适用于其他具有类似显著组织结构的组织类型。

本方案专为人类死后小脑中浦肯野细胞的可视化而设计。针对多种组织的固定、染色可视化以及RNA保存，已有大量适用于红外激光捕获显微切割（IR-LCM）和紫外激光捕获显微切割（UV-LCM）的实验方案。在设计UV-LCM实验时，研究人员应根据起始材料和终末材料的需求和要求，对方案进行个性化优化。本文结合了多种LCM方案的优点，提出一种改进方法，可在无需使用含染料的染色试剂的情况下，实现死后人脑小脑中浦肯野细胞的有效可视化，并制备高质量RNA用于转录组测序。

方案

本方案中使用的所有人类样本均在获得知情同意后获取，并已通过哥伦比亚大学和耶鲁大学的机构审查委员会（IRB）批准。

注意：本实验方案的全部操作均应遵循严格的RNA操作规范，即始终佩戴手套，所有工作表面均需使用RNase去污染剂清洁，所有实验器材和试剂均须无RNA、DNA及核酸酶。

1. 在开始激光显微切割前检测组织 RNA 的完整性

注意： RNA质量检测可通过多种方法进行。应确保检测整个切片来源的RNA，以获得能够代表样本的RNA完整性数值（RIN）。

1. 根据实验设计的参数仔细选择适合的组织样本。若需在冷冻切片机中进行切片，则进入步骤 1.2；若不需要，则相应地处理组织并进入步骤 1.11。
2. 准备两个干冰容器，容器大小取决于样本数量。
   1. 在第一个干冰容器中，放置一个空的、已标记组织编号的 2 mL 离心管。
      注意：离心管需冷冻约 10 分钟才能完全冻结。必须在将组织放入前确保离心管已充分冷冻；否则，组织会因管壁温度过高而融化。
   2. 在第二个干冰容器中，放置需进行 RNA 检测的、来自 -80 °C 冰箱的组织样本。
3. 清洁冷冻切片机。详细清洁步骤参见步骤 4.7。
4. 从干冰中取出组织，使用经 RNase 去污染处理的剃须刀片切割一小块组织，组织大小约为 1 cm × 1 cm。
5. 在冷冻切片机的“持样块”（chuck）上放置一个约 3 mm 高的包埋剂（OCT）小堆，并使其部分冻结。随后将组织置于 OCT 表面，不要压入 OCT 中，仅让其自然贴附在表面即可。
6. 待 OCT 完全凝固后，将带有组织的持样块安装至冷冻切片机的切片臂上，并将其定位至切片刀前方。
7. 以 30 μm 的厚度修片，直至组织表面平整。
8. 切下 300 μm 厚的组织切片，放入已预冷的 2 mL 离心管中，并立即将离心管放回干冰中。
9. 将组织从持样块上取下，放回干冰中暂存，待后续保存。
10. 对所有组织重复执行步骤 1.4 至 1.9。
11. 完成所有样本处理后，使用提供的 RNA 提取试剂盒（材料表 #15）提取 RNA。试剂盒附有详细操作流程，请严格按照说明书操作，包括可选的收集管膜干燥步骤以及可选的 DNase 消化步骤（材料表 #16）。
12. 通过质量评估生物分析仪检测所提取 RNA 的完整性¹⁴。

2. 准备激光捕获显微切割切片前的步骤

1. 在进行显微切割（LCM）组织切片前，清洁载玻片架。应在使用前一天进行清洁，以确保过夜完全干燥。
   注意：载玻片架用于组织切片在乙醇中的固定以及二甲苯中的透明处理。
   1. 载玻片架清洁程序：先用RNase去污染剂冲洗，再用焦碳酸二乙酯处理水（DEPC水）冲洗。倒置放置于无RNA/DNA/核酸酶的洁净表面，避免灰尘或其他空气传播污染物，过夜彻底干燥。
      注意： DEPC具有高毒性，必须按照环境健康与安全（EH&S）标准对危险化学品的规范进行操作和处置。
2. 用RNase去污染剂清洁切片用刷子，并过夜晾干。避免灰尘及其他污染物。
3. 将膜载玻片置于室温下紫外光照射30分钟。切勿在使用前超过1–2天暴露于紫外光下。此步骤可增强组织与膜载玻片之间的结合力。
   注意： 步骤2.3可与步骤4合并，使载玻片的紫外处理与组织切片在同一天进行（见步骤4.4）。

