化学分离、定量与爬行动物皮肤脂质的分离

摘要

在爬行动物中，来自同种个体的皮肤脂质对性信号传递至关重要，并可能用于入侵物种的管理。本文描述了从蜕皮或完整个体中提取皮肤脂质、测定与分析总脂质质量，以及通过组分分离对脂质进行分离的实验方案。 通过 柱层析

摘要

爬行动物利用皮肤中的脂质向同种个体传递信号，主要用于追踪和评估配偶。分离这些脂质在研究化学通讯的进化模式与机制方面具有应用价值，同时有助于理解脂质在陆地生命进化过程中对防水功能的贡献。在实际应用中，基于皮肤信号的线索可为应对入侵物种的野生动物管理者提供潜在工具。本方案中定量爬行动物皮肤脂质的主要步骤包括提取、总脂质测定以及组分分离 通过 柱层析，后一过程可得到纯化的洗脱液组分，随后可对这些组分进行分析以确定化合物的鉴定信息（例如，气相色谱-质谱联用 [GC-MS]）和/或直接用于更精细的生物测定。皮肤脂质可使用非极性有机溶剂从活体皮肤、脱落的皮肤或死亡的完整动物中提取例如、正己烷、苯、甲苯）。萃取可使脂质溶解，随后蒸发溶剂，即可获得可测量的纯脂质提取物。分级分离则涉及将总脂质提取物分离为特定的洗脱组分 通过 传统的柱层析法。首先将总脂质提取物结合到基于基质的色谱柱上（例如，氧化铝）然后，分别收集洗脱液（"组分") 按特定体积依次通过色谱柱，根据极性相似性从脂质混合物中洗脱出不同组分。洗脱组分的极性按标准化顺序递增，通过逐步增加极性溶剂的相对比例实现例如，二乙醚）等非极性溶剂中。在本文中，我们描述了多种提取爬行动物皮肤脂质的方法，随后提供了一种标准操作流程，利用传统柱层析技术根据化合物的极性差异分离不同组分。所得的总脂质提取物或特定组分可进一步用于生物活性测定，以确定其中化合物所引发的生物学效应。

引言

爬行动物在表皮中产生脂类，这些脂类可直接来源于皮肤细胞，或来源于离散的腺体，用于社会交流，如配偶评估与追踪、领域行为以及种内和种间识别。^1,2,3,4这些皮肤脂质的分离在研究化学通讯的进化模式与机制方面具有应用价值，同时也有助于理解脂质在陆地生命进化过程中所起的防水作用。^2,3,4此外，许多爬行动物，尤其是有鳞目动物（蜥蜴、蛇），在敏感生态系统中被视为需要关注的入侵物种，目前正持续开展基于信息素的诱饵研发，以提高捕获和清除效率^5,6爬行动物皮肤的不透性有助于提取其中存在的脂质，从而获得相对纯净的、可能具有较强信号功能的化学物质。所述方案中定量爬行动物皮肤脂质的主要步骤包括提取、总脂质测定和组分分离。 通过 柱层析^1,6,7这些方法已被常规使用，因其能够获得具有生物活性的分离物，有助于深入解释配偶选择与择偶机制，尤其在蛇类中。².

可以使用非极性或极性有机溶剂从活体皮肤、脱落的皮肤或死亡的完整爬行动物体表提取皮肤脂质^1,7,8,9。需要注意的是，保存在乙醇等溶剂中的博物馆标本不适合用于皮肤脂质的提取，只有新鲜或刚冷冻的尸体才应被视为可能的提取来源。皮肤脂质具有惰性，这使其在皮肤表面稳定且易于提取⁷。在爬行动物生态学的信号传递功能中，皮肤脂质信号常被沉积于严酷环境中，但由于其稳定的化学性质，这些信号可在长时间内保持其信息价值^10,11,12。提取过程通常采用非极性溶剂（例如，己烷、苯、甲苯）对样本浸泡数小时，使脂质溶解，随后蒸发溶剂，最终获得可测量质量的脂质提取物^7,8。皮肤脂质在非极性溶剂中具有高度可混溶性，因此可从多种来源中提取出种类广泛的烃类物质。

