长读长测序技术显著促进了复杂基因组的组装以及结构变异的表征。本文介绍一种基于纳米孔测序平台生成超长读长序列的方法。该方法采用优化的DNA提取流程，结合改进的文库制备步骤，可从人类细胞中获得数百千碱基长度的读长，并达到中等测序深度。
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摘要
摘要
第三代单分子DNA测序技术提供了显著更长的读长，有助于复杂基因组的组装以及复杂结构变异的分析。纳米孔测序平台通过直接检测DNA分子穿过纳米孔时引起的电流变化进行单分子测序，能够以极低的设备投入成本产生长达数百千碱基（kb）的读长。该平台已被众多研究人员广泛应用于多种研究场景。获得更长的测序读长是充分发挥纳米孔测序平台价值的最关键因素。为了生成超长读长，必须特别注意避免DNA断裂，并高效地制备可用于测序的模板。本文提供了超长DNA测序的详细实验方案，包括从新鲜或冷冻细胞中提取高分子量（HMW）DNA、通过机械剪切或转座酶片段化构建文库，以及在纳米孔测序设备上进行测序。使用20–25 µg的高分子量DNA，采用机械剪切方法可实现50–70 kb的N50读长，而采用转座酶介导的片段化方法则可实现90–100 kb的N50读长。该方案适用于从哺乳动物细胞中提取的DNA，可用于全基因组测序，以检测结构变异并进行基因组组装。未来在DNA提取和酶促反应方面的进一步优化将有望进一步提升读长，并拓展其应用范围。
引言
在过去十年中，大规模并行且高度精确的第二代高通量测序技术推动了生物医学发现和技术革新的迅猛发展1,2,3。尽管技术不断进步，第二代测序平台产生的短读长数据在解析复杂基因组区域方面效果有限，并且在检测基因组结构变异（SVs）方面存在局限性，而这些结构变异在人类进化和疾病中具有重要作用4,5。此外，短读长数据无法有效解析重复序列变异，也不适用于识别遗传变异的单倍型定相6。
单分子测序技术的最新进展显著延长了读长，有助于全面检测结构变异（SVs）7,8,9，并实现对复杂微生物和哺乳动物基因组的准确、完整组装6,10。纳米孔测序平台通过直接测量DNA分子穿过纳米孔时引起的电流变化来进行单分子测序11,12,13。与现有的任何DNA测序化学方法不同，纳米孔测序能够实时产生长读长（数十至数千千碱基），且无需依赖DNA聚合酶动力学或对DNA样本进行人工扩增。因此，纳米孔长读长测序（NLR-seq）在生成远超100 kb的超长读长方面具有巨大潜力，将极大推动基因组学和生物医学分析的发展14，尤其是在基因组的低复杂度或重复序列富集区域15。
纳米孔测序的独特之处在于其能够产生理论上无长度限制的长读长序列。因此，读长取决于DNA的物理长度，而后者直接受DNA完整性和测序模板质量的影响。此外，根据操作程度和涉及步骤的数量（例如移液力和提取条件），DNA的质量具有高度变异性。因此，仅采用标准DNA提取方案和制造商提供的文库构建方法，很难获得长读长序列。为解决这一问题，我们开发了一种稳健的方法，可从收获的细胞沉淀开始生成超长读长（数百千碱基）的测序数据。我们在DNA提取和文库制备流程中引入了多项改进措施，并优化了实验流程，去除了可能导致DNA降解和损伤的非必要步骤。本方案包括高分子量（HMW）DNA提取、超长DNA文库构建以及在纳米孔测序平台上进行测序。对于训练有素的分子生物学家而言，从细胞收获到完成HMW DNA提取通常需要6小时；文库构建根据剪切方法的不同，耗时90分钟或8小时；DNA测序最多还需48小时。该方案的应用将有助于基因组学研究领域加深对基因组复杂性的理解，并为人类疾病中的基因组变异提供新的见解。
方案
注意：NLR-seq 协议包括三个连续步骤：1）提取高分子量（HMW）基因组 DNA；2）超长 DNA 文库构建，包括将 HMW DNA 断裂为所需大小片段，并在 DNA 末端连接测序接头；3）将连接了接头的 DNA 加载到纳米孔阵列上（图 1）。
1. 高分子量DNA提取
