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一种用于评估对Staphylococcus aureus感染先天免疫反应的小鼠模型

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DOI：

10.3791/59015

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2019年2月28日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of California Davis, 2Department of Dermatology, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

本文描述了一种实时检测小鼠皮肤损伤及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染所引发的先天免疫反应的方法。通过比较携带荧光中性粒细胞的LysM-EGFP小鼠与LysM-EGFP杂交免疫缺陷小鼠品系，我们加深了对感染机制的理解，并推动了抗感染策略的开发。

摘要

金黄色葡萄球菌 (S. aureus) 感染，包括耐甲氧西林菌株，给医疗系统带来了巨大负担。其发生率 S. aureus 感染率逐年上升，因此需要对其开展进一步的研究 致病性。传染病的动物模型有助于加深我们对宿主-病原体相互作用的理解，并推动有效治疗手段的开发。中性粒细胞在控制先天免疫反应中发挥主要作用 S. aureus 通过形成脓肿来隔离感染并促进细菌清除；浸润的中性粒细胞数量 S. aureus 皮肤感染通常与疾病结局相关。将LysM-EGFP小鼠（其溶菌酶M（LysM）启动子区域插入了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，主要在中性粒细胞中表达）与 活体全动物荧光成像（FLI）提供 一种非侵入性、纵向量化中性粒细胞迁移至受损皮肤的方法。当与生物发光技术结合时 S. aureus 通过菌株和连续的活体全动物生物发光成像（BLI），可在麻醉小鼠中从感染开始至恢复或死亡的整个过程中，纵向监测感染部位的中性粒细胞募集动态以及体内细菌负荷。小鼠对多种由病原菌产生的毒力因子具有更强的抵抗力。 S. aureus 有助于在人体内实现有效定植和感染。免疫缺陷小鼠为研究持续性感染提供了更为敏感的动物模型 S. aureus 感染以及治疗手段增强先天免疫反应的能力。在此，我们表征了LysM-EGFP小鼠与MyD88缺陷型小鼠杂交后所得后代（LysM-EGFP×MyD88）的免疫反应情况。-/- 小鼠）以及野生型 LysM-EGFP 小鼠，以开展研究 S. aureus 皮肤伤口感染。通过体内荧光成像（FLI）多光谱同步检测中性粒细胞募集动态，结合体内生物发光成像（BLI）检测细菌负荷，并对伤口愈合过程进行长期、无创的纵向监测。

引言

Staphylococcus aureus （S. aureus）是美国皮肤和软组织感染（SSTIs）的主要致病菌1。过去二十年来，耐甲氧西林S. aureus（MRSA）感染的发生率持续上升2，这推动了对细菌持续感染机制的研究以及新型治疗策略的探索。目前MRSA感染的标准治疗方案是全身性抗生素治疗，但MRSA对抗生素的耐药性随时间不断增强3，且这些药物可能破坏宿主有益的微生物组，导致不良健康影响，尤其在儿童中更为显著4。已有多个临床前研究探索了治疗MRSA感染的替代策略5，但由于致病因子的出现可抑制宿主免疫应答，这些方法在向临床转化过程中面临挑战6。为了深入解析驱动S. aureus皮肤和软组织感染的宿主-病原体相互作用动态，我们结合了对伤口床中募集的中性粒细胞数量的无创、纵向检测，以及对细菌载量和伤口面积的动力学测量。

中性粒细胞是人体内数量最多的循环白细胞，也是细菌感染的首要应答细胞7。由于中性粒细胞具有杀菌机制，包括产生活性氧、蛋白酶、抗菌肽，以及吞噬作用和中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap）形成等功能性反应，因此在宿主抵抗S. aureus感染的有效免疫应答中起着必要作用8,9。患有中性粒细胞功能遗传缺陷的人类患者，如慢性肉芽肿病和Chediak-Higashi综合征，对S. aureus感染的易感性显著增加。此外，中性粒细胞数量存在遗传性（如先天性中性粒细胞减少症）或获得性（如化疗患者中常见的中性粒细胞减少症）缺陷的患者，也极易感染S. aureus10。鉴于中性粒细胞在清除S. aureus感染中的重要作用，增强其免疫功能或调节S. aureus病灶内的中性粒细胞数量，可能成为治疗该类感染的有效策略。

在过去十年中，已开发出带有荧光中性粒细胞报告基因的小鼠，用于研究中性粒细胞的迁移过程11,12。将中性粒细胞报告基因小鼠与整体动物成像技术相结合，可实现对组织和器官中中性粒细胞的时空动态分析。当与发光的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株联合使用时，能够在细菌毒力因子直接影响或间接干扰受累组织中中性粒细胞数量的背景下，追踪中性粒细胞的聚集情况，并关联S. aureus的丰度与持续存在状态13,14,15,16。