分馏比提取更为繁琐，但能够将总脂质提取物分离为特定的组分 通过 柱层析，用于其中化合物的纯化及可能的鉴定^1,6,7,8总脂质提取物与基于基质的色谱柱结合，随后分别洗脱各组分（"组分") 按照特定体积依次通过色谱柱，以洗脱脂质混合物中具有相同极性的一系列化合物^6,7,8在脂质色谱中，各组分按照一定的标准顺序随极性溶剂相对含量的增加而依次按极性递增的方向移动。例如，乙醚）在非极性溶剂中的比例（通常以百分比表示：0%、2%、4% 乙醚， 等等。)^6,7,8尽管薄层色谱法（TLC）可用于分离混合物中的脂质，且操作更为简便，但柱色谱法因其采用封闭系统、易于控制、可处理更高浓度的混合物，并能实现多重化以提高效率，因而更受青睐。在本文中，我们描述了多种提取爬行动物皮肤脂质的方法，随后提供了一种基于极性差异，利用传统柱色谱法分离不同化合物组分的标准操作流程。在许多涉及化学信号物质分离的研究项目中，最终目标通常是评估这些化学信号对受体生物所引发的行为或生理变化。因此，可将完整的脂质提取物或特定组分用于生物活性测定，以确定其中化合物所诱发的生物学效应。 关键词：柱色谱法，薄层色谱法，脂质提取，皮肤脂质，爬行动物，化学信号，生物测定，极性分离^1,2,6,7在基础生物学研究中，例如，利用特定组分进行的生物测定可使研究人员确认已分离出信息素的纯化来源，随后便可开展针对目标化合物的鉴定方法。从野生动物管理的角度来看，鉴定化合物可能并非最终目的，而更倾向于在野外直接利用活性组分吸引同种个体进入诱捕装置，或在非原生栖息地中抑制其寻找配偶的行为。^13,14.

方案

所有涉及脊椎动物使用的实验程序均经詹姆斯·麦迪逊大学机构动物照护与使用委员会批准。

1. 提取

1. 蜕皮提取
   1. 收集单只爬行动物约30 cm²的蜕皮，去除可能污染样品的头部和泄殖腔部分。佩戴氯丁橡胶手套，并清除蜕皮上的碎屑。
   2. 用袋子或称量舟皮重后称取蜕皮质量（± 0.01 g）。
      注意：质量精度取决于天平的精度。蜕皮质量是提取皮肤脂质质量的标准化依据（见下文），并与提取的脂质质量显著相关。
   3. 将蜕皮剪成较小的片段（5 cm²），放入带有可密封且耐正己烷的盖子的玻璃容器中（例如，带金属盖的玻璃广口瓶或带聚四氟乙烯（PTFE）内衬盖的实验室烧瓶）。加入足量正己烷，使蜕皮碎片完全浸没。密封容器。
      警告：正己烷易燃，具有呼吸道刺激性，且与多种短期和长期健康危害相关。涉及正己烷的操作必须在通风橱（实验室）或室外进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）（例如，防溅护目镜、氯丁橡胶手套、长袖衣物、包趾鞋）。
   4. 使用铅笔或耐溶剂记号笔标记容器。将容器置于通风橱中，室温下静置过夜或最多24小时。
   5. 使用洁净的金属镊子或夹子取出蜕皮碎片。轻轻摇晃，使残留的正己烷滴回容器中。将皮肤碎片放在纸巾上晾干，然后丢弃。若同时进行多个提取操作，每次处理不同样品之间需清洁镊子/夹子。清洁方法：将镊子/夹子在烧杯中用约50 mL正己烷冲洗。
   6. 若提取物不立即使用，将提取液倾入适当体积的玻璃小瓶中，或用移液器转移，用带PTFE内衬的瓶盖密封，标记后于-20 °C保存。
      警告：由于提取物含有正己烷，应将小瓶存放在防爆冰箱中。
2. 死亡整只动物提取
   1. 记录动物的吻肛长（SVL；单位为厘米）和质量（单位为克）。若需测定单位皮肤表面积的总脂质或信息素产量，使用裁缝用软尺测量最大体周长（单位为厘米）。
   2. 选择一个直径约为动物体长1/3的容器用于提取。将尸体稳固地放置在容器底部，使头部和泄殖腔朝上。加入足量正己烷，以最大程度地浸没身体表面。
      注意：若在提取过程中头部或泄殖腔有任何时间被浸没，应予以记录。
   3. 盖紧盖子，标记容器，并在通风橱中室温下浸泡过夜或最多24小时。
   4. 取出尸体时使用洁净的金属镊子或夹子。让残余正己烷从身体（而非头部或尾部）滴落回容器中，以保留残液。密封容器。
   5. 若提取物不立即使用，将提取液倾出或用移液器转移至适当体积的玻璃小瓶中，用带PTFE内衬的瓶盖密封，标记后于-20 °C保存。