3. 使用无RNase水和高质量乙醇配制固定液

注意：所有溶液均需在每次实验前新鲜配制。确保已完成步骤 1.1 中的载玻片架清洗程序。所有溶液均在载玻片架中配制。

1. 在一个切片架中加入 30 mL 的 100% 乙醇。
2. 用无 RNase/DNase/核酸酶的水稀释乙醇。在一个切片架中加入 30 mL 的 95% 乙醇，并置于冰上。
3. 用无 RNase/DNase/核酸酶的水稀释乙醇。在一个切片架中加入 30 mL 的 70% 乙醇，并置于冰上。
4. 在两个独立的切片架中各加入 30 mL 的 100% 二甲苯，并标记为 #1 和 #2。

4. 准备冷冻切片机以进行组织切片

1. 准备一桶冰用于乙醇溶液，并准备一个装有干冰的容器用于组织。
   注意：干冰温度极低，操作时需佩戴防护手套。切勿将冰和干冰放置在同一容器中。冰与干冰温度不同，会导致两者在不确定的温度下凝结在一起。
2. 从 -80 °C 冰箱中取出组织，并置于干冰上，运送至冷冻切片机。
3. 冷冻切片机设置：
   1. 将切片厚度设为 14 μm。
   2. 修片厚度设为 30 μm，以保留足够的组织量。
   3. 对于具有双温控（腔体与样品持载温度）的冷冻切片机，将腔体温度（CT）设为 -18 °C；对于仅有一个温度设置的冷冻切片机，将温度设为 -17 °C。
   4. 对于具有双温控的冷冻切片机，将样品温度（OT）设为 -16 °C。
      注意：OT 必须高于 CT，以确保切片均匀。若组织仍出现撕裂，可将 OT 升至 -15 °C，同时将 CT 升至 -18 °C。
4. 将组织放入冷冻切片机中至少 20 分钟，使其达到最佳切片温度。
   注意：若组织未达到最佳温度，切片时会撕裂。切勿在前一晚将组织置于 -20 °C 环境中，以免影响 RNA 完整性并防止冰晶形成。应给予组织足够时间平衡至最佳温度，以实现顺畅切片。可在此步骤选择性实施载玻片的紫外照射处理（见步骤 1.3）。
5. 将“持样头”（chuck）放入冷冻切片机中至少 20 分钟，使其温度降至与冷冻切片机一致。
6. 将清洁的刷子放入冷冻切片机中至少 20 分钟，使其温度降至与冷冻切片机一致。
7. 清洁冷冻切片机
   1. 使用 RNase 去污染剂与 70% 乙醇按 1:1 比例混合，并用 RNA/DNA/核酸酶-free 水稀释，清洁切片机载物台，以防止液体在台面结冰。
   2. 用 RNase 去污染剂清洁新的一次性冷冻切片刀片，并将其安装至载物台的刀片夹持器中。至少静置 20 分钟，使刀片温度与冷冻切片机一致。
   3. 用 RNase 去污染剂清洁防卷板，并将其安装至载物台。至少静置 20 分钟，使防卷板温度与冷冻切片机一致。
      注意：防卷板并非切片必需，但强烈推荐使用。若无防卷板，清洁的刷子可作为替代。若防卷板未达到适当温度，组织在切片时会融化或粘连。

5. 组织切片

1. 取一小块组织（约 1 cm × 1 cm）用于切片。将剩余组织放回干冰或 -80 °C 冰箱中保存。
   注意：确保组织切片中约 95% 为小脑皮层，即浦肯野细胞所在区域。
2. 在“持样头”（chuck）上放置约 3 mm 高的 OCT 包埋剂小堆。以缓慢的环形运动逐层叠加，直至形成一个小隆起。
3. 当 OCT 部分冻结但仍中心尚存液体时，将组织置于 OCT 表面。切勿将组织深压入 OCT 中。让组织停留在 OCT 表面直至完全冻结，此过程需 1–2 分钟。
4. 将带有冻结 OCT 和组织的“持样头”安装至冷冻切片机的切片臂上。调整组织位置，使其与切片刀刃齐平。
5. 让组织在切片臂中静置 15–20 分钟，以适应新温度。
   注意：根据组织厚度不同，需一定时间进行温度适应。应让组织充分静置，直至可干净利落地切片。可调节 OT 和 CT 以辅助组织温度适应。
6. 缓慢将组织移近刀刃。当组织接触刀刃后，开始修片。修片厚度应设为 30 μm。
7. 修片 2–3 次，直至可见皮层各层结构。
8. 将防卷板置于冷冻切片机刀片正上方，并进行对齐。
   注意：冷冻切片机内的光线会在刀片与防卷板交界处形成一条银线，表明防卷板已准确位于刀刃正上方。
9. 开始以 14 μm 厚度进行切片。切片成功时，组织片将在防卷板下方保持平整。
   注意：若组织粘连，需确保防卷板足够低温。必要时，可在防卷板外侧（不接触载物台的一侧）放置一块干冰，以快速冷却防卷板。
10. 连续切取 4–6 张切片，并在冷冻切片机载物台上水平排列。
11. 倾斜载玻片，一次性拾取所有组织片。
    注意：使用毛刷轻轻抬起组织末端，使其更易于被载玻片拾取。切勿逐张拾取组织，因暴露于室温空气中会降低 RNA 的完整性。
    警告：切勿让膜接触冷冻切片机的载物台。若膜接触载物台，将开始从玻片上脱落，导致显微切割（LCM）操作时出现错误。
12. 立即进入第 6 步，切勿延迟固定。

