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方法文章

用于小鼠运动技能、情绪和认知能力重复评估的行为测试组合

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⸱

DOI：

10.3791/58973

⸱

2019年3月2日

 ,  , 
1Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Children's Hospital of Nanjing Medical University, 2Nanjing Key Laboratory of Pediatrics, Nanjing Medical University, 3Laboratory of Neurodegenerative Disease, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong Special Administrative Region (HK SAR)

本文内容

摘要

本研究设计了一套全面的行为测试组合，用于对小鼠与神经退行性变相关的行为变化进行重复评估，包括运动技能、情绪（如社交互动、抑郁和焦虑）以及认知功能。

摘要

神经退行性疾病的药理学和毒理学研究需要对小鼠进行综合的行为学分析，因为运动功能障碍以及情绪和认知功能障碍是神经退行性疾病中常见且常共有的症状。本文展示了一套针对运动、情绪和认知功能的行为学测试组合，可用于纵向研究中的重复检测。该测试组合通过在每个行为领域至少采用两种独立且广泛认可的测试方法，评估小鼠的整体行为表型（即：用于运动功能的开放场实验和转棒实验，用于情绪功能的社会互动实验、高架十字迷宫实验和强迫游泳实验，以及用于认知功能的莫里斯水迷宫实验和新物体识别实验）。因此，这一灵敏而全面的行为学测试组合是研究神经退行性疾病中行为改变的有力工具。

引言

神经退行性疾病具有严重的临床行为症状，包括认知功能障碍、焦虑和抑郁等情绪障碍，或运动功能障碍1。多种神经退行性疾病的发病机制尚不明确2。累积研究表明，遗传和环境因素可能均参与了神经退行性疾病的发病过程。确定神经退行的风险因素需要进行行为学分析。尽管每种神经退行性疾病都有其特征性的行为症状（例如， 阿尔茨海默病 [AD] 以认知功能障碍为特征，帕金森病 [PD] 以运动功能障碍为特征），但随着疾病进展，患者会表现出多种行为异常的共病现象3。例如，AD 患者在疾病晚期会出现情绪障碍症状4,5；PD 患者可能发展为帕金森病相关性痴呆，并出现认知功能障碍6。基于这些特点，神经退行疾病模型中的行为学分析通常需要全面且重复进行。

为实现这一目标，设计了一套包含经典且广泛应用的行为学测试的组合方案，用于运动、情绪和认知功能的行为分析。运动功能可通过旷场实验7,8和加速转棒实验进行检测。情绪功能障碍，包括社交障碍、抑郁和焦虑，在神经退行性疾病中最为常见5。因此，该测试组合中包含了用于评估社交能力的社会交互实验9、用于评估焦虑的高架十字迷宫实验10以及用于评估抑郁的强迫游泳实验11。认知功能障碍是阿尔茨海默病（AD）和额颞叶变性等神经退行性疾病的最典型症状之一12。短时记忆和情景记忆等认知领域易受神经退行性变的影响13,14,15。因此，该组合中纳入了用于检测空间学习与记忆的莫里斯水迷宫实验16和用于检测短时记忆的新物体识别实验17。这些测试彼此兼容。测试顺序经过设计，以最大程度地促进动物适应环境并减少相互干扰，从而进一步提高组合内测试的兼容性。由于每种功能均通过至少两种在原理和方法上相互独立的测试进行评估，因此各测试结果可相互验证。此外，部分测试的方案特别适用于重复测量，有利于对神经退行性疾病的发展过程进行纵向研究。因此，该行为学测试组合可在使用最少数量动物的前提下，系统研究神经退行性变不同阶段所出现的行为改变的各个亚领域。该测试组合已应用于一项纵向研究，评估了成年早期（3月龄）雄性C57BL/6N小鼠在呼吸道暴露于二氧化硅纳米颗粒后的行为变化，后者是一种职业性危害因素，可能增加神经退行性疾病的风险18。然而，其他品系或模型（如老年小鼠或基因修饰小鼠）的行为表现可能与年轻的C57BL/6N小鼠不同。因此，在将该测试组合应用于这些小鼠时需谨慎。