- 试剂配制。通过将100 mL PBS（10x）加入900 mL水中，配制1x磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液（1,000 mL），充分混匀。在50 mL离心管中加入43.5 mL水，再加入500 μL Tris（1 M，pH 8.0）、1 mL氯化钠（NaCl）（5 M）、2.5 mL乙二胺四乙酸（EDTA）（0.5 M，pH 8.0）和2.5 mL十二烷基硫酸钠（SDS）（10%，wt/vol），混匀，配制裂解缓冲液（50 mL）。
注意：该PBS缓冲液可在4 °C保存最多6个月。预制的裂解缓冲液可在室温（RT）保存最多2个月。 - 检测细胞死亡率并计数细胞。确保活细胞比例> 85%，总细胞数为30 × 106。
注意：本方案所用细胞来自HG00733细胞系，这是一种源自波多黎各的人类淋巴母细胞系，广泛用于1000基因组计划联盟的结构变异分析（订购信息见材料表），属于国际基因组样本资源（International Genome Sample Resource）。 - 在室温下以200 × g离心5分钟收集细胞。弃去上清液，用5 mL 1x PBS缓冲液重悬细胞沉淀（30 × 106个细胞）。再次在室温下以200 × g离心5分钟，弃去上清液。
注意：25–35 × 106个细胞适用于本方法。若使用细胞数量有较大变化，需进一步优化。细胞沉淀可在−80 °C保存最多6个月。 - 用200 μL 1x PBS缓冲液重悬细胞沉淀。若使用冻存的细胞沉淀，先用5 mL 1x PBS缓冲液洗涤。在室温下以200 × g离心5分钟，弃去上清液，再用200 μL 1x PBS缓冲液重悬细胞。
- 在50 mL离心管中配制10 mL裂解缓冲液。将200 μL细胞悬液加入裂解缓冲液中，涡旋振荡器最高转速振荡3秒。在37 °C孵育1小时。
- 向裂解液中加入2 μL RNase A（100 mg/mL）。轻轻旋转50 mL离心管以混匀样品。在37 °C孵育1小时。
- 向裂解液中加入50 μL蛋白酶K（20 mg/mL）。轻轻旋转50 mL离心管以混匀样品。在50 °C孵育2小时。孵育期间，每30分钟轻轻混匀一次。
- 将50 mL离心管从50 °C取出，在室温下静置5分钟。
- 向裂解液中加入10 mL酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，vol/vol/vol）中的酚层，将离心管置于旋转混合仪（见材料表）上，在通风橱中室温、20 rpm条件下旋转10分钟。用Parafilm封住管盖，防止旋转过程中泄漏。
- 准备两个50 mL凝胶离心管（见材料表），在室温下以1,500 × g离心2分钟。
注意：凝胶在含有核酸的水相与有机溶剂之间形成稳定屏障。 - 将样品/酚溶液倒入步骤1.10中准备好的一个50 mL凝胶离心管中。在室温下以3,000 × g离心10分钟。
- 将上清液倒入一个新的50 mL离心管中。加入10 mL酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，vol/vol/vol）中的酚层，在通风橱中室温、20 rpm条件下用旋转混合仪旋转10分钟。
- 使用第二个准备好的凝胶离心管，重复步骤1.11一次。
- 将上清液倒入一个新的50 mL离心管中。加入25 mL预冷的100%乙醇，手动轻轻旋转离心管，直至DNA析出（图2）。
注意：该沉淀方法有助于稳定高分子量（HMW）DNA。 - 将20 μL枪头弯成钩状。用钩小心取出HMW DNA，并让液体滴落。
- 将HMW DNA放入含有40 mL 70%乙醇的50 mL离心管中。通过轻轻倒置离心管3次，洗涤DNA。
- 重复步骤1.15一次，从70%乙醇管中回收DNA。
- 将HMW DNA放入含有1.8 mL 70%乙醇的2 mL离心管中。
- 将洗涤后的HMW DNA在室温下以10,000 × g离心3秒。用移液器尽可能吸除残留乙醇。
注意：吸除残留乙醇时切勿扰动DNA沉淀。 - 将2 mL离心管开盖置于37 °C孵育10分钟，以干燥样品。
- 若继续进行步骤2.1（机械剪切结合1D连接测序试剂盒），向2 mL离心管中加入1 mL TE缓冲液（10 mM Tris和1 mM EDTA，pH 8.0）。
