一种从人死后小脑激光捕获显微切割浦肯野细胞中提取高质量RNA的可靠方案

摘要

本方案采用免染色方法，通过激光显微切割技术在人死后小脑的新鲜冷冻组织中可视化并分离浦肯野细胞。本方案的目的是获得足量的高质量RNA，用于RNA测序。

摘要

激光捕获显微切割（LCM）是一种有利的工具，可从异质组织中收集细胞学和/或表型相关的细胞或区域。所捕获的产物可用于多种分子生物学方法，以分离蛋白质、DNA或RNA。然而，从死后人脑组织中保存RNA尤其具有挑战性。LCM常用的可视化技术需要组织学或免疫组织化学染色步骤，而这些步骤可能进一步降解RNA。因此，我们设计了一种无染色的LCM可视化方案，旨在保持死后人脑组织中RNA的完整性。由于浦肯野细胞体积较大且具有特征性位置，是实现无染色可视化的理想候选细胞。小脑皮层具有明显的分层结构，各层在细胞密度上存在差异，因此在高倍显微镜下易于识别，是理想的形态学模型。浦肯野细胞是位于颗粒细胞层与分子层之间的大型神经元：颗粒细胞层由大量小型神经元密集排列而成，而分子层的细胞体则较为稀疏。由于这种独特的结构，无染色可视化方法在此具有可行性。其他具有类似表型特征的器官或细胞系统也同样适用该方法。本无染色方案采用乙醇固定新鲜冷冻组织，并使用二甲苯去除脂质，以提高高倍光学显微镜下的形态学可视性。该方案不适用于其他固定方法，专为使用紫外（UV）-LCM系统捕获的新鲜冷冻组织样本设计。本文中，我们提供了一套完整的操作流程，包括新鲜冷冻的死后人脑小脑组织切片与固定，以及通过UV-LCM分离浦肯野细胞后进行RNA纯化，同时保持RNA质量以满足后续RNA测序的要求。在我们的实验条件下，该方案可在无需染色试剂的情况下实现优异的细胞可视化效果，并获得高质量的RNA（RNA完整性数值≥8），完全满足转录组分析实验的需求。

引言

激光捕获显微切割（LCM）是一种有价值的研究工具，可分离具有病理学意义的细胞，用于后续以分子为导向的分析评估。在这些异质性组织样本中进行分子分析，并将其与病理学和临床数据相关联，是评估生物学研究转化意义的必要步骤¹。在分析来自RNA的基因表达数据时，强烈推荐使用冷冻组织切片，因其可获得高质量且最大量的RNA²。已有充分证据表明，高质量和高产量的RNA对于获得有意义的RNA测序数据至关重要³。然而，在使用新鲜冷冻的死后组织RNA进行LCM时，RNA降解是一个主要挑战，因为降解在死亡后立即发生，其程度受组织采集方法相关多种因素的影响^4,5。此外，当需要染色技术以识别组织学细节和细胞鉴定时，RNA降解会进一步加剧。特殊的染色技术，如苏木精与伊红（hematoxylin & eosin）、尼氏染色（Nissl stain）、免疫荧光和免疫组织化学，有助于将细胞与周围间质区分开来，但已被证明会降解RNA并改变转录表达谱⁶。因此，本实验室建立了一套严格的方案，专门用于在LCM分离浦肯野神经元后，对死后人小脑组织中的RNA进行保存，以用于RNA测序。

在对新鲜冷冻组织进行激光显....

方案

本方案中使用的所有人类样本均在获得知情同意后获取，并已通过哥伦比亚大学和耶鲁大学的机构审查委员会（IRB）批准。

注意：本实验方案的全部操作均应遵循严格的RNA操作规范，即始终佩戴手套，所有工作表面均需使用RNase去污染剂清洁，所有实验器材和试剂均须无RNA、DNA及核酸酶。

1. 在开始激光显微切割前检测组织 RNA 的完整性

注意： RNA质量检测可通过多种方法进行。应确保检测整个切片来源的RNA，以获得能够代表样本的RNA完整性数值（RIN）。

1. 根据实验设计的参数仔细选择适合的组织样本。若需在冷冻切片机中进行切片，则进入步骤 1.2；若不需要，则相应地处理组织并进入步骤 1.11。
2. 准备两个干冰容器，容器大小取决于样本数量。
   1. 在第一个干冰容器中，放置一个空的、已标记组织编号的 2 mL 离心管。
      注意：离心管需冷冻约 10 分钟才能完全冻结。必须在将组织放入前确保离心管已充分冷冻；否则，组织会因管壁温度过高而融化。
   2. 在第二个干冰容器中，放置需进行 RNA 检测的、来自 -....