小鼠对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的毒力和免疫逃逸机制的易感性低于人类。因此，野生型小鼠可能不是研究特定治疗手段对慢性金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染疗效的理想动物模型。MyD88缺陷型小鼠（即MyD88-/-小鼠）是一种免疫功能低下的小鼠品系，缺乏功能性白细胞介素-1受体（IL-1R）和Toll样受体（TLR）信号通路，其对金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的易感性高于野生型小鼠17，且中性粒细胞向皮肤金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染部位的迁移能力受损18。在MyD88-/-小鼠中构建携带荧光中性粒细胞报告基因的小鼠品系，为研究治疗金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的疗法疗效提供了替代模型，相较于现有的中性粒细胞报告小鼠具有优势。

在本实验方案中，我们对免疫功能低下的 LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠中的 S. aureus 感染进行了表征，并将其感染的时间进程及清除情况与 LysM-EGFP 小鼠进行了比较。LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠会发展为无法清除的慢性感染，其中 75% 在感染后 8 天内死亡。在感染的炎症阶段前 72 小时内，中性粒细胞的初始募集出现显著缺陷，且在感染后期募集的中性粒细胞数量减少了 50%。LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠感染易感性的增加，使其成为一种严格的临床前模型，可用于评估靶向 S. aureus 感染的新治疗技术的疗效，相较于使用野生型小鼠的现有模型，尤其适用于旨在增强针对感染的先天免疫应答的技术。

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方案

所有小鼠实验均经加州大学戴维斯分校机构动物照护与使用委员会审查和批准，并依照《动物福利法》和《健康研究扩展法》的指南进行。在处理动物时，务必使用无菌手套。

1. 小鼠来源与饲养

  1. 如前所述，在 C57BL/6J 遗传背景下培育 LysM-eGFP 小鼠12。通过将 C57BL/6J 背景的 LysM-EGFP 小鼠与 MyD88-/- 小鼠杂交，获得 LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠。
  2. 将小鼠饲养于动物实验设施中。本研究中，动物在手术前于加州大学戴维斯分校以群养方式饲养，手术后则单笼饲养。使用年龄在 10–16 周之间的小鼠。

2. 细菌制备与定量

  1. 移除生物发光信号 S. aureus 从-80 °C保存处取出目标菌株，置于冰上融化。在5%牛血琼脂平板上划线接种。将划线后的平板置于37 °C湿润培养箱中过夜（16 h）培养。
    注意：本实验方案中使用了 ALC2906 SH1000 菌株。该菌株含有穿梭质粒 pSK236，其上带有与青霉素结合蛋白 2 启动子融合的 luxABCDE 报告基因盒从 Photorhabdus luminescens18.
  2. 将胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）粉末按每毫升纯水加入0.03 g的比例溶解，混匀后经高压灭菌以灭菌。冷却后，采用无菌操作加入所需的抗生素。本方案中加入终浓度为10 µg/mL的氯霉素。18 在TSB中选择表达含有生物发光luxABCDE盒的pSK236穿梭质粒。
  3. 从平板上挑取3-4个独立的菌落 S. aureus 将菌株接种于含 10 µg/mL 氯霉素的 TSB 培养基中，开始过夜培养。将细菌置于 37 °C 摇床培养箱中孵育过夜（16 h）。
  4. 从过夜培养物中取样，按1:50比例接种于含10 µg/mL氯霉素的TSB培养基中，启动新的细菌培养。在37 °C、200 rpm条件下于恒温振荡摇床中培养。
  5. 分盘后两小时 S. aureus，监测 600 nm 处的光密度（OD600在分光光度计上测量吸光度（OD）。观察 OD 值600 与时间的关系以确定对数中期生长阶段。对于 ALC2906 SH1000 菌株，OD600 0.5 处于对数中期，对应浓度为 1 x 108 CFU/mL图1).
  6. 当OD600 为0.5时，用预冷的DPBS以1:1比例洗涤细菌。在3,000 x g条件下离心细菌10分钟 g 以及 4 °C。小心倾去上清液，加入额外的预冷 DPBS 并充分涡旋。再次以 3,000 x g 离心 10 分钟 g 和 4 °C。
  7. 小心倾去上清液。将细菌沉淀重悬于所需浓度的溶液中。本研究中，收集 3 mL ALC2906 SH1000，重悬于 1.5 mL PBS 中，对应细菌浓度约为 2 x 108 CFU/mL。使用前将细菌置于冰上保存。
  8. 为验证细菌浓度，将100 µL细菌样品用PBS分别稀释1:10,000和1:100,000。取20 µL稀释液接种于琼脂平板上。在37 °C湿润培养箱中培养16 h。通过肉眼观察计数菌落形成单位（CFU），并于次日计算细菌浓度。