- 若继续进行步骤2.2（基于转座酶的片段化结合快速测序试剂盒），加入200 μL含0.02% Triton X-100的10 mM Tris（pH 8.0）。
注意：切勿扰动DNA沉淀。将离心管在避光条件下4 °C静置48小时，有助于样品充分重悬。HMW DNA可在4 °C保存最多2周。更长的保存时间或其他保存条件可能引入更多短片段。
2. 超长DNA文库构建
注意：基于两种不同的剪切方法与纳米孔测序试剂盒的组合，构建超长DNA文库有两种方式。基于机械剪切的文库可产生N50为50–70 kb的数据，文库构建耗时约8小时。基于转座酶片段化的文库可产生N50为90–100 kb的数据，文库构建仅需90分钟。在使用相同版本的测序接头和相同质量的纳米孔流动池条件下，机械剪切法在相同DNA投入量下可获得更高的产量。
- 基于机械剪切的文库构建
- 解冻并混匀连接试剂盒中的试剂（参见材料表）。将FFPE DNA修复缓冲液和末端修复/dA加尾缓冲液在冰上解冻，然后涡旋振荡并短暂离心混匀。将接头混合液（AMX）和接头结合磁珠缓冲液（ABB）在冰上解冻，然后用移液器吹打并短暂离心混匀。将含燃料的运行缓冲液（RBF）和洗脱缓冲液（ELB）在室温下解冻，然后涡旋振荡并短暂离心混匀。将文库加载磁珠（LLB）在室温下解冻，使用前用移液器吹打混匀。
- 解冻后，所有试剂盒组分均需保持在冰上。仅在需要时取出酶类。将磁珠恢复至室温后使用。
注意：有关推荐使用的磁珠，请参见材料表。
- 解冻后，所有试剂盒组分均需保持在冰上。仅在需要时取出酶类。将磁珠恢复至室温后使用。
- 检测步骤1.21.1中获得的高分子量DNA（HMW DNA）的质量和浓度。使用P200宽口吸头从HMW DNA管内的三个不同位置分别吸取20 μL DNA至新的1.5 mL离心管中。从这三个等分试样中各取1 μL，使用荧光计检测浓度，并通过紫外吸收检测质量。重复多次检测以确认结果。
注意：预期结果如图3A所示。OD260/280值约为1.9，OD260/230值约为2.3。 - 使用P1000宽口吸头将剩余的940 μL HMW DNA转移至一个50 mL管盖中。
- 用无针头的1 mL注射器吸取全部DNA。
- 将27 G针头安装到注射器上，缓慢轻柔地（约10秒）将所有DNA推入管盖中。取下注射器上的27 G针头。
- 重复步骤2.1.4和2.1.5共29次，使DNA总共经过针头30次。
注意：剪切后的HMW DNA可在避光条件下于4 °C保存最多24小时。建议通过脉冲场凝胶电泳进行质量控制（QC），但该方法成本较高且耗时。若使用自动化脉冲场凝胶电泳仪进行QC，应采用5–150 kb的程序运行20小时。预期结果如图4所示。 - 在0.2 mL离心管中配制DNA修复反应体系：加入100 μL剪切后的HMW DNA（20 μg）、15 μL FFPE DNA修复缓冲液、12 μL FFPE DNA修复混合液和16 μL无核酸酶水。轻轻弹击管壁6次混匀反应液，并短暂离心去除气泡。
- 在20 °C孵育反应60分钟。使用P200宽口吸头将样品转移至新的1.5 mL离心管中。
- 通过移液或涡旋重悬磁珠。向DNA修复反应体系中加入143 μL磁珠（1×），轻轻弹击管壁6次混匀。将离心管置于旋转混合仪上，在室温下以20 rpm转速旋转30分钟。
- 在室温下以1,000 × g离心2秒。将离心管置于磁力架上静置10分钟。保持离心管在磁力架上，弃去上清液。
- 保持离心管在磁力架上，加入400 μL新鲜配制的70%乙醇，避免扰动沉淀。30秒后去除70%乙醇。
- 重复步骤2.1.11一次。
- 在室温下以1,000 × g离心2秒。将离心管重新放回磁力架。去除残留乙醇，室温下晾干30秒。切勿过度干燥沉淀。
- 将离心管从磁力架上取下，加入103 μL TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）。轻轻弹击管壁，确保磁珠完全浸没于缓冲液中，并在室温下置于旋转混合仪上孵育30分钟。每5分钟轻轻弹击一次管壁，以促进沉淀重悬。
- 将磁珠在磁力架上静置至少10分钟。使用P200宽口吸头将100 μL洗脱液转移至0.2 mL离心管中。
