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脊髓损伤Wistar大鼠在跑步机上的活动依赖性训练

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DOI：

10.3791/58983

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2019年1月16日

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1Department of Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville, 2Kentucky Spinal Cord Injury Rehabilitation Center, University of Louisville

本文内容

摘要

本方案展示了我们针对脊髓损伤（SCI）大鼠的基于活动的跑台运动训练模型。该方案包括四足运动组和仅前肢运动组，以及两种不同类型的非训练对照组。研究人员可利用此方案评估训练对脊髓损伤大鼠的影响。

摘要

脊髓损伤（SCI）会导致持久的功能障碍，包括运动能力受损以及多种自主神经相关功能障碍。在脊髓损伤人群中，跑步机上的运动训练（LT）被广泛用作康复手段，可带来诸多益处并改善日常生活功能。我们在脊髓损伤后的啮齿类动物中采用这种基于活动的任务特异性训练（ABT）方法，旨在阐明这些改善背后的机制，并进一步优化现有的临床康复方案。我们当前的目标是确定在中度至重度挫伤性脊髓损伤大鼠中，ABT诱导的排尿、排便及性功能改善所涉及的机制。将每只动物固定于定制的可调节背心中后，再将其连接至多功能体重支持装置，随后降至经过改装的三道跑步机上，每天进行一次、每次58分钟的步态训练辅助，持续10周。该装置可同时用于四肢行走训练和仅前肢训练的动物，并设有两个不同的非训练对照组。接受四肢训练并辅以体重支持的动物由技术人员现场协助，必要时帮助其完成正确的后肢踏步动作；而仅进行前肢训练的动物则在尾部抬高，确保后肢不接触跑步机且不承受重量。一组非训练的SCI动物被置于吊带中，静置于跑步机旁；另一组对照SCI动物则留在训练室附近的饲养笼中。该实验范式可同时训练多只脊髓损伤动物，不仅提高了时间效率，而且确保我们的临床前动物模型尽可能贴近临床实际情况，特别是在人工辅助下进行体重支持这一方面。

引言

全球每年新增约25万至50万例脊髓损伤（SCI）病例，其病因包括退行性病变、疾病，但最常见的是创伤（占90%）1。创伤性SCI发生后，机体将经历一系列生理变化，导致神经功能缺损，影响多种身体功能。由于SCI后常伴随慢性功能障碍，开发并测试有效的治疗手段至关重要。直到最近，康复策略主要集中在恢复运动能力2,3。然而，SCI患者普遍认为膀胱/排尿、肠道及性功能障碍是影响生活质量最严重的问题，亟需更有效的管理措施1,4,5。因此，从康复医学的角度来看，改善膀胱、肠道和性功能具有极其重要的意义1,4,5。

运动和运动训练（locomotor training, LT）是脊髓损伤（SCI）患者群体中常用的康复治疗手段，具有多种益处，如改善心血管功能、膀胱/排尿功能和运动能力6,7,8,9,10。正因如此，我们在临床前大鼠SCI模型中也采用了类似的干预方式。我们的目标是明确LT对SCI Wistar大鼠的影响，特别是对其上尿路（肾脏）和下尿路（膀胱、尿道外括约肌）功能、肠道功能以及性功能的影响。此外，已有研究表明，LT足以激活损伤平面以下的神经肌肉系统，这可能影响中枢神经系统（CNS）内的可塑性程度11,12。

在大型13,14和小型15,16,17,18,19脊髓损伤（SCI）动物模型中，LT在临床前研究中的成功已有充分文献记载。研究表明，LT所提供的传入性感觉输入足以激活脊髓反射通路，从而诱导可塑性并改善感觉运动功能9,20。然而，LT对自主神经功能的益处尚未得到充分表征。基于此，我们实施了以自主神经功能结局指标为重点的训练范式，设置了四个不同组别，包括两个未经训练的对照组、一个代谢/运动非负重组，以及一个LT组；该LT组在时间安排、单次训练时长、手动辅助和体重支持方面均模拟临床研究中所采用的参数19,21,22,23,24。

方案

所述所有方法均已获得路易维尔大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 损伤前处理与测试（脊髓损伤前一周）