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方案

本文所述所有方法均已获得香港大学教学与科研活体动物使用委员会（CULATR）的批准。

1. 通用实验方案

注意： 本节内容基于 Deacon19。

  1. 行为学实验房间设置
    1. 在行为学实验房间内（面积应约为10 m2，具备可调节照明，最好设有缓冲间），清除所有无关的刺激或干扰因素，包括实验装置上的直射强光、气味、噪音以及其他无关动物。
      注意：由于小鼠为夜行性动物，在开放场实验、新物体识别实验和社会交互实验中，将光照强度控制在15 lux以下，可最大限度减少光线带来的干扰或应激，有助于小鼠专注于实验任务。
    2. 将用于视频记录的摄像机安装在距地面至少1.5 m的高度，确保其处于测试小鼠的视线之外。
  2. 饲养与适应
    1. 在动物饲养单元中群体饲养小鼠并进行观察（例如，每笼最多饲养四只成年小鼠）。
      注意：本实验使用3月龄雄性C57BL/6N小鼠，饲养于1144B型笼具中。排除患病、受伤或严重应激的小鼠。饥饿、口渴或遭受欺凌的经历可能影响小鼠的行为表现。
    2. 由同一名实验操作人员完成所有行为学测试，以减少个体差异。运输、操作及实验均应在光照周期内（上午7:00至晚上7:00）进行。如有可能，将其他操作（如给药/毒素处理（例如经鼻滴注二氧化硅纳米颗粒）或换笼）安排在测试之后进行。
    3. 在每次实验前，用随机编号重新标记笼具，以实现实验人员的盲法操作。将小鼠连同其家笼在行为学实验室内适应环境15至30分钟，并在整个实验过程中保持家笼置于实验室内。
    4. 实验开始前，先将一只非测试用的C57BL/6N小鼠放入实验装置中，以确保第一只测试小鼠所处的实验条件与其他小鼠一致。随后按以下步骤清洁装置：用干净纸巾清除尿液和粪便，用自来水清洗实验设备，再用经70%乙醇轻微喷洒的纸巾擦拭装置表面，以掩盖前一只小鼠留下的气味。
    5. 为尽量减少实验人员带来的干扰，在视频录制期间要求实验人员离开行为学实验房间，或在莫里斯水迷宫实验期间停留在窗帘后方。
  3. 行为学测试顺序安排
    1. 按照图1A所示顺序安排行为学测试。除高架十字迷宫实验外，其余测试应间隔24小时进行。
      注意：由于整个实验流程最长可达2周，若用于急性或短期研究，可在相似测试中选择部分项目以简化测试流程。
      警告：连续两天进行开放场实验可确保新物体识别实验前的充分适应。强迫游泳实验应安排在最后进行，因其可能对C57BL/6N小鼠造成应激。