- 在0.2 mL离心管中配制末端修复和dA加尾反应体系：加入100 μL修复后的HMW DNA、14 μL末端修复/dA加尾缓冲液和7 μL末端修复/dA加尾混合液。轻轻弹击管壁6次混匀反应液，并短暂离心去除气泡。
- 在20 °C孵育60分钟，随后在65 °C孵育20分钟，最后维持在22 °C。使用P200宽口吸头将样品转移至新的1.5 mL离心管中。
- 通过移液或涡旋重悬磁珠。向末端修复/dA加尾反应体系中加入48 μL磁珠（0.4×），轻轻弹击管壁6次混匀。将离心管置于旋转混合仪上，在室温下以20 rpm转速旋转30分钟。
- 重复步骤2.1.10–2.1.13一次。
- 将离心管从磁力架上取下，加入33 μL TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）。轻轻弹击管壁，确保磁珠完全浸没于缓冲液中，并在室温下置于旋转混合仪上孵育30分钟。每5分钟轻轻弹击一次管壁，以促进沉淀重悬。
- 将磁珠在磁力架上静置至少10分钟。使用P200宽口吸头将30 μL洗脱液转移至新的1.5 mL离心管中。额外取出1–2 μL用于荧光计检测浓度。
注意：此步骤预期回收量为5–6 μg。 - 在1.5 mL样品管中配制连接反应体系：加入30 μL末端修复后的HMW DNA、20 μL接头混合液（AMX 1D）和50 μL平末端/TA连接主混合液。每次依次加入后均轻轻弹击管壁6次混匀，并短暂离心去除气泡。
- 在室温下孵育反应60分钟。
- 通过移液或涡旋重悬磁珠。向连接反应体系中加入40 μL磁珠（0.4×），轻轻弹击管壁6次混匀。将离心管置于旋转混合仪上，在室温下以20 rpm转速旋转30分钟。
- 重复步骤2.1.10一次。
- 向离心管中加入400 μL接头结合磁珠缓冲液（ABB）。轻轻弹击管壁6次以重悬磁珠。将离心管放回磁力架，使磁珠与缓冲液分离，弃去上清液。
- 重复步骤2.1.26一次。
- 在室温下以1,000 × g离心2秒。将离心管重新放回磁力架。去除残留缓冲液，室温下晾干30秒。切勿过度干燥沉淀。
- 将离心管从磁力架上取下，将沉淀重悬于43 μL洗脱缓冲液中。轻轻弹击管壁，确保磁珠完全浸没于缓冲液中，并在室温下置于旋转混合仪上孵育30分钟。每5分钟轻轻弹击一次管壁，以促进沉淀重悬。
- 将磁珠在磁力架上静置至少10分钟。使用P200宽口吸头将40 μL洗脱液转移至新的1.5 mL离心管中。额外取出1–2 μL用于荧光计检测浓度。
注意：此步骤预期回收量为1–2 μg。基于机械剪切的文库已准备就绪，可进行上机加载。如需延迟测序，文库可在冰上保存最多2小时。
- 解冻并混匀连接试剂盒中的试剂（参见材料表）。将FFPE DNA修复缓冲液和末端修复/dA加尾缓冲液在冰上解冻，然后涡旋振荡并短暂离心混匀。将接头混合液（AMX）和接头结合磁珠缓冲液（ABB）在冰上解冻，然后用移液器吹打并短暂离心混匀。将含燃料的运行缓冲液（RBF）和洗脱缓冲液（ELB）在室温下解冻，然后涡旋振荡并短暂离心混匀。将文库加载磁珠（LLB）在室温下解冻，使用前用移液器吹打混匀。
- 基于转座酶片段化的文库构建
- 解冻转座酶试剂盒中的试剂（参见材料表）。将片段化混合液（FRA）和快速接头（RAP）在冰上解冻，并用移液器吹打混匀。将测序缓冲液（SQB）、加载磁珠（LB）、冲洗缓冲液（FLB）和冲洗连接物（FLT）在室温下解冻，并用移液器吹打混匀。将加载磁珠（LB）在室温下解冻，使用前用移液器吹打混匀。解冻后，所有试剂盒组分均需保持在冰上。仅在需要时取出酶类。
- 检测步骤1.21.2中获得的HMW DNA的质量和浓度。使用P200宽口吸头从HMW DNA管内的三个不同位置分别吸取20 μL DNA至新的1.5 mL离心管中。从这三个等分试样中各取1 μL，使用荧光计检测浓度，并通过紫外吸收检测质量。重复多次检测以确认结果。
注意：预期结果如图3B所示。OD260/280值约为1.9，OD260/230值约为2.3。 - 在0.2 mL离心管中配制DNA标签化反应体系：加入22 μL HMW DNA、1 μL含0.02% Triton X-100的10 mM Tris（pH 8.0）和1 μL片段化混合液（FRA）。使用P200宽口吸头尽可能缓慢地吹打6次混匀，注意避免产生气泡。