  1. 每天对每只大鼠进行5至10分钟的操作，持续五天。
    注意：本方案使用约50日龄、体重为200–225 g的成年雄性Wistar大鼠。在损伤前的这一时间点，大鼠未适应LT所用背心装置，因为后肢可完全活动的大鼠能够从背心中逃脱。
  2. 进行任何与研究相关的伤前测试（例如，作者对涉及脊髓损伤（SCI）对膀胱和肠道功能影响的研究进行代谢笼评估。

2. 脊髓挫伤25,26,27,28

  1. 使用氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物，按照提供的剂量表进行腹腔注射麻醉动物表1）。根据需要给予补充剂量。至少每10分钟通过评估角膜、眼睑、足底、尾夹及耳廓反射来测试麻醉深度。
  2. 剃除动物背部将进行切口和损伤区域的毛发。使用4% Dermachlor外科洗液清洁手术区域。给予长效广谱抗生素（例如，0.5 cc 皮下注射Pro-Pen-G）。
  3. 将麻醉后的动物置于低温设置的加热垫上，以维持其正常体温。
  4. 根据椎体隆起估计目标病灶节段的位置，使用#10手术刀在动物背部正中线椎体上方做一长约5 cm的切口。
  5. 对于胸段中段的挫伤，暴露脊髓的T8/T9节段 通过 使用咬骨钳切除覆盖的T7椎板。
  6. 使用挫伤装置（如无限视野撞击器）29，进行挫伤（对于中度至重度脊髓损伤，使用210 kdyn的力，无停留时间）18.
  7. 使用4-0单丝缝线缝合脊髓上方的肌层和筋膜，并用9 mm外科伤口夹闭合皮肤。
  8. 术后给予药物，如硫酸庆大霉素（5 mg/kg/天，持续5天；用于预防膀胱感染的抗生素）和美洛昔康（1 mg/kg，皮下注射，前48小时作为镇痛药使用，之后按需给予）。
  9. 将动物放入干净的笼子中，并置于加热垫上。每15分钟检查一次动物的生命体征，直至其从麻醉中完全苏醒。  术后第一天，通过给予含糖零食鼓励动物进食。在术后的前48小时内（每日三次，与手动挤压排尿时间同步——见步骤2.10），需观察大鼠是否出现活动减少、触碰时发声以及食欲和饮水欲下降等情况。  若发现镇痛效果不足，将联系兽医人员。在术后最初的两周恢复期内，需持续观察动物是否出现感染或其他并发症迹象。一旦反射性排尿功能恢复，动物每日需护理两次（清晨和傍晚）。出现感染或显著体重下降的动物将立即实施安乐死。关于食物与饮水摄入，实施安乐死的临界标准为动物体重下降超过20%。术后正常范围内的体重减轻以及损伤平面以下肌肉因失用导致的萎缩，通常为15%至20%。所有动物每周至少称重一次。
  10. 每天3次（上午8点、下午3点、晚上10点）采用手动Credé法进行排尿导尿操作，直至反射性膀胱功能恢复（挫伤情况下平均需3至6天）26,30.