2. 脂质质量测定

注意：提取的脂质质量可通过以下两种方法之一测定：使用玻璃小瓶或使用旋转蒸发仪的圆底烧瓶。

1. 测定提取的脂质质量 通过 玻璃瓶法
   1. 使用一个已称重且大小合适的离心管（7 mL、22 mL、50 mL） 等等。）。将瓶盖和标签计入总质量，或始终称量不带瓶盖和标签的样品瓶（标签上的标记也会增加质量）。将标签贴在烧瓶的颈部，以避免接触水。
      注意：如果研究人员能够使用气体分配系统，可在氮气环境下同时对多个玻璃小瓶进行蒸发，此时玻璃小瓶中的溶剂蒸发效率较高₂ 流
   2. 使用带橡胶球的玻璃移液管，或将电子移液控制器与一次性10 mL玻璃移液管配合使用，将提取物转移至小瓶中。用约3 mL正己烷冲洗容器，并将冲洗液一并转移至小瓶中。
   3. 在温和的 N₂ 气流下蒸发样品₂ 液流。将小瓶倾斜一定角度，以增大溶剂的表面积。随着己烷蒸发，小瓶外壁会形成冷凝液。
      注意：随着己烷挥发，小瓶内壁会形成脂质环，因此需定期轻轻旋转混匀提取物。
   4. 将样品蒸发至干燥，然后重新称重。记录总脂质产量。
      注意：在不同组间进行分析时，应将脂质质量标准化为蜕皮质量（脂质质量［克］除以蜕皮质量［克］× 100，得到蜕皮中脂质质量的百分比）或标准化为动物的体长（SVL）（脂质质量［毫克］除以SVL［厘米］，得到单位长度的脂质质量）。较大的动物会产生更多的脂质，且许多物种存在显著的性二型性，这会在数据中引入显著偏差。
2. 测定提取的脂质质量 通过 旋转蒸发仪
   1. 为加快单个样品的蒸发速度，将提取物转移至已称重的圆底烧瓶中，并使用旋转蒸发仪进行蒸发。
      1. 如果提取物中可见颗粒物，可将滤纸折叠成圆锥形并放入烧瓶颈部，对样品进行过滤；然后将提取物转移至烧瓶中，使其依靠重力自然过滤。待全部提取物转移完毕后，丢弃滤纸。
         注意：在旋转蒸发前转移样品体积（不超过烧瓶容积的约80%）。若提取物在旋转蒸发仪的冷凝管中产生气泡，会导致污染，需清洗冷凝管。若大多数样品出现气泡或“暴沸”现象，可在烧瓶与冷凝管接口之间安装防暴沸陷阱。
   2. 打开旋转蒸发仪和水浴（50 °C，低于溶剂沸点）的电源。开启冷凝器的冷水流。
      注意：旋转蒸发仪的冷凝器需连接循环冷却器或通向排水口的冷水龙头。若冷却水温度低于室温，可调低流速，以冷凝从烧瓶逸出并进入冷凝器的溶剂蒸气。
   3. 打开真空源（水抽真空或真空泵），确保真空压力足以将烧瓶固定在冷凝管的接口上。在连接烧瓶前，先打开冷凝管末端的通气阀。将烧瓶滑入冷凝管接口，关闭通气阀以密封系统，并确保松开烧瓶后其不会从冷凝管上脱落。
   4. 将烧瓶缓慢下放，直至约50%浸入浴液中。以中等速度启动烧瓶旋转。若真空度、转速、冷凝器流速和浴液温度均处于最佳状态，溶剂蒸气将从烧瓶中逸出，在冷凝线圈上冷凝并滴入回收烧瓶。
      1. 如果样品沸腾（例如若出现大量气泡或快速冒泡等暴沸现象，立即降低旋转蒸发仪的真空度和/或转速。如果沸腾持续，关闭烧瓶旋转，关闭真空，将烧瓶从水浴中取出，并释放真空密封。重复步骤 2.2.3 和 2.2.4。
         注意：如果回收瓶中没有溶剂聚集，但提取物明显正在蒸发，则真空度很可能未达到最佳状态，必须重新调整。
   5. 在真空条件下蒸发样品，直至烧瓶中剩余约 2 mL 溶剂（大体积提取物）；若使用预先称重的烧瓶，则蒸发至残留液滴呈珠状，并伴有轻微流动性的状态。 <烧瓶底部可见直径为1 cm的液面。关闭旋转和真空；然后将烧瓶从浴液中取出。
   6. 握住烧瓶颈部，释放真空密封；然后旋转颈部，将其从冷凝器上取下。若使用大体积烧瓶，轻轻摇动烧瓶使冷凝的提取物旋转，以溶解可见的脂质；随后转移溶液 通过 移液至已预先称重的小体积烧瓶中。加入3 mL 己烷冲洗大烧瓶，涡旋混匀后，将液体移入小烧瓶，并再次蒸发（步骤 2.2.3 - 2.2.5）。
   7. 提取液中的液滴将随着己烷的挥发而固化。干燥后，静置至室温。脂质将在烧瓶中形成半透明、白色至黄色的蜡状物（约5分钟）。称量烧瓶以获得最终质量。
      注意：根据所提取脂质的性质，它们可能呈固态（例如，石蜡）或半固体（例如，原油）的性质，尤其是在分馏脂质被蒸发后（见下文）。
3. 将脂质溶解于已记录体积的正己烷中，使每1 mL正己烷中脂质含量≥1 mg。进行层析的上样工作体积约为5 mL。若从烧瓶转移至样品瓶，应在转移大部分提取物后，保留2 mL总体积用于冲洗烧瓶。
4. 标记样品瓶，用聚四氟乙烯衬垫盖密封，并于 -20 °C 保存。