- 在30 °C孵育1分钟，随后在80 °C孵育1分钟，最后维持在4 °C。立即使用P200宽口吸头将混合液转移至新的1.5 mL离心管中，进入下一步操作。
- 向1.5 mL样品管中加入1 μL快速接头（RAP）。使用P200宽口吸头尽可能缓慢地吹打6次混匀，注意避免产生气泡。
- 在室温下孵育反应60分钟。
注意：基于转座酶片段化的文库已准备就绪，可进行上机加载。如需延迟测序，文库可在冰上保存最多2小时。
3. 在纳米孔设备上进行测序
- 检查纳米孔测序设备（参见 材料表）。确保软件和硬件均正常工作，并且有足够的存储空间。
- 检查流动池。打开一个新的流动池，并将其插入纳米孔测序设备中。勾选所插入流动池的位置编号（X1-X5），选择正确的流动池类型。点击 检查流动池 工作流程，然后点击 开始测试 按钮以启动流动池质量控制分析。
注意：如果报告的总活性纳米孔数量少于 800 个，则应更换另一个新的流动池用于测序。 - 准备启动缓冲液。对于基于机械剪切的文库，向一个 1.5 mL 离心管中加入 576 μL 含燃料混合液的运行缓冲液（RBF）和 624 μL 无核酸酶水。涡旋混匀后短暂离心。对于基于转座酶片段化的文库，向冲洗缓冲液（FLB）管中加入 30 μL 冲洗连接液（FLT），涡旋混匀后短暂离心以制备启动缓冲液。
- 在流动池上，顺时针旋转启动口盖以暴露启动口。
- 将 P1000 移液器调至 100 μL，将吸头插入启动口，回抽少量缓冲液（少于 30 μL）以去除流动池中的气泡。当有少量黄色液体进入吸头时停止移液。
- 使用 P1000 移液器通过启动口向流动池中加入 800 μL 启动混合液。为避免引入气泡，先加入 30 μL 启动混合液覆盖启动口顶部，然后将吸头插入启动口中缓慢加入剩余液体。当剩余约 50 μL 时取出吸头，将剩余的启动混合液加在启动口顶部，液体将自动流入内部。
- 让装置静置孵育 5 分钟。在此期间，在含有文库的 1.5 mL 离心管中准备文库混合液。
注意：对于基于机械剪切的文库，向 40 μL DNA 文库中加入 35 µL 含燃料混合液的运行缓冲液（RBF）；对于基于转座酶片段化的文库，向 25 μL DNA 文库中加入 34 µL 测序缓冲液（SQB）和 16 µL 无核酸酶水。 - 轻轻打开流动池的样品口盖以暴露样品口。使用 P1000 移液器，按照步骤 3.5 所述方法，通过启动口向流动池中加入 200 μL 启动混合液。确保启动混合液未通过样品口加载到流动池中。
- 将 P200 移液器调至 80 μL。在加载前，使用宽口吸头轻柔吹打文库混合液上下混合 6 次。
- 通过样品口将文库混合液逐滴加入流动池中。每次添加新液滴前，需确保前一液滴已完全进入口内。
- 轻轻盖回样品口盖，确保样品口完全封闭。逆时针旋转启动口盖以覆盖启动口，关闭设备盖。
- 点击 新建实验 工作流程。输入文库名称，根据所用方法选择正确的试剂盒，并确认设置正确（运行时间 48 小时，实时碱基识别开启）。
- 点击 开始运行。10 分钟后，从运行信息中记录流动池 ID 及活性纳米孔数量（总数及每组四个组别的数量）。
- 数据分析。可在测序过程中或运行结束后随时将数据复制到本地计算机或计算集群。使用 Minimap216（https://github.com/lh3/minimap2）将测序数据比对至参考基因组。利用 NanoPlot17（https://github.com/wdecoster/NanoPlot）对原始测序数据及其比对结果进行测序性能汇总分析。
结果
超长DNA测序方案采用高分子量DNA进行文库构建。因此，选择活细胞比例较高的培养良好的细胞至关重要 >在细胞收获步骤中，细胞存活率应达到85%。用于DNA提取的细胞数量将影响高分子量（HMW）DNA的质量和得率。起始细胞过多会导致细胞裂解效果不佳；而细胞量过少则无法获得足够的DNA用于文库构建，因为HMW DNA沉淀过程采用手动轻柔旋转而非高速离心。加入预冷的100%乙醇并旋转后，可见白色棉絮状沉淀，即为HMW DNA的示例。 图2.