3. 训练阶段

  1. 脊髓损伤后至少两周方可开始低温治疗，过早干预可能加剧继发性损伤级联反应31.
  2. 第一周跑步机训练适应：将大鼠转运至专用于训练的安静房间。
  3. 第1天，将脊髓损伤动物随机且均匀地分为训练组和未训练对照组，以控制损伤本身以及挫伤后自发恢复程度可能存在的个体差异。例如，将大鼠分为4个独立组：四肢体训练组（QT）、仅前肢训练组（FT）、未训练对照组（NT）和未训练家庭笼具对照组（HC）。还可设置假手术组，即动物接受椎板切除术但未造成损伤，其他处理方式与其他组相同，作为无损伤且未经训练的对照组。
  4. 将每只动物放入相应的束缚装置中（图1并将安全带固定在跑步机上方的体重支撑装置上 通过 鳄鱼夹，固定在承重弹簧上（图2和图3这需要将动物固定在跑步机的某一位置，以确保其朝指定的前进方向和速度运动。
    注意：由于时间和人员限制，作者的实验室以每组十二只动物进行每日训练，每亚组三只。
  5. 按照先前发表的方案开始适应性培养过程17从SCI后第3周开始进行低温适应，采用渐进式跑步机暴露方案，第1天为10分钟，第一周内逐渐增加至目标时长58分钟（表 2）。通常到第4天，动物已能很好地适应训练方案。如果某只动物在适应期第三天仍未表现出进展，则应缩短训练时间，并以更缓慢的增量增加额外适应天数（此情况罕见）。
    1. 如果动物在最初一两天内无法适应背带和跑步机的束缚，应停止训练，将其从背带上取下，放回笼中，并给予两份零食以强化其未来配合的行为。 第二天，再次将动物置于背带和体重支撑系统中，持续10分钟。在随后的几天中， initially 将训练时间增加20分钟，然后继续每天递增训练时长，至第10天达到全程训练。
  6. 遵循所提供的详细训练方案 表 2.
    1. 由于损伤后后肢使用受限，QT组大鼠在跑步机上行走时需要手动辅助以实现正确的足部放置。用双手的同一手指（通常为中指）辅助支撑髋部/腰部。当动物需要进一步协助迈步时，可用同一手指在膝关节上方施加压力以启动迈步动作。如有必要，可使用另一手指（通常为小指）辅助足部完成迈步。
      注意：所需的身体重量支持量因动物个体而异，并随着训练的进展而变化。弹簧支撑系统提供的辅助力度足以使动物保持正确的步态姿势。训练人员可根据需要，按照上述方法提供额外支持。需要注意的是，步行训练（LT）的一个关键要素是由训练人员促进的、功能上恰当的足部放置以及肢体间的协调性，这些要素独立于支撑系统而存在。
    2. 对于足底刺激训练组，调节体重支撑系统，轻微抬高后肢，确保足底无感觉刺激，且后肢不通过与跑台接触而承受重量。
      注意：FT组作为运动和代谢对照组，类似于人体活动训练研究中的手摇运动。
    3. 将NT组以与QT组相同的方式固定并连接到体重支持系统，并将NT组放置在靠近QT组的静止平面上图2和图3).
      注意：NT组不进行任何干预，用于控制因长时间束缚可能产生的影响。
    4. 家庭笼组可作为额外的对照组。将这些动物运送至训练场所，作为该组的附加步骤。
  7. 从LT开始后的第7至10天起，每天对每只动物训练一次，持续至研究终止日。每次训练结束后，给予每只动物一份含糖零食以强化其配合行为。继续按照所提供的1小时方案对动物进行每日LT处理。 表2 在研究期间例如，8至12周，以模拟临床研究中约80次、每次一小时的治疗疗程）9.

4. 安乐死与组织采集

  1. 按照美国兽医协会（AVMA）关于安乐死的指南，向动物施用致死剂量的麻醉剂。
  2. 当心脏仅存微弱搏动时，立即在专用通风橱内开始灌注，首先灌注冷肝素化生理盐水，随后灌注冷的4%多聚甲醛溶液。
    1. 首先使用手术剪在膈肌处做一横切口，暴露胸腔。继续沿两侧肋骨向前剪开，移除肋骨。将灌注针插入心脏左心室，并用止血钳固定针头，然后剪开右心房。
    2. 通过灌注泵装置使冷肝素化生理盐水流经动物的血管系统。当右心房流出澄清的生理盐水后，切换为冷的4%多聚甲醛溶液，直至动物身体变得僵硬。
  3. 取所需组织，如肾脏、膀胱、结肠、脑、感觉神经节和脊髓，并将其置于4%多聚甲醛中，在4 °C下保存最多48小时。24–48小时后，将组织转移至30%蔗糖溶液中，并在4 °C下保存。
  4. 将收集的组织转移至30%蔗糖/磷酸盐缓冲冷冻保护液中，直至准备切片。进行切片时，将组织包埋于组织冷冻包埋剂中，并根据所用组织类型在恒冷切片机上切成所需厚度（e.g.，脑和脊髓组织为35 µm，器官组织为5–7 µm）。

结果

根据该训练方案，已有文献记录显示，仅QT组动物在与其他组别比较时表现出更优的运动功能18。然而，由于本实验室的研究重点，我们主要关注基于活动的任务特异性训练（ABT）对非运动功能的益处，包括膀胱、肠道及性功能。例如，我们此前发表的数据表明，在脊髓损伤（SCI）大鼠中，LT训练可使QT组和FT组的多尿症状显著减轻（图4）17。此外，肾组织中转化生长因子-β（TGF-β）表达在损伤后通常会下降，提示免疫反应发生改变，但在QT组和FT组中未观察到该下降现象，其TGF-β水平与假手术（无损伤）动物相似。在同一项研究中17，在实施安乐死和组织采集前，进行了清醒状态下的膀胱测压。排尿周期中膀胱收缩的最大振幅在假手术组、QT组和FT组之间无显著差异，而NT组仍表现出显著异常。综上，这些数据表明运动训练对肾脏健康和膀胱功能具有积极影响，从而改善脊髓损伤后的排尿功能。