3. 柱层析

注意：为了根据极性将未知化合物分离为特定组分，可将提取的脂质质量加入制备好的液相色谱柱中，并使用标准洗脱方法进行分级分离。

1. 色谱柱的制备
   1. 根据提取物中的脂质质量，选择使用带有聚四氟乙烯旋塞的大体积或小体积玻璃层析柱。该层析柱可配备或熔接一个固定体积的储液罐（大柱为500 mL，小柱为250 mL）。此后，本方案仅以熔接储液罐的大体积层析柱为例进行说明。按照第4节所述方法，彻底清洗所有用于层析的新玻璃器皿及部件，然后用己烷或其他非极性溶剂冲洗。
   2. 将一块玻璃纤维棉（长约14 cm，宽约4 cm）反复折叠，直至形成一个约4 cm × 4 cm的方形。使用一根长度超过层析柱的木制棒将玻璃纤维棉推至层析柱底部。
   3. 将层析柱用两个夹子固定在通风橱内的标准铁架台上（例如，旋转式或模块式），一个位于旋塞上方，另一个位于储液瓶颈部下方。调平层析柱。调节层析柱高度，使500 mL烧杯能方便地置于柱子下方并留有足够的操作空间。打开旋塞。
   4. 将洗涤并干燥后的沙子倒入柱中，直至玻璃纤维上方有约3厘米厚的沙层。在柱下方放置黑色或深色纸张，并轻轻敲击柱体。若每次敲击均有沙子落下，则表明玻璃纤维屏障不足。重复步骤3.1.2至3.1.4。
      注意：使用回形针拉直后固定在木棒末端，从底部取出玻璃纤维。
   5. 将500 mL烧杯置于层析柱下方。从100 mL烧杯或量筒中缓慢倾倒约25 mL正己烷至层析柱储液端，以润湿砂层。当砂层上方正己烷液面高度约为0.5 cm时，关闭活塞。
   6. 称取中性氧化铝。每根小柱使用约 50 g；每根大柱使用约 175 g。将氧化铝倒入 1 L 锥形瓶中。每个 1 L 锥形瓶中氧化铝用量不得超过 400 g。
   7. 为活化氧化铝（活性III），用移液管加入体积等于氧化铝质量6%的去离子水（即，每100克氧化铝加入6毫升水。将水以滴加方式均匀加入氧化铝中。
   8. 用铝箔或软木塞盖住烧瓶。用力旋转摇动（切勿振荡）以均匀分散电荷。持续操作直至无可见结块残留。
      注意：随着水与氧化铝发生反应，烧瓶会变热，此现象属正常。
   9. 加入正己烷，直至完全覆盖氧化铝，并在氧化铝上方保留约0.5 cm的正己烷。轻轻旋摇烧瓶，形成浆液。
   10. 在色谱柱的储液器中放置一个带通气孔的漏斗，并在色谱柱下方放置一个500 mL玻璃烧杯。打开活塞。轻轻摇动氧化铝，然后缓慢将其倒入色谱柱中。确保氧化铝在柱内均匀沉降，且柱中无大气泡或裂纹形成。轻轻敲击柱壁，使氧化铝均匀沉降。
       注意：若需进行额外的淋洗，必须添加额外的正己烷以维持浆状液。若起始时玻璃烧杯洁净，则从层析柱下方烧杯中收集的正己烷可重复使用。
   11. 当氧化铝顶部稳定且位于储液槽底部柱颈下方约4 cm处时，形成色谱柱。用移液管以正己烷冲洗储液槽内壁，以除去残留的氧化铝。使用漏斗，轻轻在氧化铝上方加入第二层砂层，至距储液槽约1 cm处。