结果

本方案详细说明了为紫外激光显微切割（UV-LCM）制备新鲜冷冻的死后人脑组织的步骤。由于精确切割新鲜冷冻脑组织较为困难，本文对冷冻切片机切片过程提供了详尽的说明和注释。最关键的注意事项是，新鲜冷冻组织温度极低，需要较长时间才能适应冷冻切片机内较高的温度。此步骤不可仓促进行，其在本方案成败中的核心作用再怎么强调也不为过。若组织在冷冻切片机中未得到妥善处理，则后续识别特定细胞或感兴趣区域的尝试将极为困难，甚至无法实现。

经过冷冻切片和规定的干燥时间后，组织即可用于激光显微切割（LCM）。在显微镜下观察时，使用5倍和10倍物镜可清晰看到小脑的细胞层。图1展示了仅用乙醇固定的组织（图1A）以及乙醇固定后经二甲苯孵育的组织（图1B

讨论

本文所述方案经过专门优化，旨在为紫外激光显微切割（UV-LCM）提供一种无需染色即可清晰显示形态学差异组织的方法。该方法在增强组织可视化的前提下，最大限度地保持RNA完整性，以适用于后续的直接RNA测序。能够准确区分不同细胞类型并进行捕获，从而获得尽可能均一的细胞群体，这对于解析人体组织中不同的分子特征至关重要¹⁵。在本方案中，组织选择尤为关键，因为未使用任何抗原或染料特异性试剂，因此不适用于需要此类特异性识别的研究。尽管这是本方案的局限性，但其所获得的组织可视化效果和RNA完整性在其他实验设计中仍具有显著优势。目前已有多种其他方案采用不同的染色方法，专门用于紫外或红外激光显微切割（UV-和IR-LCM），以期在染色的同时保护RNA完整性。然而，大多数现有方法至少包含一种染色剂或抗原特异性试剂^6,16,17，或仅针对特定细胞类型或器官类型设计（且非人源尸检组织）¹⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	适用于组织的膜片。我们不推荐使用玻璃载玻片。
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	不透明盖帽仅用于增强倒置显微镜下的可视化效果
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	其他RNase去污染产品也可使用。工作前用于清洁所有表面。
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	若使用其他乙醇，需确保其高纯度。对组织固定至关重要。
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	若使用其他二甲苯，需确保其高纯度。对组织可视化至关重要。
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	其他无RNA/DNA/核酸酶的水也可使用。仅用于乙醇稀释。
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	任何载玻片架或玻片罐均可使用。使用前必须清洁。用于切片后固定。
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	防卷板类型取决于冷冻切片机的型号及其在载物台上的安装位置。不同冷冻切片机要求各异。
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	任何供应商的DEPC均可使用。请按照说明进行水处理。
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes可从任何供应商订购，尺寸不限。用于清洁显微镜和冷冻切片机。
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	任何品牌的OCT均可接受。组织不会包埋于OCT中，仅用于将组织固定在“样品头”上。
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	刀片类型取决于冷冻切片机型号。不同冷冻切片机要求各异。
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	样品头类型取决于冷冻切片机型号。不同冷冻切片机要求各异。任一尺寸均可使用。
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	激光显微切割（LCM）后RNA提取所必需。RLT裂解缓冲液对从不透明盖帽中收集捕获细胞至关重要。
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	用于LCM前组织切片样本的RNA提取，以检测起始组织的RNA完整性。
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	DNase可去除所有DNA，从而获得纯化的RNA群体。确保DNase现配现用。
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	购买体积由用户自行决定。必须加入RLT缓冲液以实现细胞裂解。可抑制RNase活性。
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	任何2 mL、无RNase、无DNase、无人类DNA且无热原的离心管均可使用。