脊髓损伤（SCI）人群中多尿现象的潜在机制目前尚不明确，可能是多因素共同作用的结果32。有研究假设，例如，当脊髓损伤个体处于轮椅坐位时，液体在下肢积聚可能导致液体负荷过重，并在体位改变时（如从坐位转为卧位）增加液体排出33。然而，这一解释并不适用于临床前模型，因此我们最初将研究重点放在精氨酸加压素（AVP）上，AVP 是调控体内液体稳态的激素，且可受运动调节。AVP 通过激活肾脏中的 V2 受体，促进肾集合管对水的重吸收，从而维持液体稳态34。一项初步实验（慢性时间点，单一损伤程度——210 kdyn 冲击力）的初步证据表明，运动（LT 和 FT）对大鼠肾脏 V2 受体水平具有有益影响（图 5）。

定制手套设计；带孔洞和魔术贴翻盖的织物；可用性与便利性研究。
图1：为雄性Wistar大鼠定制的背心装置。 QT和NT动物均使用同一种背心（A），其中QT动物的后肢可自由活动。用于FT动物的背心在基础上增加了额外的绑带（B），用于抬高后肢，确保无体重支撑。背心上大面积的钩环材料部分便于根据动物体型差异或个体在实验过程中体型变化进行快速调节。请点击此处查看该图的放大版本。

用于材料应力-应变分析的带有 NT、QT、FT 传感器的传送带测试装置。
图 2：训练站装置示意图。 围绕跑步机的体重支持装置，适用于 NT（最左侧）、QT（中间）或 FT（右侧）组。请点击此处查看此图的放大版本。

啮齿类动物运动测试装置；佩戴背带的大鼠在跑步机上，骨骼肌研究。
图3：动物训练装置。上方的（A）为顶视图，（B）为侧视图，显示体重支撑装置及连接夹与背带的固定位置。注意FT动物的后肢（B）被抬高，脱离跑步机传送带。插图（C）为连接夹固定在背带上的局部放大图。请点击此处查看此图的放大版本。

SCI 后 24 小时内训练前后对尿量和水量的影响图。
图 4：ABT 对 SCI 后大鼠多尿的影响。 总尿量（A）在 SCI 后增加（*；p < 0.05），在 QT 和 FT 组经过 9 周 LT 训练后接近基线水平，而 NT 组相对于训练组仍保持较高水平（#；p < 0.05）。所有组在 9 周时的尿量均高于基线水平，并且排尿量（B）增加。需要注意的是，各组之间的排尿次数（C）和饮水量（D）保持不变。数据以均值 ± 标准误表示。本图经作者许可转载17。 请点击此处查看此图的放大版本。

不同条件下大鼠肾脏中V2蛋白水平的Western blot及条形图比较
图5：ABT对大鼠肾脏的影响。 5组大鼠（每组4只，共20只）肾脏中V2受体蛋白表达水平的Western blot结果，显示了各蛋白条带的表达水平 A 以及图中条带的组平均密度分析结果（使用ImageJ；OD = 光密度） B，表明存在显著差异（*；p < 在SCI后慢性时间点（12周）接受每日1小时、持续10周ABT治疗的各组中，受体数量较基线水平（假手术对照组）无明显下降（p > 0.05）。误差线表示标准误。 请点击此处以查看此图的放大版本。

氯胺酮/赛拉嗪剂量表
有效剂量：***使用100 mg/mL氯胺酮原液和20 mg/mL赛拉嗪原液***
80 mg/kg 氯胺酮
10 mg/kg 赛拉嗪
1.0 mL 混合注射液 = 0.62 mL 氯胺酮原液 (100 mg/mL) + 0.38 mL 赛拉嗪原液 (20 mg/mL)
动物体重混合注射量动物体重混合注射量
(g)(mL)(g)(mL)
1000.132750.36
1050.142850.37
1100.142900.38
1150.153000.39
1200.163050.4
1250.163100.4
1300.173150.41
1350.183200.42
1400.183250.42
1450.193300.43
1500.23350.44
1550.23400.44
1600.213450.45
1650.213500.46
1700.223550.46
1750.233600.47
1800.233650.47
1850.243700.48
1900.253750.49
1950.253800.49
2000.263850.5
2050.273900.51
2100.273950.51
2150.284000.52
2200.294100.53
2250.294200.55
2300.34300.56
2350.314400.57
2400.314500.59
2450.324600.6
2500.334700.61
2550.334800.62
2600.344900.64
2650.345000.65
2700.355100.66

