人类多能干细胞有效分化为肝细胞

摘要

该协议详细介绍了单层无血清方法,在18天内从人类多能干细胞(hPSCs)中高效生成肝细胞样细胞。这需要六个步骤,因为hPSCs在形成肝细胞样细胞之前,按顺序分化成中间细胞类型,如原始条纹、最终内皮、后前体和肝芽祖细胞。

摘要

肝脏排毒有害物质,分泌重要蛋白质,并执行关键的代谢活动,从而维持生命。因此,肝衰竭(可能由慢性酒精摄入、肝炎、急性中毒或其他侮辱引起)是一种严重疾病,可最终导致出血、黄热病、昏迷,并最终死亡。然而,治疗肝功能的方法,以及肝功能和疾病的研究,由于人类肝细胞的缺乏,部分受阻。为此,该协议详细介绍了人类多能干细胞(hPSCs)与肝细胞样细胞的有效分化,其指导是一个发展路线图,描述了肝脏命运是如何在六个连续分化步骤中指定的。通过操纵发育信号通路,促进肝脏分化,并明确抑制不需要的细胞命运的形成,这种方法在第6天有效地生成人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞的种群和 PSC 差异的 18 个。这是通过时间精确控制发展信号通路实现的,由无血清培养基中的小分子和生长因子施加。该系统的分化发生在单层,并产生肝细胞样细胞,表达特征肝细胞酶,并有能力移植慢性肝衰竭的小鼠模型。在体外有效生成大量人类肝细胞的能力对治疗肝衰竭、药物筛选和肝病的机械研究都有影响。

引言

该协议的目的是有效地区分人类多能干细胞(hPSCs)到丰富的肝脏芽祖细胞和肝细胞样细胞2。获得现成的人类肝脏祖和肝细胞样细胞将加速研究肝功能和疾病的努力,并可能支持新的细胞移植疗法肝衰竭3,4 ⁵.这在过去被证明是具有挑战性的,因为hPSCs(包括胚胎和诱导多能干细胞)可以分化成人体的所有细胞类型;因此,很难将它们完全区分为单细胞类型的纯种群,如肝细胞6。

要将hPSC精确区分为肝细胞,首先不仅要了解肝细胞是如何指定的,还要了解非肝细胞类型是如何发育的。了解非肝细胞如何发育对于在分化期间从逻辑上抑制非肝系的形成非常重要,从而专门指导hPSC走向肝脏命运2。其次,必须划定hPSC区分肝脏命运的多重发育步骤。众所周知,hPSCs在形成肝细胞样细胞(HEP)之前,会按顺序分化成多种细胞类型,称为原始条纹(APS)、最终内皮(DE)、后前体(PFG)和肝芽祖细胞(LB)。早期的工作揭示了指示肝脏命运的信号和抑制交替非肝细胞类型(包括胃、胰腺和肠道祖细胞)形成的信号,每个发育系选择2,

方案

1. 差异化介质的准备

注:有关所用材料和试剂的制造商信息,请参阅材料表。

1. 制备基础化学定义介质
   注:CDM2、CDM3、CDM4和CDM5是化学定义的介质,用作不同阶段将hPSC与肝细胞区分为基介质的基础介质。这些介质的组成可在表1中找到。
   1. 要制作 CDM2 或 CDM3,请准备含有聚乙烯醇 (PVA) 的库存溶液。将 0.5 g 的 PVA 粉末溶解在 50 mL 的 Iscove 改性 Dulbeco 介质 (IMDM) 中,以生成 10 mg/mL PVA 库存。
      注:由于PVA不易溶解,在锥形烧瓶中制备PVA/IMDM混合物,在加热垫上以+50°C连续搅拌;使用磁力搅拌器可以轻松实现搅拌。
   2. PVA在IMDM中均匀溶解后,从加热垫中取出PVA溶液,使其冷却至室温。
   3. 使用无菌 0.2 μm 过滤器过滤 PVA 溶液。
   4. 通过结合步骤 1.1.1 中过滤过的 PVA 和表 1和材料表中概述的各种商业购买的组件来准备 CDM2 和 CDM3。使用无菌 0.2 μm 滤光片单元过滤所有介质。
      注:

结果

在 APS 分化 24 小时后,菌落通常采用不同于未分化的菌落的形态,同时失去通常限制 hPSC 菌落的明亮边界。形态上,原始条纹细胞通常具有不规则的边界,比hPSCs传播更紧密,更紧凑-这是令人回味的上皮到中生体过渡,因为多能表细胞分化和进入原始条纹在体内。如果分化前的hPSC的菌落大小过大,将有一个明显升高的中心,由未分化的细胞组成。含有如此大团状的培养物应该被丢弃,因为这些未分化的殖民地中心会混淆随后的分化。如果镀有正确尺寸和密度的团块,APS 分化是高度可重复和均匀的,生成 99.3±0.1% MIXL1-Gfp+ 原始条纹总体(MIXL1 是原始条纹标记)⁷。请注意,在APS分化24小时后观察到一些细胞死亡。

在分化的第2天,原始条纹细胞已经分化为第2天明确的内皮细胞,其中绝大多数表示SOX17(图2)和FOXA2。在.......

讨论

这种方法使丰富的肝芽祖细胞,以及随后的肝细胞样细胞,从hPSC生成。产生丰富人类肝细胞种群的能力对于实际利用这种细胞非常重要。以前从hPSCs生成肝细胞的方法产生了含有肝脏和非肝细胞的不纯细胞群,在移植到啮齿动物体内后,除了肝^组织15外,还产生了骨骼和软骨。因此,明确抑制非肝分化对于产生可能适合各种应用的丰富肝脏种群至关重要。

值得注意的是,hPSC 的第一步控制电镀对于高效的下游分化至关重要。在电镀过程中,以一定密度精确地将 hPSC 板进行分化,并在井或板上均匀地分配这些 hPSC 非常重要。例如,对于 12 孔板的每个孔,每孔种子 160,000 到 250,000 hPSC;总体而言,必须对细胞播种密度进行三分决定,并最终测试适合每个细胞系的细胞密度(图4)。如果每口井播种的hPSC太多,它们就会形成大菌落,这将对分化效率产生不利影响,因为与外围细胞相比,大菌落中间的细胞不易获得分化信号;异质大小的殖民地也会出现类似的问题。如果细胞密度过低(例如,低于200,000个.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1：1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2 μm 孔膜过滤器	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco 或 Millipore	Gibco A11105，Millipore SCR005
IMDM， GlutaMAX™补充	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 营养混合物、GlutaMAX™补充剂	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR，Knockout 血清替代品	Thermofisher Scientific	10828028
聚（乙烯醇）	Sigma-Aldrich	P8136
转铁蛋白	Sigma-Aldrich
化学成分明确的脂质浓缩	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R&D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
人 FGF2	R&D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
人 BMP4	研发D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
毛喉素	Tocris	1099/10
抑瘤素 M	R&D	295-OM
地塞米松	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	开曼化学品	16457
人重组胰岛素	Sigma-Aldrich	邮编：11061-68-0