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由离子通道掺杂脂质膜构成的生物分子忆阻器的组装与表征

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DOI：

10.3791/58998

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2019年3月9日

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1Joint Institute for Biological Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee, 3Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee, 4Department of Biosystems and Agriculture Engineering, University of Kentucky, 5Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Tennessee, 6Computer Science and Mathematics Division, Oak Ridge National Laboratory, 7Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

本文内容

摘要

柔软、低功耗的生物分子忆阻器利用了与生物突触相似的组成、结构和开关机制。本文介绍了一种组装和表征生物分子忆阻器的实验方案，该忆阻器来源于油相中水滴之间形成的绝缘脂双层膜。通过引入电压激活的短杆菌肽（alamethicin）肽，可实现跨膜的忆阻性离子电导。

摘要

在合成电路元件中重现突触功能的能力，对于旨在以相当的效率和密度模拟大脑认知能力的神经形态计算系统至关重要。迄今为止，基于硅的三端晶体管和两端忆阻器已在神经形态电路中得到广泛应用，这主要归功于它们能够将信息处理与存储功能集成于同一位置。然而，这些器件无法实现大脑所具有的连接性和复杂性，原因在于其功耗高、难以模拟关键的突触功能，并且存在噪声大、开关电压高等问题。为克服这些局限性，我们开发并表征了一种生物分子忆阻器，该器件在组成、结构和开关特性方面均模拟了生物突触。本文描述了由油相中脂质功能化水滴之间形成的5 nm厚脂双层，并掺杂电压激活的短杆菌肽A（alamethicin）肽所构成的生物分子忆阻器的组装与表征过程。尽管类似的组装方法已被用于研究水滴支撑脂膜及膜结合离子通道的生物物理特性，但本文重点介绍液滴界面双层法中的若干关键改进，这些改进对于实现稳定的忆阻器性能至关重要。具体而言，我们阐述了脂质体的制备过程、alamethicin肽在脂双层膜中的掺入方法，以及各组分的适当浓度及其对忆阻器整体响应的影响。此外，我们还详细说明了生物分子忆阻器的表征流程，包括通过循环伏安法获取并分析忆阻电流-电压关系，以及在阶跃式电压脉冲序列刺激下所表现出的短期可塑性和学习行为。

引言

人们普遍认为，生物突触因其能够以高度适应性的方式学习和处理信息，从而实现了大脑的高效率和巨大并行性。这种协调的功能源于多种高度复杂的分子机制，这些机制驱动着短期和长期的突触可塑性1,2,3,4,5。神经形态计算系统旨在模拟突触功能，达到接近大脑的密度、复杂性和能效水平，这是下一代类脑计算机所必需的6,7,8。然而，使用传统的电子电路元件来复制突触特性几乎是不可能的9，因此需要设计和制造能够适应输入信号并记忆信息历史的新硬件元件9。这类受突触启发的硬件被称为忆阻元件9,10,11（memory elements 的简称），根据 Di Ventra ....

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方案

1. 一般说明与注意事项

  1. 选择合适且无破损的玻璃器皿（如烧瓶、烧杯等）及其他实验器具（如刮勺、取样勺等）用于实验。
  2. 小心操作玻璃器皿，避免损坏；佩戴乳胶或丁腈手套，防止手指残留物污染器皿，同时保护皮肤。
  3. 使用洗涤剂溶液和水，借助软毛刷彻底刷洗所选玻璃器皿和实验器具，直至清洁并无任何残留物。
  4. 先用自来水充分冲洗，再用去离子水（DI水）冲洗，然后置于晾干架上自然晾干。
  5. 可选步骤：将清洗后的玻璃器皿和实验器具用异丙醇（IPA，99.5%）冲洗，并置于真空条件下蒸发残留的异丙醇，以确保无任何污染物（约2小时）。从真空腔中取出后，置于洁净环境中。
    注意：擦拭玻璃器皿和实验器具时应使用无尘擦拭纸。材料制备和样品储存时，请购买并使用无菌的小型玻璃瓶和安全锁扣管。有关玻璃器皿清洗及其他实验室标准操作程序的更多细节，请参阅 JoVE 科学教育数据库28。

2. 水相缓冲溶液的制备

  1. 佩戴乳胶或丁腈手套，选择一个合适且洁净的玻璃容器，用于配制 50 mL 水相缓冲液（500 mM 氯化钠（KCl）、10 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS），pH 7.0）。
  2. 使用数字....