表1：根据动物个体体重确定的麻醉剂剂量表。

训练时间
(min)		速度 (cm/s)持续时间 (min)
0-161
1-28.41
2-310.81
3-813.25
8-1310.85
13-2813.215
28-3310.85
33-3865
38-438.45
43-5813.215

表2：跑步机在各速度下运行对应时间的训练方案。

讨论

我们在脊髓损伤（SCI）后对大鼠进行辅助体重支持训练（ABT）的方法是一种新颖的治疗干预手段。尽管在动物模型中可能存在其他形式的运动和步态训练方法35,36,37，但本方法模拟了在脊髓损伤人类患者中临床实施的负荷训练（LT），我们在临床实践中已观察到有希望的结果23。结合本研究的实验装置、训练方案以及对照动物的使用，采用该训练范式所获得的结果将有助于理解脊髓损伤后ABT的益处。该实验方案未来的应用方向包括：观察ABT在不同训练时间段下的上述效应，以及ABT对不同损伤节段和损伤程度恢复效果的影响。

该实验设计的一个局限性在于所需时间较长。由于每只动物的训练方案要求每天进行1小时、持续10周，因此必须投入大量人力并制定周密的时间安排。需要特别关注的一个方面是功能性训练（FT）组，该组使用带有钩环材料绑带的特制背带，将动物后肢固定在跑台上方，以消除其体重支撑。必须确保动物不获得任何体重支撑，因此不在大鼠后爪下方放置平台。此外，由于先前的研究表明感觉输入是驱动脊髓运动系统可塑性的主要因素38,39,40，因此需要持续地对被动训练（QT）组动物进行操作，协助其完成踏步动作，这类似于临床环境中物理治疗师所进行的操作。

对商用动物跑台系统进行的一项重要改进是反转极性。在暴露电机后，将正负极导线互换，从而改变跑台的运动方向。这样可提供更大的操作空间，更便于接触和辅助训练动物（该系统在一端配有电击网格，旨在防止未束缚的脊髓完整的动物从跑台跑带上下落）。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Patricia Ward 博士、April Herrity 博士和 Susan Harkema 博士提供的意见与指导，Christine Yarberry 提供的手术协助，Yangsheng Chen、Andrea Willhite 和 Johnny Morehouse 提供的技术支持，以及 Darlene Burke 在统计分析和行为评估方面的帮助。本研究的资金支持来自美国国防部（W81XWH-11-1-0668 和 W81XWH-15-1-0656）以及肯塔基州脊髓与头部损伤研究信托基金（KSCHIRT 14-5）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Exer-3R 跑台Columbus Instruments电机反向极性
体重支撑系统N/AN/A改装的弹簧秤，带鳄鱼夹
大鼠背带N/AN/A我们的背带为定制；请参见图1以了解外观。
Infinite Horizon (IH) 撞击器装置Precision Systems and Instrumentation型号 0400
盐酸氯胺酮HospiraNDC 0409-2053-10
赛拉嗪（AnaSed 注射液）Akorn Animal HealthNDC 59399-110-20
美洛昔康（Eloxiject）Henry Schein Animal HealthNDC 116695-6925-2
硫酸庆大霉素（GentaFuse）Henry Schein Animal HealthNDC 11695-4146-1
尿烷，97%Argos OrganicsCAS 51-79-6
4-0 单丝缝合包（4-0 Ethilon 尼龙缝线）Ethicon, LLC205016
Michel 缝合夹（9mm 自动夹）MikRon Precision, Inc.1629
加热垫Mastex Industries, Inc型号 500
Tootie Fruitys 谷物早餐Malt O Meal用于训练奖励
雄性 Wistar 大鼠Envigo
10 号外科手术刀片Miltex货号：4-110

参考文献

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