2. 行为测试方案

  1. 旷场实验8,18,19,20
    1. 在尺寸为60 cm（长 [L]）× 60 cm（宽 [W]）× 40 cm（高 [H]）的不透明白色塑料旷场装置中进行旷场实验。
      注意：使用多个装置可提高实验通量。
    2. 启动摄像机录制，将小鼠轻轻放置于旷场装置某侧壁中点附近，使其面朝该侧壁。记录小鼠行为10分钟，之后将其放回饲养笼。按照步骤1.2.4所述清洁装置。
      注意：旷场实验的起始点也可设为旷场中心。各小鼠之间应保持一致。
    3. 重复上述操作，直至所有小鼠完成实验。不同组之间应交叉平衡测试顺序。
    4. 按以下方式分析数据：
      1. 在计算机屏幕上将旷场划分为4×4的虚拟网格。为评估运动功能，统计小鼠在旷场内穿过的网格线数量19。
        注意：“穿过一条线”的定义是小鼠的两只后肢均越过该线。此定义同样适用于高架十字迷宫实验。
      2. 以小鼠在中央区域停留的时间作为焦虑水平的指标。中央区域为旷场中心的四个方格。
        注意：其他参数，如直立行为（前肢离地，前肢贴墙或直立站立）、首次直立的潜伏期、理毛行为和静止行为，可反映小鼠的情绪性。
      3. 或者，可使用Seibenhener和Wooten8详细描述的追踪软件，测量小鼠移动的总距离、速度以及在中心区域停留的时间。
  2. 加速转棒实验18
    1. 在给予药物、毒素处理、建模或疾病发作前，进行为期3天的加速转棒训练，并按计划在图1A所示时间进行1天的运动功能测试。
      注意：小鼠在训练和测试期间每天接受三次试验。每次试验从转棒开始旋转时计时，至小鼠掉落时结束。
    2. 将转棒装置放置于行为学实验台面上，避免设备受到直射光照。设定设备程序，使其从4 rpm开始，在5分钟内匀加速至40 rpm。
    3. 每次试验中，将小鼠面朝设备侧壁放置于静止的转棒上。待小鼠稳定后启动设备。一旦小鼠掉落，立即停止设备并记录其在转棒上停留的时间。随后立即重复进行另外两次试验，之后将小鼠放回饲养笼。
    4. 对其他小鼠重复上述操作。
    5. 通过测试期间三次试验中小鼠在转棒上停留时间的平均值，评估其运动功能。
      注意：训练第三天在转棒上的平均停留时间可作为运动功能的基线值。
  3. 社交互动实验18
    1. 进行社交互动实验时，使用一个旷场装置，内含两个相同的透明小室（8 cm [L] × 6 cm [W] × 12 cm [H]），小室表面有孔洞；另准备一只新的同性别幼年同种小鼠（助手小鼠），该小鼠此前未与受试小鼠接触过。图1B展示了实验流程示意图。按照步骤1.2.4所述清洁旷场装置及小室。
      注意：新小鼠不能是受试小鼠的同窝仔鼠或同笼饲养小鼠。应采用群养且健康的小鼠，并按照步骤1.2.3所述在行为学实验室内适应15至30分钟。
    2. 将两个小室分别放置于旷场相对两侧墙的中点位置。将受试小鼠按步骤2.1.2所述方式引入旷场（如图1B所示），进行3分钟的探索。随后将受试小鼠放回饲养笼，并清除旷场内的尿液或粪便。
    3. 将助手小鼠放入其中一个透明小室内。再次将受试小鼠引入旷场，记录其3分钟内的行为。结束后将两只小鼠分别放回各自的饲养笼。按上述方法对其他受试小鼠重复实验。
      注意：助手小鼠所在小室的位置应在组内交叉平衡或随机分配。
    4. 根据视频数据，计算描述小鼠社交互动行为的参数thelper/tempty，即与助手小鼠所在小室互动的时间（thelper）与空小室互动时间（tempty）的比值；或使用识别指数thelper/(thelper + tempty)。
      注意：当小鼠鼻尖距离小室2 cm以内且朝向小室时，定义为一次互动。
  4. 高架十字迷宫实验10
    1. 在所有小鼠完成旷场实验的同一天进行高架十字迷宫实验。按照步骤1.2.4所述清洁装置。
      注意：高架十字迷宫呈“+”字形，包含两条相对的开放臂（30 cm × 5 cm × 0.5 cm）和两条垂直于开放臂的封闭臂（30 cm × 5 cm × 16 cm），中央为一个平台（5 cm × 5 cm × 0.5 cm）。迷宫离地高度为40 cm。
    2. 将小鼠放置于开放臂与封闭臂的交界处，使其面朝与实验者相对的开放臂（图1C）。记录小鼠行为5分钟，之后将其放回饲养笼。重复此过程直至所有小鼠完成测试。
      注意：小鼠面朝开放臂进入迷宫可能增加其对开放臂的探索行为。
    3. 根据视频记录，测量小鼠在开放臂（topen）和封闭臂（tclose）停留的时间：topen/tclose比值反映焦虑水平。
  5. 强迫游泳实验11
    1. 强迫游泳实验装置为一个高30 cm、直径20 cm的圆柱形水箱。向水箱中注入室温（23–25 °C）自来水，水深至15 cm。
      注意：每只小鼠使用新鲜水。
    2. 启动视频录制，将小鼠轻轻放入水箱中央。记录6分钟视频后，将小鼠取出并放回饲养笼，在红外灯下干燥。
      注意：不得通过溺水或扭动尾巴的方式干扰小鼠。
    3. 分析录像中最后5分钟内的静止时间。静止定义为除维持身体平衡和保持头部浮出水面所必需的动作外，无其他运动。
  6. 新物体识别实验17,18
    1. 新物体识别实验包括2天适应期、1天熟悉期和1天测试期（图1D）；每只小鼠每次实验持续10分钟，各次实验间隔24小时。
