全皮层脑皮层电图阵列在普通狨猴中的慢性植入

摘要

我们开发了一种用于普通狨猴的全皮层脑皮层电图阵列，该阵列连续覆盖了从枕极到颞极和额极的皮层几乎整个外侧表面。本方案描述了将该阵列慢性植入狨猴脑硬膜外腔的操作步骤。

摘要

皮层脑电图（ECoG）能够以高时空分辨率监测大脑皮层的电场电位。近年来，薄而柔韧的ECoG电极的发展使得大规模皮层活动的稳定记录成为可能。我们为普通狨猴开发了一种全皮层ECoG阵列，该阵列连续覆盖皮层半球几乎整个外侧表面，从枕极延伸至颞极和额极，可一次性捕捉全皮层的神经活动。本方案描述了将该阵列慢性植入狨猴硬膜外腔的手术流程。狨猴在ECoG记录方面具有两个优势：其一是其解剖结构（包括额叶、顶叶和颞叶复合体）与人类和猕猴具有同源性；其二是狨猴的大脑为平滑脑（无沟回），且含有大量在猕猴中较难通过ECoG接触的皮层复合体，这些区域在狨猴中直接暴露于脑表面。这些特征使得大多数皮层区域可被直接记录。该系统为研究全脑皮层信息处理提供了机会，其时间分辨率可达亚毫秒级，空间分辨率可达毫米级。

引言

认知功能需要广泛脑网络中神经元集合的协调活动，尤其是人类高度发达的新皮层，被认为参与了高级认知行为。然而，新皮层如何实现此类认知行为仍是神经科学领域尚未解决的问题。近年来，薄而柔性的皮层脑电图（ECoG）电极的发展使得能够稳定记录大规模皮层活动¹。Fujii 及其同事为猕猴开发了一种全皮层 ECoG 阵列^2,3。该阵列连续覆盖几乎整个外侧皮层，从枕极延伸至颞极和额极，可一次性捕捉全皮层的神经活动。我们进一步将该系统改进并应用于普通狨猴^4,5，这是一种体型小、可进行遗传操作的新世界猴^6,7。相比其他物种，该动物具有多种优势。该物种的视觉、听觉、躯体感觉、运动及额叶皮层区域此前已被绘制，并报道其基本同源结构与人类和猕猴相应区域相似^{8,9,10,11,12,13,14,15,16}。其大脑表面光滑，大多数外侧皮层区域暴露于皮层表面，在猕猴中使用 ECoG 难以触及这些区域。基于这些特点，狨猴适用于皮层脑电图研究。此外，狨猴表现出复杂的社会行为，已被提议作为研究人类社会行为的候选模型¹⁷。

本方案描述了一种在普通狨猴大脑皮层整个外侧表面进行ECoG阵列硬膜外植入的手术程序。该方法为灵长类动物皮层神经科学领域的研究提供了机会，可用于监测大规模皮层活动，涵盖感觉、运动、高级认知以及社会行为等方面。

方案

本方案已在6只普通狨猴上实施（4只雄性，2只雌性；体重 = 320–470 g；年龄 = 14–53个月）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的建议。本方案经理化学研究所伦理委员会批准（编号：H28-2-221(3)）。所有手术均在麻醉下进行，并尽一切努力减少所用动物数量及其不适。

1. 准备

1. 获取每个个体大脑的结构性磁共振成像（MRI）。该图像将用于通过与狨猴脑图谱和计算机断层扫描（CT）配准来确定电极位置。
2. 皮层脑电图（ECoG）阵列的制备：准备一个定制的多通道ECoG阵列（图1A）。一个96通道的ECoG阵列由两个分别含有32和64个电极的片层组成。为了适应个体间脑大小的差异，ECoG阵列设计有可调节的柔性臂，该臂可根据个体脑形覆盖颞极区域。将参考电极置于与ECoG电极相反的方向，接地电极则置于与ECoG电极相同的方向。
   1. 将ECoG阵列与连接器外壳（图1B）组装，并使用丙烯酸胶密封连接器的缝隙（图1C），以防止手术过程中液体渗入。使用环氧乙烷气体对阵列进行灭菌处理。
3. 准备并灭菌所有手术器械。
   注意： 所使用器械均列于材料表中。