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结果

图1展示了用于组装和表征生物分子忆阻器的实验装置。如图1b所示，将电极的自由端降低至油储池底部，有助于减少电极和液滴的振动，从而避免测量电流和双层膜面积的变化，尤其是在加热油时可能引发油中对流的情况下。图2展示了组装银/氯化银（Ag/AgCl）导线、玻璃毛细管以及电极和微移液管支架的过程及结果。该装置置于一个正确接地的法拉第笼内（图3），以最大限度减少电磁干扰。

本研究中形成稳定且具有绝缘性的脂双层至关重要。在本实验方案中，脂单层在浸入油相的水相液滴的油/水界面处自组装。当液滴相互接触时，多余的油被排出，相对的脂单层变薄，形成厚度为5 nm的脂双层。双层膜电生理学中最常用的技术是电压钳制，即控制跨膜电压并测量所诱导的电流。图4a展示了在脂双层形成过程中，由10 mV、10 Hz电压诱导产.......

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讨论

本文介绍了一种基于油相中两个水滴之间形成的、掺杂离子通道的合成生物膜来组装和表征生物分子忆阻器的实验方案。这种软物质双端器件的设计与研究旨在：1）克服与固态技术相关的限制，例如高噪声、高能耗和高开关电压；2）更精确地模拟生物突触的组成、结构及开关机制；3）探索固态器件所不具备的生物突触可塑性机制与特性。 

液滴界面双层技术21是当前技术的基本构建单元12，作为一种简单且模块化的膜组装方法，已被广泛用于研究膜生物物理学21、蛋白质22、离子通道29以及其他生物分子32。该技术在精确控制和研究模型膜方面具有独特优势，并可作为刺激响应性和自主性材料的基本单元26。目前已发展出多种组装液滴界面双层的方法，其中包括悬挂液滴法

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披露

本手稿由 UT-Battelle, LLC 在与美国能源部签订的 DE-AC0500OR22725 号合同下编写。美国政府保留相关权利，出版方在同意发表该文章的同时承认：美国政府保有对本手稿已发表形式进行出版或复制，或允许他人出于美国政府目的进行此类行为的非独占、免付费、不可撤销且全球范围内的许可权。

致谢

本研究得到了美国国家科学基金会（NSF ECCS-1631472）的资助。G.J.T.、C.D.S.、A.B. 和 C.P.C. 的研究工作部分由橡树岭国家实验室的实验室主导研究与开发项目资助，该实验室由 UT-Battelle, LLC 为美国能源部管理。本研究的部分工作在纳米相材料科学中心完成，该中心是美国能源部科学办公室下属的用户设施。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DPhPC）Avanti Polar Lipids850356P/850356C以冻干粉末（P）或氯仿溶液（C）形式购买 
琼脂糖 西格玛-奥德里奇A9539
琼脂糖（0.5 g 琼脂糖片剂）BenchmarkA2501可使用粉末或片剂形式 
短杆菌肽A（Alamethicin） AG ScientificA-1286
分析天平 梅特勒-托利多ME204TE/00
Axopatch 200B 放大器 分子器件公司-
BK Precision 4017B 10 MHz DDS 扫频/函数发生器Digi-KeyBK4017B-ND
硼硅酸盐玻璃毛细管世界精密仪器公司1B100F-4
猪脑总脂质提取物Avanti Polar Lipids131101
DigiData 1440A 系统分子器件公司-
带支架/加热块的挤出器套装 Avanti Polar Lipids610000包含微型挤出器、2个注射器、100张PC膜、100个滤膜支撑环和1个支架/加热块
冷冻柜（-20 °C）VWR国际公司SCUCBI0420AD
玻璃器皿VWR国际公司-
十六烷，99%西格玛-奥德里奇544-76-3
异丙醇VWR国际公司BDH1133-4LP
微电极夹持器 世界精密仪器公司MEH1S
MOPS西格玛-奥德里奇M1254
氮气（N2）气体AirgasUN1066
Parafilm M 通用实验室膜ParafilmPM999
无粉软质丁腈检查手套 VWR国际公司CA89-38-272
预清洁显微镜载玻片 费希尔科技公司 22-267-013
冰箱（4 °C）VWR国际公司SCUCFS-0504G
银丝GoodFellow147-346-94可根据应用选择不同直径 
氯化钠（KCl）西格玛-奥德里奇P3911
搅拌加热板赛默飞世尔科技 SP131325
VWR 轻型组织擦拭纸VWR国际公司82003-820
VWR Scientific 50D 超声波清洗机VWR国际公司13089

参考文献

  1. Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
  2. Squire, L. R. Memory systems of the brain: a brief history and current perspective. Neurobiology of learning and memory. 82 (3), 171-177 (2004).
  3. Benfenati, F....

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