在开始文库构建之前，必须对输入DNA的质量进行检测。DNA降解、定量不准确、污染（如蛋白质、RNA、去污剂、表面活性剂以及残留的苯酚或乙醇）以及低分子量DNA均可能对后续实验步骤和最终读长产生显著影响。我们建议使用含有高分子量（HMW）DNA的离心管中三个不同位置的DNA样本进行质量控制分析。根据HMW DNA的紫外吸收检测结果，OD260/OD280值约为1.9，OD260/OD230值约为2.3（图3A、B）。对于质量良好的HMW DNA样本，这三个检测位点的比值应保持一致。不同的片段化方法需要不同体积的输入DNA。机械剪切要求HMW DNA浓度 >200 ng/µL，而转座酶片段化则要求浓度 >1 µg/µL。荧光计检测所得浓度通常略低于紫外吸收法检测值。然而，同一样本的HMW DNA浓度在荧光计和紫外吸收法检测中的变异系数均应小于15%。机械剪切通过带针头的注射器对HMW DNA进行物理断裂，针头推注次数将影响剪切后DNA片段的大小及最终读长。建议在针头剪切后进行片段大小质控，以确保大部分HMW DNA片段大于50 kb，如图4所示。在机械剪切方法中，经过30次推注可获得兼顾读长和产出的最佳测序结果。
基于机械剪切的文库N50为50–70 kb，而基于转座酶片段化的文库N50为90–100 kb。使用HG00733细胞系进行的四次测序运行结果如表1所示。四次运行中每次均获得超过2,300条长度大于100 kb的读长。基于转座酶片段化的文库最大读长更长（分别为455 kb和489 kb），而基于机械剪切的文库最大读长为348 kb和387 kb；但后者产生的总读数更多，表明产量更高。基于转座酶的文库构建步骤更少，制备时间更短，因此引入的短片段更少。两次使用转座酶的测序运行具有更长的平均长度（>30 kb）和中位长度（>10 kb）。此外，所有运行的数据均表现出一致的高质量（平均质量值约为10.0，碱基准确率约90%）。使用Minimap216在默认参数下，超过97%的总碱基比对至人类参考基因组（hg19）。原始读长的预期大小分布如图5所示。所有运行中均有较大部分的数据长度超过50 kb，而基于转座酶片段化的文库具有更高比例的超长读长（例如 > 100 kb）。本方案已成功应用于多种人类细胞系（补充表1）。
图1：纳米孔长读长测序（NLR-seq）工作流程的示意图。 橙色代表转座酶复合物，黄绿色代表纳米孔接头。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：苯酚-氯仿提取法中DNA沉淀的典型结果。 白色箭头指示高分子量DNA（HMW DNA）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：基于紫外读数的高分子量DNA样品质量控制结果示例。（A）来自步骤1.21.1的高分子量DNA，适用于基于机械剪切的文库构建。（B）来自步骤1.21.2的高分子量DNA，适用于基于转座酶片段化的文库构建。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：针头剪切法提取的高分子量DNA通过脉冲场凝胶电泳进行的质量控制结果。 L1：Quick-load 1 kb DNA ladder；L2：Quick-load 1 kb extend DNA ladder。1-8：经过不同针头剪切次数的DNA样本。1-3：未剪切；4：10次；5：20次；6：30次；7：40次；8：50次。此质量控制步骤为可选步骤。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：纳米孔超长DNA文库的预期片段大小分布。 MS，基于机械剪切的文库；TF，基于转座酶片段化的文库。请点击此处查看该图的放大版本。
| 机械剪切_rep1 | 机械剪切_rep2 | 转座酶片段化_rep1 | 转座酶片段化_rep2 | |
| 细胞系 | HG00733 | HG00733 | HG00733 | HG00733 |
| 读段的 N50 | 55,180 | 63,007 | 98,237 | 95,629 |
| 长度超过 100 Kb 的读段数量 | 2,500 | 3,082 | 2,386 | 2,355 |
| 总读段数量 | 97,859 | 80,465 | 24,166 | 21,032 |
| 最大长度 (bp) | 348,482 | 387,113 | 454,660 | 489,426 |
| 平均长度 (bp) | 17,861 | 20,395 | 33,528 | 38,175 |
| 中位长度 (bp) | 5,335 | 5,894 | 10,249 | 15,656 |
| 读段的平均质量 | 10.0 | 10.1 | 9.9 | 10.0 |
| 原始读段的总碱基数 | 1,747,849,822 | 1,641,058,932 | 810,229,733 | 802,886,304 |
| 比对读段的总碱基数 | 1,693,300,832 | 1,607,975,925 | 791,422,077 | 778,417,627 |