6. 组织固定/无染色可视化

1. 立即进入乙醇固定步骤
2. 将载玻片放入盛有70%乙醇的载玻片架中，冰上孵育2分钟。
3. 将载玻片放入盛有95%乙醇的载玻片架中，冰上孵育45秒。
4. 将载玻片放入盛有100%乙醇的载玻片架中，室温孵育2分钟。
5. 将载玻片在盛有二甲苯1的载玻片架中浸没3次，室温操作。
6. 将载玻片放入盛有二甲苯2的载玻片架中，室温孵育5分钟。
7. 在洁净环境中干燥至少30分钟。更长的干燥时间更佳，最长可达60分钟。
   注意：将载玻片竖立放置于通风橱内干燥。二甲苯具有挥发性。若将载玻片平放，会导致二甲苯在组织切片上积聚，使组织过深染色。

7. 可选步骤——玻片保存

1. 将干燥的载玻片分别放入50 mL离心管中（每管一张载玻片），置于-80 °C超低温冰箱中保存，最长可保存7天。
   注意：载玻片在放入-80 °C超低温冰箱前必须完全干燥。切勿在管内使用干燥剂，因为干燥剂颗粒可能嵌入组织和膜中。确保管盖拧紧；否则在解冻使用时，载玻片表面会产生冷凝水。
   警告：RNA完整性在7天后会下降，组织可视化质量也会随之降低。

8. 解冻保存的载玻片以供使用

1. 使用前1小时，从-80 °C冰箱中取出装有单张切片的管子。
2. 不要立即打开管子，让管子恢复至室温。仅在管子外部出现冷凝水。
3. 待管子恢复至室温且所有冷凝水消失后（约30–40分钟），打开管盖，使切片暴露于室温空气中。
4. 让切片在室温下平衡15–20分钟。将切片留在打开管盖的管子内。
   注意：切片现已准备好进行激光显微切割（LCM）。

9. 浦肯野细胞的激光捕获显微切割：

注意：本实验方案部分仅讨论与捕获浦肯野细胞以进行后续RNA测序相关的具体操作。本部分假设使用者已熟悉紫外激光显微切割仪及其配套软件的操作。

1. 使用RNase去污染剂清洁显微镜载物台和帽收集臂。
2. 戴手套后，将载玻片放置在显微镜上，并将500 μL不透明帽放入收集臂中。
   注意：操作过程中始终遵循正确的RNA操作规范，使用RNase去污染剂清洁工作区域，并在接触载玻片或不透明帽时佩戴手套。一旦载玻片和帽放置到位并开始激光捕获，即可脱去手套。
3. 在低倍镜下，将不透明帽对准小脑组织，确保帽覆盖目镜中可见的整个区域。
   注意：仅通过显微镜目镜可判断不透明帽是否居中。摄像头画面无法显示帽是否准确对准组织。根据激光捕获显微镜的设计不同，通过不透明帽的观察视野可能仅出现在目镜中，或同时在目镜和摄像头中可见。
4. 使用5x–10x物镜观察小脑各层结构，并将光标置于分子层与颗粒细胞层交界处（即浦肯野细胞层）。
5. 切换至40X物镜，观察浦肯野细胞。
   注意：示例图像参见 图1 和 图2。
6. 开始捕获浦肯野细胞。
   注意：进行RNA测序时，至少需要5 ng的RNA。大约1600–2000个浦肯野细胞可提供足够的RNA材料用于测序。RNA在显微镜下可保持稳定长达8小时。收集前应测试紫外能量和紫外聚焦，以确保参数设置正确。随着时间推移，组织会逐渐干燥，可能需要调整紫外能量和聚焦参数。

