一种用于评估对Staphylococcus aureus感染先天免疫反应的小鼠模型

摘要

本文描述了一种实时检测小鼠皮肤损伤及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染所引发的先天免疫反应的方法。通过比较携带荧光中性粒细胞的LysM-EGFP小鼠与LysM-EGFP杂交免疫缺陷小鼠品系，我们加深了对感染机制的理解，并推动了抗感染策略的开发。

摘要

金黄色葡萄球菌 (S. aureus) 感染，包括耐甲氧西林菌株，给医疗系统带来了巨大负担。其发生率 S. aureus 感染率逐年上升，因此需要对其开展进一步的研究 致病性。传染病的动物模型有助于加深我们对宿主-病原体相互作用的理解，并推动有效治疗手段的开发。中性粒细胞在控制先天免疫反应中发挥主要作用 S. aureus 通过形成脓肿来隔离感染并促进细菌清除；浸润的中性粒细胞数量 S. aureus 皮肤感染通常与疾病结局相关。将LysM-EGFP小鼠（其溶菌酶M（LysM）启动子区域插入了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，主要在中性粒细胞中表达）与 活体全动物荧光成像（FLI）提供 一种非侵入性、纵向量化中性粒细胞迁移至受损皮肤的方法。当与生物发光技术结合时 S. aureus 通过菌株和连续的活体全动物生物发光成像（BLI），可在麻醉小鼠中从感染开始至恢复或死亡的整个过程中，纵向监测感染部位的中性粒细胞募集动态以及体内细菌负荷。小鼠对多种由病原菌产生的毒力因子具有更强的抵抗力。 S. aureus 有助于在人体内实现有效定植和感染。免疫缺陷小鼠为研究持续性感染提供了更为敏感的动物模型 S. aureus 感染以及治疗手段增强先天免疫反应的能力。在此，我们表征了LysM-EGFP小鼠与MyD88缺陷型小鼠杂交后所得后代（LysM-EGFP×MyD88）的免疫反应情况。^-/- 小鼠）以及野生型 LysM-EGFP 小鼠，以开展研究 S. aureus 皮肤伤口感染。通过体内荧光成像（FLI）多光谱同步检测中性粒细胞募集动态，结合体内生物发光成像（BLI）检测细菌负荷，并对伤口愈合过程进行长期、无创的纵向监测。

引言

Staphylococcus aureus （S. aureus）是美国皮肤和软组织感染（SSTIs）的主要致病菌¹。过去二十年来，耐甲氧西林S. aureus（MRSA）感染的发生率持续上升²，这推动了对细菌持续感染机制的研究以及新型治疗策略的探索。目前MRSA感染的标准治疗方案是全身性抗生素治疗，但MRSA对抗生素的耐药性随时间不断增强³，且这些药物可能破坏宿主有益的微生物组，导致不良健康影响，尤其在儿童中更为显著⁴。已有多个临床前研究探索了治疗MRSA感染的替代策略⁵，但由于致病因子的出现可抑制宿主免疫应答，这些方法在向临床转化过程中面临挑战⁶。为了深入解析驱动S. aureus皮肤和软组织感染的宿主-病原体相互作用动态，我们结合了对伤口床中募集的中性粒细胞数量的无创、纵向检测，以及对细菌载量和伤口面积的动力学测量。

中性粒细胞是人体内数量最多的循环白细胞，也是细菌感染的首要应答细胞⁷。由于中性粒细胞具有杀菌机制，包括产生活性氧、蛋白酶、抗菌肽，以及吞噬作用和中性粒细胞....

方案

所有小鼠实验均经加州大学戴维斯分校机构动物照护与使用委员会审查和批准，并依照《动物福利法》和《健康研究扩展法》的指南进行。在处理动物时，务必使用无菌手套。

1. 小鼠来源与饲养

1. 如前所述，在 C57BL/6J 遗传背景下培育 LysM-eGFP 小鼠¹²。通过将 C57BL/6J 背景的 LysM-EGFP 小鼠与 MyD88^-/- 小鼠杂交，获得 LysM-EGFP×MyD88^-/- 小鼠。
2. 将小鼠饲养于动物实验设施中。本研究中，动物在手术前于加州大学戴维斯分校以群养方式饲养，手术后则单笼饲养。使用年龄在 10–16 周之间的小鼠。

2. 细菌制备与定量

1. 移除生物发光信号 S. aureus 从-80 °C保存处取出目标菌株，置于冰上融化。在5%牛血琼脂平板上划线接种。将划线后的平板置于37 °C湿润培养箱中过夜（16 h）培养。
   注意：本实验方案中使用了 ALC2906 SH1000 菌株。该菌株含有穿梭质粒 pSK236，其上带有与青霉素结合蛋白 2 启动子融合的 luxABCDE 报告基因盒从 Photorhabdus luminescens

结果

LysM-EGFP×MyD88^-/- 小鼠对 S. aureus 感染的易感性高于 LysM-EGFP 小鼠

该菌株的 S. aureus 本研究中使用，ALC2906¹⁸, 使用含有质粒构建 lux 可产生生物发光信号的构建体，用于检测活的且具有活跃代谢活性的细菌。将其接种至小鼠体内后，可利用活体生物发光成像（BLI）技术对感染伤口内的细菌负荷进行纵向监测。LysM-EGFP×MyD88^-/- 小鼠和LysM-EGFP小鼠经伤口感染，接种1 x 10⁷ 菌落形成单位（CFU）的 S. aureus 在伤口中比较它们的易感性 S. aureus 感染。LysM-EGFP×MyD88^-/- 小鼠比LysM-EGFP小鼠更.......

讨论

S. aureus 感染模型利用生物发光的 S. aureus 在荧光中性粒细胞报告小鼠体内感染，并结合全动物活体光学成像的先进技术，推动了我们对感染过程中先天免疫应答的认识。先前使用 LysM-EGFP 小鼠的研究表明，在感染最初 24 小时内，多达 1 × 10⁷ 个中性粒细胞会被募集至 S. aureus 感染的伤口¹⁴，且募集至伤口的中性粒细胞在应对 S. aureus 感染伤口时，其半衰期从 1.5 天延长至 5 天²²。小鼠为对抗感染而采取的一种生存策略是将造血干细胞和祖细胞（HSPC）从骨髓转运至感染伤口，在伤口局部以 TLR2/MyD88/PGE₂ 依赖的方式扩增为具有杀菌功能的 EGFP⁺ 中性粒细胞²¹。此外，髓外粒细胞生成可为中性粒细胞提供关键来源，从而挽救 MyD88^-/- 小鼠免于 S. aureus

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 聚丙烯圆底管	Falcon	352059
6 mm 一次性活检穿孔器	Integra Miltex	33-36
生物发光 S. aureus	Lloyd Miller，约翰斯·霍普金斯大学	ALC 2906 SH1000
5% 牛血琼脂，Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
盐酸丁丙诺啡注射液	西方医疗用品公司	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	000664
氯霉素（结晶粉末）	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
胰岛素注射器	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm（28 G）× 12.7 mm（1/2″）
IVIS Spectrum 活体成像系统	Perkin Elmer	124262
Living Image 软件 – IVIS Spectrum 系列	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP 小鼠	Thomas Graff 阿尔伯特·爱因斯坦医学院，纽约	NA
微量分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-2000
MyD88基因敲除小鼠	杰克逊实验室	009088
无纺布海绵	AMD- Ritmed 公司	A2101-CH	5 cm × 5 cm
聚维酮碘 10% 溶液	Aplicare	697731
Prism 7.0	GraphPad Software	许可
胰蛋白胨大豆肉汤	Becton, Dickson and Company	211825