| 总碱基的比对率 (hg19, Minimap2) | 96.9% | 98.0% | 97.7% | 97.0% |
| 活跃孔数量 | 1225: 480, 402, 254, 89 | 1058: 480, 356, 176, 46 | 958: 452, 328, 148, 30 | 1092: 487, 367, 195, 43 |
表1：不同剪切方案运行结果的性能指标汇总。
| 文库 1 | 文库 2 | |
| 细胞系 | K562 | GM19240 |
| 细胞订购信息 | ATCC, 目录号 CCL-243 | Coriell Institute, 目录号 GM19240 |
| 实验方案 | 机械剪切 | 机械剪切 |
| reads 的 N50 | 60,063 | 55,295 |
| 总 reads 数量 | 193,783 | 120,807 |
| 中位长度（bp） | 1,843 | 4,688 |
| 平均长度（bp） | 9,825 | 17,408 |
| 最大长度（bp） | 548,780 | 212,338 |
| 原始 reads 的总碱基数 | 1,903,989,686 | 2,103,015,331 |
| 比对后 reads 的总碱基数 | 1,837,350,047 | 1,997,419,761 |
| 总碱基比对率（hg19, Minimap2） | 96.6% | 95.0% |
| 活跃孔数量 | 1111: 482, 371, 203, 55 | 1032: 447, 333, 196, 56 |
补充表1：使用其他细胞系及机械剪切法进行两次NLR测序运行的汇总。
讨论
理论上，纳米孔测序能够产生长度为100 kb至兆碱基的读长11,12,13。影响测序运行性能和数据质量的主要因素有四个：1）活性纳米孔的数量及孔的活性；2）控制DNA通过纳米孔速度的马达蛋白；3）DNA模板（长度、纯度、质量和用量）；4）测序接头连接效率，该因素决定了输入样本中可用于测序的DNA比例。前两个因素取决于制造商提供的流动池版本和测序试剂盒。后两个因素则是本实验方案中的关键步骤（高分子量DNA提取、片段化和连接）。
本方案需要耐心和练习。高质量的高分子量DNA（HMW DNA）对于超长DNA文库的构建至关重要6。本方案起始于高活力细胞的收集（建议活细胞比例超过>85%），以减少死细胞带来的DNA降解。任何可能对DNA造成损伤的剧烈操作（例如剧烈搅动、震荡、涡旋、多次移液、反复冻融）均应避免。在本方案设计中，DNA提取全过程均避免使用移液操作。仅在文库构建和测序过程中经机械剪切后确需移液时，应使用宽口吸头。由于纳米孔对测序室缓冲液中的化学成分敏感12，DNA样品中应尽可能减少残留污染物（如去垢剂、表面活性剂、苯酚、乙醇、蛋白质、RNA等）。综合考虑DNA长度和得率，与迄今测试的多种不同提取方法相比，苯酚抽提法表现出最佳且最可重复的结果。
尽管本方案能够产生长读长序列，但仍存在若干局限性。首先，本方案的优化是基于发表时可用的纳米孔测序设备进行的；因此，其仅适用于特定的基于纳米孔的测序化学体系，在其他类型的长读长测序设备上使用时可能并非最优。其次，结果高度依赖于从起始材料（组织或细胞）中提取的DNA质量。如果起始DNA已经降解或受损，则读长将受到影响。第三，尽管方案中已包含多个质控步骤以评估DNA质量，但最终的测序产量和读长仍可能受到流动池及纳米孔活性的影响，而在纳米孔测序平台发展的现阶段，这些因素仍可能存在变异性。
本方案使用人悬浮细胞系样本进行DNA提取。我们已优化了针头剪切的过针次数、高分子量DNA与转座酶的比例以及连接反应时间，以获得所述结果。该方案可在四个方面进行扩展。第一，使用者可起始使用其他培养的哺乳动物细胞、不同数量的细胞、组织、临床样本或其他生物体。此时需进一步优化裂解孵育时间、反应体积和离心条件。第二，超长读长测序的目标片段大小较难预测。若读长较预期短，使用者可调整基于机械剪切法的过针次数，或改变基于转座酶片段化法中高分子量DNA与转座酶的比例。在纯化步骤中延长结合与洗脱时间有助于提高得率，因为高分子量DNA黏度较高。第三，针对不同的纳米孔测序设备，可调整DNA的上样量和体积，以满足测序仪的要求。第四，只有连接了测序接头的DNA才会被测序。为进一步提高连接效率，可尝试滴定接头和连接酶的浓度。未来还可采用调整连接时间或添加分子拥挤剂（如PEG18）等方法。超长DNA测序方案结合CRISPR19,20技术，可能为靶向富集测序提供一种有效的工具。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Y. Zhu 对手稿提出的建议。本出版物所报道的研究工作部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助，资助编号为 P30CA034196。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 无水乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman | A63881 | 用于纯化的磁珠 |
