高效分化人多能干细胞为肝细胞

摘要

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs 依次分化为原始条纹、定型内胚层、后部前肠和肝芽前体细胞等中间细胞类型，最终形成肝细胞样细胞。

摘要

肝脏具有解毒有害物质、分泌重要蛋白质以及执行关键代谢活动的功能，从而维持生命。因此，由长期饮酒、肝炎、急性中毒或其他损伤引起的肝功能衰竭是一种严重疾病，可能导致出血、黄疸、昏迷，最终死亡。然而，由于缺乏充足的人类肝细胞来源，肝功能衰竭的治疗手段以及肝脏功能与疾病的研究在一定程度上受到阻碍。为此，本实验方案详细描述了如何通过模拟肝脏发育过程的路线图，将人类多能干细胞（hPSCs）高效地分化为肝细胞样细胞，该路线图阐明了肝脏命运在连续六个分化阶段中的确立过程。通过调控发育相关的信号通路，促进肝脏分化并明确抑制非目标细胞命运的形成，该方法可在多能干细胞分化的第6天和第18天分别高效获得人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞。这一过程通过小分子化合物和生长因子在无血清培养基中对发育信号通路进行精确的时间控制来实现。该分化体系采用单层培养方式，所获得的肝细胞样细胞表达典型的肝细胞酶类，并具备植入慢性肝功能衰竭小鼠模型的能力。在体外高效生成大量人类肝细胞的能力，对肝功能衰竭的治疗、药物筛选以及肝脏疾病机制研究均具有重要意义。

引言

本实验方案的目的是高效地将人多能干细胞（hPSCs）分化为富集的肝芽祖细胞和肝样细胞群体²。获得可随时使用的大量人肝祖细胞和肝样细胞，将加速对肝脏功能与疾病的研究，并可能为肝功能衰竭提供新的细胞移植治疗策略^3,4,5。过去这一目标一直具有挑战性，因为hPSCs（包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞）具有分化为人体所有细胞类型的潜能；因此，很难将其特异性地完全分化为单一细胞类型（如肝细胞）的纯群体⁶。

为了精确地将人多能干细胞（hPSCs）分化为肝细胞，首先不仅需要理解肝细胞是如何被特化的，还需要了解非肝细胞类型的发育过程。了解非肝细胞的发育机制对于在分化过程中逻辑性地抑制非肝细胞谱系的形成至关重要，从而可将hPSCs exclusively诱导至肝细胞命运²。其次，必须明确hPSCs向肝细胞命运分化的多个发育阶段。已知hPSCs会依次分化为多个细胞类型，即原始条纹（APS）、定型内胚层（DE）、后前肠（PFG）和肝芽前体细胞（LB），最终形成肝样细胞（HEP）。早期研究揭示了在每个发育谱系选择过程中，决定肝细胞命运的信号通路以及抑制其他非肝细胞类型（包括....

方案

1. 分化培养基的制备

注意：有关所用材料和试剂的制造商信息，请参见材料表。

1. 基础化学成分明确培养基（CDM）的制备
   注意：CDM2、CDM3、CDM4 和 CDM5 是化学成分明确的培养基，用作将人多能干细胞（hPSCs）在不同阶段分化为肝细胞的基础培养基。这些培养基的组成见表1。
   1. 配制 CDM2 或 CDM3 时，需先配制含聚乙烯醇（PVA）的储存液。将 0.5 g PVA 粉末溶解于 50 mL 改良伊格尔-达贝科培养基（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, IMDM）中，制成浓度为 10 mg/mL 的 PVA 储存液。
      注意：由于 PVA 不易溶解，建议将 PVA 与 IMDM 的混合物置于锥形瓶中，在加热板上约 50 °C 条件下持续搅拌；可使用磁力搅拌器实现有效搅拌。
   2. 待 PVA 在 IMDM 中均匀溶解后，将 PVA 溶液从加热板上取下，并静置冷却至室温。
   3. 使用无菌的 0.2 µm 滤器对 PVA 溶液进行过滤。
   4. 根据表1和材料表中列出的成....

结果

APS 分化 24 小时后，细胞集落通常会呈现出与未分化集落不同的形态，同时失去通常环绕 hPSC 集落的明亮边缘。从形态学上看，原始条纹细胞的边界通常不规则，比 hPSC 更为铺展且紧密程度较低——这类似于体内多能性上胚层细胞分化并迁入原始条纹时所发生的上皮-间充质转化。若分化前 hPSC 的集落尺寸过大，则会出现明显隆起的中央区域，其中含有未分化的细胞。此类含有大块细胞团的培养物应予以弃用，因为这些未分化的集落中心会干扰后续的分化过程。若接种的细胞团尺寸和密度适当，APS 分化具有高度可重复性和均一性，可产生 99.3±0.1% MIXL1-Gfp+ 原始条纹细胞群体（MIXL1 为原始条纹标志物）⁷。需注意，APS 分化 24 小时后可观察到部分细胞死亡现象。

分化第2天时，原条细胞已分化为第2天的定型内胚层细胞，其中绝大多数表达SOX17（

讨论

该方法能够从人多能干细胞（hPSCs）诱导产生富集的肝芽祖细胞，并进一步分化为肝细胞样细胞。获得高纯度的人类肝细胞群体对于此类细胞的实际应用至关重要。以往由hPSCs诱导生成肝细胞的方法所获得的细胞群体纯度较低，其中包含肝细胞与非肝细胞，在移植至啮齿类动物体内后，除肝脏组织外，还会形成骨和软骨组织¹⁵。因此，明确抑制非肝系分化是获得可用于多种应用的富集肝细胞群体的关键。

值得注意的是，在第一步中对hPSCs进行可控接种对于高效的后续分化至关重要。进行分化时，必须以特定的细胞密度准确接种hPSCs，并在接种过程中将这些hPSCs均匀分布于孔板或培养板的各个孔中。例如，对于12孔板的每个孔，接种160,000至250,000个hPSCs；总体而言，必须对细胞接种密度进行滴定，并最终测试出适用于每种细胞系的最佳细胞密度（图4）。若每个孔接种的hPSCs过多，则会形成较大的细胞集落，这将对分化效率产生不利影响，因为大型集落中心区域的细胞相比边缘区域的细胞更难接收到分化信号；而大小不均.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2 μm 孔径膜滤器	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco 或 Millipore	Gibco A11105，Millipore  SCR005
IMDM，GlutaMAX™ 补充剂	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 营养混合物，GlutaMAX™ 补充剂	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR，无血清替代物	Thermofisher Scientific	10828028
聚乙烯醇	Sigma-Aldrich	P8136
转铁蛋白	Sigma-Aldrich	10652202001
化学成分明确的脂质浓缩液	Thermofisher Scientific	11905031
人 Activin	R&D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
人 FGF2	R&D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
人 BMP4	R&D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R&D	295-OM
Dexamethasone	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman chemicals	16457
人重组胰岛素	Sigma-Aldrich	11061-68-0