10. 激光显微切割后RNA的收集

1. 配制细胞裂解缓冲液（每次使用前新鲜配制）
   1. 将2-巯基乙醇按1:100的比例（分别为10 μL:1 mL）加入裂解缓冲液中。裂解缓冲液（RLT缓冲液）见于材料表（#14 和 #15）。
2. 取50 μL细胞裂解缓冲液加入不透明盖帽中，盖帽朝上放置。小心将管体盖在盖帽上。
3. 将管子倒置放置1分钟。
4. 涡旋振荡管子30秒，并迅速离心使裂解缓冲液沉至管底。
5. 打开管子，重复步骤10.2–10.4。
6. 将含有100 μL裂解缓冲液的管子以及来自-80 °C冰箱的RNA样品放置于冰上，待所有样本处理完毕后立即进行RNA提取（材料表 #14）。

结果

本方案详细说明了为紫外激光显微切割（UV-LCM）制备新鲜冷冻的死后人脑组织的步骤。由于高精度切割新鲜冷冻脑组织较为困难，本文对冷冻切片机切片过程提供了详尽的说明和注释。最关键的注意事项是，新鲜冷冻组织温度极低，需要较长时间才能适应冷冻切片机内较高的温度。此步骤不可仓促进行，其在本方案成功与否中的核心作用再怎么强调也不为过。若组织在冷冻切片机中未得到妥善处理，则后续识别特定细胞或感兴趣区域的尝试将极为困难，甚至无法实现。

经过冷冻切片和规定的干燥时间后，组织即可用于激光显微切割（LCM）。在显微镜下观察时，使用5倍和10倍物镜可清晰看到小脑的细胞层。图1展示了仅用乙醇固定的组织（图1A）以及乙醇固定后经二甲苯孵育的组织（图1B...

讨论

本文所述方案经过专门优化，旨在为紫外激光显微切割（UV-LCM）提供一种无需染色即可清晰显示形态学差异组织的方法。该方法在增强组织可视化的前提下，最大限度地保持RNA完整性，以适用于后续的直接RNA测序。能够准确区分不同细胞类型并进行捕获，从而获得尽可能均一的细胞群体，这对于解析人体组织中不同的分子特征至关重要¹⁵。在本方案中，组织选择尤为关键，因为未使用任何抗原或染料特异性试剂，因此不适用于需要此类特异性识别的研究。尽管这是本方案的局限性，但其所获得的组织可视化效果和RNA完整性在其他实验设计中仍具有显著优势。目前已有多种其他方案采用不同的染色方法，专门用于紫外或红外激光显微切割（UV-和IR-LCM），以期在染色的同时保护RNA完整性。然而，大多数现有方法至少包含一种染色剂或抗原特异性试剂^6,16,17，或仅针对特定细胞类型或器官类型设计（且非人源尸检组织）¹⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	适用于组织的膜片。我们不推荐使用玻璃载玻片。
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	不透明盖帽仅用于增强倒置显微镜下的可视化效果
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	其他RNase去污染产品也可使用。工作前用于清洁所有表面。
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	若使用其他乙醇，需确保其高纯度。对组织固定至关重要。
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	若使用其他二甲苯，需确保其高纯度。对组织可视化至关重要。
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	其他无RNA/DNA/核酸酶的水也可使用。仅用于乙醇稀释。
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	任何载玻片架或玻片罐均可使用。使用前必须清洁。用于切片后固定。
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	防卷板类型取决于冷冻切片机的型号及其在载物台上的安装位置。不同冷冻切片机要求各异。
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	任何供应商的DEPC均可使用。请按照说明进行水处理。
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes可从任何供应商订购，尺寸不限。用于清洁显微镜和冷冻切片机。
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	任何品牌的OCT均可接受。组织不会包埋于OCT中，仅用于将组织固定在“样品头”上。
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	刀片类型取决于冷冻切片机型号。不同冷冻切片机要求各异。
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	样品头类型取决于冷冻切片机型号。不同冷冻切片机要求各异。任一尺寸均可使用。
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	激光显微切割（LCM）后RNA提取所必需。RLT裂解缓冲液对从不透明盖帽中收集捕获细胞至关重要。
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	用于LCM前组织切片样本的RNA提取，以检测起始组织的RNA完整性。
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	DNase可去除所有DNA，从而获得纯化的RNA群体。确保DNase现配现用。
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	购买体积由用户自行决定。必须加入RLT缓冲液以实现细胞裂解。可抑制RNase活性。
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	任何2 mL、无RNase、无DNase、无人类DNA且无热原的离心管均可使用。