3. 切除性皮肤伤口制备及接种 S. aureus

  1. 向每只小鼠注射 100 µL 浓度为 0.03 mg/mL 的盐酸丁丙诺啡溶液（约 0.2 mg/kg） 通过 腹腔注射 
  2. 注射后20分钟，将2-4只小鼠放入麻醉舱中，以2-3 LPM氧气混合2-4%异氟烷进行麻醉。待小鼠完全麻醉后，逐只转移至连接有2-3 LPM氧气混合2-4%异氟烷的鼻罩装置中。用拇指和食指用力夹捏每只小鼠的后肢足垫，以确认其是否完全麻醉。若小鼠对夹捏无反应，则进行下一步操作。
  3. 用电动剪毛器在小鼠背部剃除一块1英寸×2英寸的区域，并用干净的擦拭纸或纱布清除剪下的毛发。避免使用脱毛乳液，因其可能引起过度炎症。
  4. 先用含10%聚维酮碘的纱布清洁小鼠背部，再用含70%乙醇的纱布擦拭。以螺旋方式从手术区域中心向外周清洁。手术前等待约1分钟，使手术区域完全干燥。
  5. 用两根手指轻轻夹住小鼠背部剃毛区域，将无菌的6 mm打孔活检器在备皮区域中心用力按压。切勿拉紧皮肤。
    1. 旋转皮肤活检穿孔器，在皮肤上形成一个圆形轮廓，确保至少在轮廓的某一处完全穿透皮肤。注意不要切到深部的筋膜或组织。
    2. 使用无菌剪刀和镊子，沿穿刺活检留下的圆形印迹切割表皮和真皮。

4. S. aureus 接种

  1. 用28 G胰岛素注射器吸取所需浓度的生物发光细菌接种物。本研究中，接种浓度为1 × 108 CFU/mL（50 µL）。注射体积不得超过100 µL。
  2. 将50 µL接种物注射至小鼠背部伤口中心处筋膜与组织之间的间隙。确保接种物在伤口中心形成气泡，且无明显泄漏或扩散。
    1. 将皮肤向一侧牵拉，持注射器几乎与组织平行，缓慢刺入组织，直至阻力突然降低，表明已穿透筋膜。小心将注射器引导至伤口中心，缓慢注入接种物。随后缓慢将注射器从小鼠体内抽出。
  3. 对未感染动物的伤口，按上述方法注射相同体积的无菌PBS。
  4. 将动物放回笼中，将笼子置于加热灯下或加热垫上，并在动物从麻醉中恢复期间持续监测。

5. 体内生物发光成像与荧光成像

  1. 通过仪器软件启动整只动物成像仪。将小鼠置于麻醉舱中，以每分钟2-3升氧气流速通入2-4%异氟烷进行麻醉，并将麻醉气体输送至成像仪内的鼻罩。
  2. 将受伤并感染的小鼠放入成像仪中，调整小鼠位置，使伤口尽可能平展。按照以下序列设置对小鼠进行成像。
    1. 选择生物发光和拍照作为成像模式。曝光时间为1分钟，采用小像素合并模式，光圈F/stop 1（生物发光）和F/stop 8（拍照）。发射滤光片设置为开放。点击采集按钮以记录图像。
    2. 选择荧光和拍照作为成像模式。曝光时间为1秒，采用小像素合并模式，光圈F/stop 1（荧光）和F/stop 8（拍照），激发波长为465/30 nm，发射波长为520/20 nm，并使用高亮度光源。点击采集按钮以记录图像。
  3. 将动物放回笼中，并持续监测直至从麻醉中恢复。
  4. 按照上述方法每日对小鼠进行成像。

6. 图像分析

  1. 打开待量化的图像。
  2. 在图像中每只小鼠的整个伤口区域（包括周围皮肤）上放置一个较大的圆形兴趣区域（ROI）。中性粒细胞体内荧光成像（FLI）EGFP信号和体内生物发光成像（BLI） S. aureus 信号在数天后延伸至伤口边缘之外 包含在这些研究中的图2A 和 2B）。点击 测量 ROI 记录每只小鼠的平均通量值，并绘制每个信号的平均通量（p/s）曲线 与 时间。
  3. 如果中性粒细胞的绝对数量或 S. aureus 如果希望在伤口中实现上述效果，请进行以下实验。
    1. 为了将中性粒细胞数量与体内的 FLI EGFP 信号相关联，按上述方法对 C57BL/6J 小鼠造成伤口，并移植一系列骨髓来源的中性粒细胞（5 × 105 至 1 × 107来自 LysM-EGFP 或 LysM-EGFPxMyD88-/- 将供体直接置于不同伤口上方。按上述方法成像，并将体内FLI EGFP信号与已知数量的中性粒细胞进行关联。
    2. 用于关联 S. aureus 将菌落形成单位（CFU）与体内生物发光成像（BLI）信号关联，按上述方法造模并感染小鼠。感染后第1天，记录小鼠体内BLI信号，随后立即处死并冷藏尸体。取下伤口组织，匀浆处理，将细菌稀释液接种于琼脂平板，过夜培养。次日计数菌落，确定每处伤口的CFU。
  4. 通过在伤口边缘拟合一个圆形感兴趣区域（ROI）来测量伤口愈合情况，并测量伤口面积（cm2) 并绘制相对于基线的分数变化图 vs. 时间图 2C).