| BD常规针头 | Becton Dickinson | 305136 | 27G，用于机械剪切 |
| BD鲁尔锁注射器 | Becton Dickinson | 309628 | 用于机械剪切 |
| Blunt/TA连接酶主混合液 | NEB | M0367S | |
| Countess细胞计数板载玻片 | Invitrogen | C10228 | 用于细胞计数 |
| EDTA | Invitrogen | AM9261 | pH 8.0，0.5 M，500 mL |
| 流动池 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106 | R9.4.1 |
| HG00773细胞 | Coriell Institute | HG00733 | 本方案中使用的细胞 |
| 1D连接测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK108 | 纳米孔连接试剂盒 |
| MaXtract高密度管 | Qiagen | 129073 | 凝胶管 |
| NEBNext FFPE DNA修复混合液 | NEB | M6630S | |
| NEBNext Ultra II末端修复/dA加尾模块 | NEB | M7546S | |
| 无核酸酶水 | Invitrogen | AM9937 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 70011044 | 10X，pH 7.4 |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 | Invitrogen | AM9730 | |
| 蛋白酶K | Qiagen | 19131 | 20 mg/mL |
| Qubit dsDNA BR检测试剂盒 | Invitrogen | Q32850 | 用于DNA定量的荧光检测 |
| 快速测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-RAD004 | 纳米孔转座酶试剂盒 |
| RNase A | Qiagen | 19101 | 100 mg/mL |
| SDS | Invitrogen | AM9822 | 10%（wt/vol） |
| 氯化钠溶液 | Invitrogen | AM9759 | 5.0 M |
| TE缓冲液 | Invitrogen | AM9849 | pH 8.0 |
| Tris | Invitrogen | AM9856 | pH 8.0，1 M |
| Triton X-100溶液 | Sigma-Aldrich | 93443 | 约10% |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 设备 | |||
| Bio-Rad C1000热循环仪 | Bio-Rad | 1851196EDU | |
| Centrifuge 5810R离心机 | Eppendorf | 22628180 | |
| Countess II FL全自动细胞计数仪 | Life Technologies | AMQAF1000 | 用于细胞计数 |
| DynaMag-2磁力架 | Life Technologies | 12321D | 磁力架 |
| Eppendorf ThermoMixer恒温混匀仪 | Eppendorf | 5382000023 | 用于孵育 |
| 冷冻柜 | LabRepCo | LHP-5-UFMB | |
| GridION | Oxford Nanopore Technologies | GridION X5 | 本方案中使用的纳米孔测序设备 |
| HulaMixer样品混合器 | Thermo Fisher Scientific | 15920D | 旋转混合器 |
| 微量离心机 | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NanoDrop ND-1000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | 用于紫外吸收检测 |
| Pippin Pulse | Sage Science | PPI0200 | 脉冲场凝胶电泳仪 |
| Qubit 3.0荧光计 | Invitrogen | Q33216 | 荧光计 |
| 冰箱 | LabRepCo | LABHP-5-URBSS | |
| Vortex-Genie 2涡旋振荡器 | Scientific Industries | SI-A236 | |
| 水浴锅 | VWR | 89501-464 |
参考文献
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