      注意：适应期的旷场实验操作见第2.1节。在熟悉期，小鼠与两个相同的物体（旧物体）互动；在测试期，小鼠与一个旧物体和一个新物体互动，两个物体的位置与熟悉期中物体位置相同。新物体识别实验装置包括一个旷场装置和两组物体。每组包含两个相同的物体（物体A和A，物体B和B）。物体A和B大小相似，但在材质（玻璃/塑料/纸）、形状（圆形/立方体）和颜色（明亮/深色）上不同。物体应无气味，且足够大，使小鼠可在10分钟内充分探索。成年C57BL/6N小鼠适用的物体尺寸约为高8 cm、宽/直径5 cm。
    2. 标记熟悉期和测试期中两个物体的位置，物体距侧壁5 cm，距顶部7 cm。
      注意：应在熟悉期前一晚标记位置，以避免记号笔气味干扰。
    3. 在熟悉期，小鼠与一组相同物体互动。将小鼠放入旷场前，按步骤1.2.4所述清洁旷场和物体，将小鼠面朝侧壁中点放入（如图1D所示）。记录10分钟行为后，将小鼠放回饲养笼。重复操作直至所有小鼠完成实验，并将所有笼具送回动物房。
      注意：为减少偏差，组内应交叉平衡使用的物体（例如，小鼠1和2探索物体A和A，小鼠3和4探索物体B和B；这样，小鼠1和2的新物体为B，小鼠3和4的新物体为A）。
    4. 在熟悉期24小时后进行测试。操作流程与熟悉期相同，但将其中一个物体替换为另一组中的物体（图1D）。重复操作直至所有小鼠完成测试，之后将所有笼具送回动物房。
      注意：为减少偏差，组内应交叉平衡新物体的位置（例如，小鼠1和3接触物体A和B，小鼠2和4接触物体B和A）。这样，新物体在小鼠1和4面前位于右侧，在小鼠2和3面前位于左侧。此处“左侧”指实验者面对旷场时的左侧。
    5. 根据测试阶段的视频记录，分别测量每只小鼠与新物体（tnew）和旧物体（told）互动的时间。动物与物体的互动定义见步骤2.3.4后的注释。计算小鼠的记忆偏好，即对新物体的偏好 = tnew/told；或tnew/(tnew + told)。
      注意：若tnew/told = 1，或tnew/(tnew + told) = 0.5，表示小鼠对新物体无偏好（即记忆受损）。熟悉期中与物体互动的时间可作为实验对照。总互动时间反映小鼠的探索活动，tleft/tright比值反映空间偏好。
  7. 莫里斯水迷宫实验16
    1. 按以下方式设置装置：
      1. 将水迷宫（一个直径120 cm、深60 cm的圆形水池）置于行为学实验房间中央，并标记其位置，以确保整个实验过程中位置不变。
      2. 将水迷宫划分为四个相等的虚拟象限。在每个象限中心悬挂视觉线索（例如圆形、方形、三角形和五边形），距地面130 cm，距水池壁53 cm。
        注意：整个测试过程中，水迷宫和视觉线索的位置必须保持不变，以便小鼠形成准确的空间记忆。
      3. 在第四象限中心距池壁25 cm处放置一个平台，并标记其位置。供小鼠使用的平台直径为10 cm。
        注意：平台的位置和直径决定了任务难度。平台越靠近池壁或直径越大，任务越容易。
      4. 向水迷宫中注入水温为23至25 °C的水，并加入奶粉或食品增白剂使水呈白色且不透明，水位高出平台1 cm。将小鼠带入行为学实验房间适应15至30分钟（如步骤1.2.3所示），并打开笼具上方的红外灯，用于干燥小鼠。
        注意：用白色布料和网覆盖平台顶部，以便小鼠容易攀爬。确保水面无直射光照。
    2. 按以下方式开展训练阶段：
      1. 训练阶段持续5天，每天进行四次试验。每天的起始点应半随机安排，如文献16所示。此举可防止小鼠建立关联记忆，这是实验中最常见的“作弊”方式。
      2. 每次试验开始时，启动视频录制，将小鼠轻轻放入水迷宫中。
        注意：不得将小鼠丢入水池或扭动其尾巴，以免造成额外应激和方向迷失。
      3. 要求实验者避开小鼠视线，在以下任一情况发生时返回并将其带回饲养笼：(i) 小鼠在60秒内未能找到平台；(ii) 小鼠在60秒内找到平台并停留10秒。在情况(i)下，实验者应将小鼠放置于平台上，使其停留10秒。
        注意：情况(ii)表示小鼠成功定位平台。
      4. 停止视频录制，将小鼠放回饲养笼，并在红外灯下干燥。
        注意：维持小鼠体温对其表现至关重要，因为低体温会增加小鼠应激，可能影响后续实验。
      5. 对下一只小鼠重复上述操作。
      6. 根据视频记录逃逸潜伏期，即小鼠从进入水迷宫到成功定位平台所花费的时间。若小鼠在60秒内未能找到平台或停留时间少于10秒，则逃逸潜伏期记为60秒。以每日平均逃逸潜伏期绘制学习曲线。
        注意：逃逸潜伏期不包括在平台上停留的10秒。
    3. 按以下方式开展探查阶段：
      1. 在莫里斯水迷宫实验的第六天，按步骤2.7.1所述设置装置，拍摄水迷宫照片以记录平台位置，然后将平台从水池中移除。
      2. 启动视频录制，将小鼠轻轻放入与目标象限对角相对的象限中。
      3. 在1分钟的录像过程中，实验者应避开小鼠视线。录像结束后，由实验者将小鼠从水迷宫中取出并放回饲养笼。
      4. 以步骤2.7.3.1拍摄的图像为参考，测量小鼠穿越原平台位置的持续时间。根据视频记录小鼠在目标象限停留的时间（ttarget），总时长为ttotal。计算对目标象限的偏好：ttarget/ttotal。