2. ECoG 阵列的植入

注意：手术前 4 小时以上停止进食和饮水。所有手术步骤均须使用无菌手套和器械，以无菌技术进行操作。

1. 移植前操作步骤
   1. 在给予东莨菪碱（0.08 mg/kg）肌内注射5分钟后，通过肌内注射氯胺酮（15 mg/kg）对狨猴进行麻醉诱导。
   2. 使用异氟烷（1-3%，用氧气/一氧化二氮混合气体稀释）进行麻醉并维持麻醉状态 根据动物的生理状态进行调整，并持续监测。确保心率维持在130-180次/分钟，持续监测体温和动脉血氧饱和度（SpO2）以评估动物状况。
   3. 用剃毛器和脱毛剂剃除动物头部顶部的毛发。用湿纱布彻底冲洗皮肤上的脱毛膏，否则会造成皮肤损伤。
   4. 注射抗生素（头孢维星；16 mg/kg，皮下）、降压药（呋塞米；2.0 mg/kg，肌内）和止血药（卡巴克洛钠磺酸盐水合物；0.2 mg/kg，肌内）。
   5. 将动物置于立体定位仪上。此时，在耳杆上涂抹2%利多卡因凝胶，并在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止干燥和术后疼痛。
   6. 用碘溶液对术区进行消毒，并覆盖无菌手术巾。 在皮肤切口处涂抹2%利多卡因凝胶。
2. 植入手术步骤
   1. 用手术刀沿头皮正中线切开皮肤约4厘米。使用刮匙将颞肌从颅骨上剥离，直至完全暴露手术区域。清除颅骨表面的组织，通过加压止血彻底止血，必要时使用骨蜡。用湿润的纱布包裹皮肤和肌肉边缘。手术过程中保持纱布湿润。
   2. 将阵列的前缘放置在额极边缘上，使用无菌铅笔在颅骨上标记计划进行颅骨开窗、切口和钻孔的区域。颅骨开窗的位置取决于阵列的设计图2).
   3. 沿标记1钻取颅骨窗，如图所示 图2钻骨时，向切削刃吹入空气以保持术野清晰。接着，沿标记2完整切割一圈，此时骨片中心仍与硬脑膜相连。从一侧边缘轻轻抬起骨片，并用刮匙剥离硬脑膜。此操作必须缓慢且小心地进行，否则容易撕裂硬脑膜。
      1. 移除骨片上的骨尖，并用湿润的纱布包裹该骨片，因为此骨片将在植入阵列后重新放回。
   4. 按照图示进行第3和第4步开颅手术 图2这些装置分别允许将电极插入眶额区和枕区。
   5. 在标记5处钻出狭缝，如图所示 图2这些切口可用于观察阵列，以确保其正确插入。
   6. 现在已暴露硬脑膜。用生理盐水冲洗该区域，必要时通过加压止血和明胶海绵止血。如有需要，可用刮匙或咬骨钳清理开颅部位的边缘。
   7. 制作切口（标记为6的部位） 图2将参考电极置于对侧感觉运动区和枕区的硬膜外腔。具体位置应根据实验需求确定。
   8. 在连接器每个杆的四个位置用1.0 mm螺钉钻出螺孔（以十字标记表示） 图2）。为防止损伤硬脑膜，将解剖刀片插入颅骨下方。钻孔方向应与颅骨表面垂直。随后安装聚醚醚酮（PEEK）螺钉（1.4 × 2.5 mm）作为锚点，用于固定连接器至颅骨。
   9. 将ECoG电极阵列插入硬膜外腔。使用平头镊子夹持电极阵列。
      注意： 阵列插入时应避免弯曲。若阵列发生弯曲，可通过在颅骨与硬脑膜之间插入刮匙来创建适当空间。若弯曲是由于脑组织相对较小所致，可剪除部分电极。
   10. 用牙科丙烯酸树脂固定参考电极和接地电极。将参考电极置于硬膜外腔，接地电极置于颅骨表面。两个电极的接触面均应朝向颅骨。
   11. 将骨片放回原位，并用牙科丙烯酸树脂将连接器和头固定装置固定在颅骨的螺钉上。
   12. 用6-0尼龙线缝合前额和后头部的皮肤，并使用皮肤闭合器将皮肤固定在连接器两侧。
3. 植入后操作步骤
   1. 将动物从立体定位仪上取下。在后续步骤中，确保动物保持温暖并供氧。
   2. 手术后立即给予动物美洛昔康（0.3 mg/kg，肌内注射），以减轻术后疼痛。同时给予抗炎性皮质类固醇（地塞米松；2.0 mg/kg，肌内注射）和皮下输液（乳酸林格液；5.0 mL），其中加入法莫替丁（0.5 mg/kg）作为胃保护剂。
      注意：非甾体抗炎药与皮质类固醇同时使用可能产生胃肠道不良反应。
   3. 待动物恢复后（通过心率和血氧饱和度确认），移除生命体征监测设备，并将动物转入重症监护室（ICU）观察2-3天。