       注意：在活塞保持打开状态时，己烷将从柱中流出。切勿让柱子干涸。若柱子干涸，则必须从步骤 3.1.2 重新开始。如果柱子在分级分离前一天已准备好，可在此暂停实验流程。将软木塞牢固地插入储液 reservoir 顶部，或用铝箔 tightly 密封。向储液 reservoir 中加入约 100 mL 己烷。拧紧活塞。
2. 脂质提取物的分级分离
   注意：无论色谱柱大小，脂质提取物的各组分均可根据其极性分别收集并合并，或在不含任何已知/已鉴定目标化合物时完全弃去。可进行多轮重复洗脱（n = 3 个体积）通过层析柱，以确保脂质充分洗脱。随后 表1 用于大柱洗脱（以提取物质量计） >30 mg）或小柱洗脱（提取物质量 <30 mg）。一种专门用于分离甲基酮的定制洗脱方案包含在其中。 表2.
   1. 使用大容量移液管吸除柱顶残留的正己烷，或让正己烷滴入洁净的烧杯中。保持柱顶砂层上方约3 mL正己烷。
      注意：如果收集的己烷仅接触过洁净的玻璃器皿，则为纯净，可回收至第一馏分中。
   2. 使用长玻璃移液管将脂质提取物转移至层析柱中。缓慢移取提取物，避免扰动砂层。用约5 mL正己烷冲洗提取物瓶或烧瓶，并将冲洗液转移至层析柱中。
      注意：如果提取物在 -20 °C 下储存，脂质将发生沉淀。将离心管加热至沉淀完全消失。
   3. 打开活塞，使样品流入柱中。如果提取物质量较大（>30 mg）时，氧化铝中可能在顶部沙层下方出现黄色条带。将流出液收集至废液杯中，因为此部分己烷已不纯净。当沙层上方剩余约3 mL时，关闭活塞。
      注意：提取物中的脂质现已结合到氧化铝及柱上，不可让其干燥，否则样品将丢失。
   4. 在倾倒第一份馏分前，将一个预先称重并标记好的圆底烧瓶（100 mL、250 mL 或 500 mL）置于柱下方。需弃去的馏分可收集于一个共用的玻璃容器中。
   5. 在量筒中配制第一种洗脱液（100% 己烷 : 0% 乙醚 [下文中简称“乙醚”]）。若提前配制洗脱液，需用铝箔覆盖或用软木塞塞紧。
      注意：洗脱组分的极性逐步增加，因此各组分之间无需冲洗色谱柱。
   6. 将第一份馏分通过倾倒加入储液槽中 通过 将带通气孔的玻璃漏斗置于储液槽一侧，避免扰动砂层。打开活塞开始洗脱。当柱顶砂层上方剩余约3 mL己烷时，关闭活塞。
      注意：在单个组分洗脱过程中，切勿在大部分洗脱液尚未收集完毕前关闭活塞以终止洗脱。在不同组分之间，活塞关闭时间不应超过约1小时，因为延迟可能导致洗脱效果和重复性下降。
   7. 重复步骤 3.2.4 至 3.2.6，处理第 2 和第 3 馏分。将馏分收集至适当大小的圆底烧瓶中，确保留有足够顶空以进行旋转蒸发，尤其是当合并馏分时。
   8. 制备第四组分（2%乙醚），加入储液槽中。将下一个烧瓶置于层析柱下方，打开活塞，收集第四组分。制备第五组分，然后根据需要继续操作。
      注意：可以蒸发掉第一部分（或前几部分）馏分 通过 旋转蒸发，同时收集连续的馏分。
   9. 为制备用于气相色谱-质谱分析的组分，使用精度为0.01或0.1 mg的天平称取组分质量。将脂质组分溶解于正己烷中，配制成每1 mL含1 mg脂质的溶液。