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结果

该行为学测试组合旨在对运动、情绪和认知功能进行全面且有效的行为分析，这些功能在神经退行性疾病中常受到影响5。我们已应用该测试组合研究成年早期C57BL/6N小鼠在经呼吸道暴露于二氧化硅纳米颗粒1个月和2个月后的行为变化18。结果表明，暴露于二氧化硅纳米颗粒的C57BL/6N小鼠在不同暴露时间后表现出多种行为改变18。简而言之，旷场实验（图2A）和加速转棒实验（图2B）的结果显示，二氧化硅纳米颗粒暴露未影响小鼠的自主活动能力或运动功能，表明其具备完成其他测试的充分能力。在暴露1个月后，小鼠的社交互动活动受到影响（图2C）。考虑到焦虑或抑郁也可能降低社交能力，我们进一步分析了旷场实验、高架十字迷宫实验（图2D

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讨论

小鼠行为学分析对神经退行性疾病研究至关重要。在神经退行性疾病中，认知功能通常是行为领域中最易受影响的部分，而情绪功能障碍（如抑郁和焦虑）也常伴随出现。此外，在某些行为学测试中，运动功能常常会影响实验结果的解读，例如新物体识别实验、高架十字迷宫实验和社会交互实验。基于上述考虑，需要采用一套全面的行为学测试组合，以实现对动物行为的整体性和精确性评估。

第一步是选择合适的测试。我们纳入了公认且经典的测试，即用于运动功能的旷场实验和转棒实验、用于焦虑的高架十字迷宫实验、用于抑郁的强迫游泳实验、用于社交行为的社交互动实验，以及用于认知的莫里斯水迷宫实验和新物体识别实验。经典的焦虑测试有三种，即旷场实验、高架十字迷宫实验和明暗箱实验。这些实验均利用了动物对新环境的先天好奇心与对开阔、高处或明亮区域的回避行为之间的冲突。因此，这些测试无需使用电击、捕食者气味等有害刺激对小鼠进行条件化处理。然而，大量研究显示，这些测试的内部一致性可靠性较差，即使在同一实验室内部也存在此问题。21我们采用旷场实验和高架十字迷宫实验，在尽可能短的时间内分析小鼠的焦虑行为...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢香港大学生物医学学院赖小诗博士提供高架十字迷宫实验设备，以及香港大学麻醉学系提供转棒实验装置。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
社交互动测试用隔间自制(8 cm (L) x 6 cm (W) x 12 cm (H))，透明带孔，塑料材质
强迫游泳测试用圆柱形水箱自制高30 cm，直径20 cm，玻璃材质
高架十字迷宫自制开放臂（30 cm x 5 cm x 0.5 cm），封闭臂（30 cm x 5 cm x 16 cm），中央平台（5 cm x 5 cm x 0.5 cm），总高40 cm，塑料材质，不透明
IITC Roto-Rod 仪器IITC life science Inc.755, series 8
开放旷场实验装置自制60 cm (L) x 60 cm (W) x 40 cm (H)，塑料材质，不透明
水迷宫自制直径120 cm，深60 cm，钢制

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