3. 术后治疗

注意： 动物通常需要 5 天时间才能从手术中完全恢复。

1. 为防止脑肿胀，术后第一天每天两次给予抗炎皮质类固醇地塞米松（2.0 mg/kg）。第二天和第三天将剂量减至每天两次1.5 mg/kg，第四天减至每天两次1 mg/kg。
2. 术后连续5天给予镇痛药（美洛昔康；0.1 mg/kg，口服，每日一次）和止血药（卡巴克洛钠磺酸盐水合物；0.2 mg/kg，肌内注射，每日两次）。
   注意： 在本研究中，部分狨猴（6只中的3只）在术后1-2天出现活动减少和呕吐症状。这可能是由于血肿导致颅内压升高所致。当狨猴出现此类症状时，我们重新打开颅骨并在全身麻醉（阿法沙龙）下清除血肿。如果ECoG阵列在植入过程中未发生弯曲，则血肿很可能位于阵列与复位骨片之间的间隙中。此时可通过导管向该间隙注入生理盐水冲洗清除血肿。该操作通常可使动物恢复。
3. 电极位置的确定
   1. 术后约1周，对动物头部进行计算机断层扫描（CT）。
      注意： 此时是检查信号是否能够正常记录的良好时机。打开连接器外壳，并清除任何存在的血块。
   2. 使用AFNI软件¹⁸（https://afni.nimh.nih.gov）将T2加权MRI图像配准至立体定位坐标（图3A）。利用AFNI将CT图像与T2加权解剖磁共振图像对齐（图3B）。使用AFNI和ANTS¹⁹将狨猴脑图谱注册至MRI图像（图3C）。

结果

全皮层ECoG阵列可同时记录单个半球全部区域的神经元活动。图4展示了清醒狨猴多个听觉区域的听觉诱发电位（AEP）示例。ECoG记录在被动聆听条件下进行。每只狨猴接受由20种不同频率的随机纯音组成的听觉刺激。随后，我们通过对与纯音起始时间对齐的ECoG信号进行平均，计算出AEP。在低级和高级听觉区域观察到不同的波形，表明我们的ECoG阵列具有足够的空间分辨率，能够捕捉不同皮层区域中差异化的信息处理过程。

图1：ECoG阵列的制备。（A...

讨论

为确保成功植入，应在手术前后为动物提供充足的营养。较短的手术时间对于优化动物恢复也至关重要。准备工作应至少在手术前一天完成。为了缩短手术时间，建议此前使用因其他实验目的而处死的动物进行开颅手术训练及电极阵列植入。 表1展示了本方案时间进程的一个示例。

我们根据具体情况对麻醉程序和术后处理进行了调整。在本视频方案中，动物通过气管插管接受异氟烷和氧气的混合气体进行麻醉和维持。异氟烷可替换为七氟烷，气管插管也可替换为面罩。在其他情况下，我们采用肌肉注射氯胺酮与美托咪啶混合液的方式对动物进行麻醉。此时，动物首先以布托啡诺（0.2 mg/kg，肌内注射）进行初始镇静，随后通过注射氯胺酮（30 mg/kg，肌内注射）与美托咪啶（0.35 mg/kg，肌内注射）的混合液实现外科麻醉。

由于ECoG直接记录电场的变化，其时间分辨率受限于记录系统。我们记录系统的最高时间分辨率为30 kHz。通常我们以1 kHz的采样率采集信号，发现这已足以提取感觉/运动信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
烧杯（100 cc）			Outocrave
棉球			Outocrave
吸收三角	精细科学工具公司（Fine Science Tools Inc.）	18105-03	Outocrave
细头棉签	清十字有限公司（Clean Cross Co., Ltd.）	HUBY340 BB-013	Outocrave
纱布			Outocrave
巾钳			Outocrave
手术刀柄			Outocrave
持针器			Outocrave
虹膜剪			Outocrave
微型蚊式钳			Outocrave
Adson 钳，1×2 齿			Outocrave
骨刮匙			Outocrave
微型刮匙	精细科学工具公司（Fine Science Tools Inc.）	10091-12	Outocrave
持针器，12.5 cm，弯曲，光滑钳口	世界精密仪器公司（World Precision Instruments）	14132	Outocrave
血管扩张器，12 cm，0.1 mm 尖端	精细科学工具公司（Fine Science Tools Inc.）	18131-12	Outocrave
血管扩张器，12 cm，0.2 mm 尖端	精细科学工具公司（Fine Science Tools Inc.）	18132-12	Outocrave
细尖咬骨钳	精细科学工具公司（Fine Science Tools Inc.）	16221-14	Outocrave
立体定位仪操作臂			气体灭菌
操作臂扳手			气体灭菌
连接器用自制夹具			气体灭菌
牙科丙烯酸硅胶杯			气体灭菌
硅胶杯支架			气体灭菌
画笔			气体灭菌
铅笔			气体灭菌
微型螺钉，1.4 mm × 2.0 mm	日本化学螺钉有限公司（Nippon Chemical Screw Co., Ltd.）	PEEK/MPH-M1.4-L2	气体灭菌
微型螺钉用螺丝刀			气体灭菌
钻机用微型电机手柄			气体灭菌
不锈钢钻头，1.4 mm			气体灭菌
不锈钢钻头，1.0 mm			气体灭菌
钻头，1.2 mm			气体灭菌
橡胶吹气球			气体灭菌