7. 统计学

注意：所有数据均以均值 ± 标准误表示。p < 0.05 被认为具有统计学显著性

  1. 使用 Holm-Sidak 法（alpha = 0.05）分析单日两个组别之间的差异，对每个时间点进行独立分析，不假设标准差一致。
  2. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验，比较同一天多个组别之间的差异。实验组间的生存率差异采用 Mantel-Cox 法进行分析。

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结果

LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠对 S. aureus 感染的易感性高于 LysM-EGFP 小鼠

该菌株的 S. aureus 本研究中使用的 ALC290618, 使用含有质粒构建 lux 可产生生物发光信号的构建体，用于检测活的且具有活跃代谢活性的细菌。将其接种至小鼠体内后，可利用活体生物发光成像（BLI）技术对感染伤口内的细菌负荷进行纵向监测。LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠和LysM-EGFP小鼠经伤口感染，接种1 x 107 菌落形成单位（CFU）的 S. aureus 在伤口中比较它们的易感性 S. aureus 感染。LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠对感...

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讨论

S. aureus 感染模型利用生物发光的 S. aureus 在荧光中性粒细胞报告小鼠体内感染，并结合全动物活体光学成像的先进技术，推动了我们对感染过程中先天免疫应答的认识。先前使用 LysM-EGFP 小鼠的研究表明，在感染最初 24 小时内，多达 1 × 107 个中性粒细胞会被募集至 S. aureus 感染的伤口14，且募集至伤口的中性粒细胞在应对 S. aureus 感染伤口时，其半衰期从 1.5 天延长至 5 天22。小鼠为对抗感染而采取的一种生存策略是将造血干细胞和祖细胞（HSPC）从骨髓转运至感染伤口，在伤口局部以 TLR2/MyD88/PGE2 依赖的方式扩增为具有杀菌功能的 EGFP+ 中性粒细胞21。此外，髓外粒细胞生成可为中性粒细胞提供关键来源，从而挽救 MyD88-/- 小鼠免于 S. aureus

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披露

Lloyd S. Miller 已获得 MedImmune、Pfizer、Regeneron 和 Chan Soon-Shiong Nanthealth 基金会的资助，以及来自 Noveome Biotherapeutics 和 Chan Soon-Shiong Nanthealth 基金会的咨询费，这些资助和费用与本文报道的研究无关。其他作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助项目R01 AI129302（资助S.I.S.）以及加州大学戴维斯分校药理学培训项目：从实验室到临床（NIH T32 GM099608资助L.S.A.）提供支持。加州大学戴维斯分校分子与基因组影像中心（CMGI）提供了卓越的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
14 mL 聚丙烯圆底管Falcon352059
6 mm 一次性活检穿孔器Integra Miltex33-36
生物发光 S. aureusLloyd Miller，约翰斯·霍普金斯大学 ALC 2906 SH1000
5% 牛血琼脂，Hardy DiagnosticsVWR10118-938
盐酸丁丙诺啡注射液西方医疗用品公司72920.3 mg/mL
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室000664
氯霉素（结晶粉末）Fisher BioReagentsBP904-100
DPBS (1x)Gibco 14190-144
胰岛素注射器Becton, Dickson and Company3294610.35 mm（28 G）× 12.7 mm（1/2″）
IVIS Spectrum 活体成像系统Perkin Elmer124262
Living Image 软件 – IVIS Spectrum 系列Perkin Elmer128113
LysM-eGFP 小鼠Thomas Graff 阿尔伯特·爱因斯坦医学院，纽约 NA
微量分光光度计赛默飞世尔科技ND-2000
MyD88基因敲除小鼠杰克逊实验室009088
无纺布海绵AMD- Ritmed 公司A2101-CH5 cm × 5 cm
聚维酮碘 10% 溶液Aplicare697731
Prism 7.0GraphPad Software许可 
胰蛋白胨大豆肉汤Becton, Dickson and Company211825

参考文献

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LysM EGFP MyD88

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