4. 清洁

1. 保持活塞打开，将层析柱倒置于废液杯中。氧化铝和砂子会从柱中流出；也可轻轻摇动以加快过程。若玻璃纤维棉卡住，可用玻璃棒将其取出（避免刮伤玻璃），或用氮气吹出。₂ 流
2. 拆解并清洗所有玻璃器皿，使用塑料容器中的热水和实验室级洗涤剂，配合玻璃器皿刷（刷毛为动物毛或塑料材质）进行刷洗，清洗三次。用大量温水充分冲洗，直至玻璃器皿表面不再有滑腻感。
3. 冲洗 用去离子水将玻璃器皿和工具清洗3次，然后将其放置在支架上自然晾干。为加快干燥速度，可向玻璃器皿中加入少量丙酮（3 mL），旋转润洗后静置晾干，或在氮气流下吹干。₂ 流

结果

提取后，总脂质质量是可通过本方案获得的第一类数据。然而，总脂质质量数值在分析时必须经过标准化处理，否则不应直接使用。有多种标准化方法可供选择，但我们建议将提取的脂质质量标准化为动物的SVL（以厘米计）或所提取蜕皮的质量。前者得到单位长度的脂质质量值，后者则表示为来源组织质量的比例。标准化的原因在于，体型较大的动物由于具有更大的皮肤表面积，天然会产生更多的皮肤脂质。图1A 展示了这种关联性：提取的皮肤脂质质量与所提取蜕皮的质量呈线性关系。一旦将脂质质量标准化为蜕皮总质量，这种线性关系便完全消失（图1B）。

分级分离后，可对各组分的质量采用相同的标准化方法（图2）。在此样本数据集中，各个组分对总提取脂质质量的贡献并不相等：中性脂质（第1–3组分）在质量比例上占主导地位，相较于各极性较强的脂质组分（第4–6、7–9和10–12组分）更为显著。

图1：提取的脂质质量与输入材料之间的关系。（A）在爬行动物中，总脱落皮肤质量与提取的皮肤脂质质量呈正相关（P < 0.001）。（B）当提取的皮肤脂质质量被标准化为总脱落质量（脂质质量除以脱落质量）时，这种关系不再存在（P = 0.46）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：洗脱后各组分的标准化质量。通过柱层析法，可根据化合物极性将皮肤脂质提取物洗脱为不同组分。随后将各组分质量表示为总脂质提取物的比例（组分质量 [单位为毫克] 除以总脂质提取物质量 [单位为毫克]），以确定不同组分或实验组之间的差异⁸。柱状图表示均值，上方误差线为标准误（SEM），下方误差线为95%置信区间（CI）。为便于清晰展示，提供了各个数据点。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：甲基酮组分的代表性气相色谱图。（A）在适当洗脱条件下，甲基酮是表 2中第 7 馏分中最丰富的化合物，表现为成对的峰（保留时间为 24–34 分钟）。（B）然而，表 2中的第 6 馏分仅产生非目标化合物。当流动相中使用的极性溶剂过期，或色谱柱在馏分收集期间长时间停止（>1 小时）时，也可能出现相同结果。请注意两条色谱图中分子丰度的差异。请点击此处查看该图的放大版本。

组分	正己烷 (mL)	乙醚 (mL)
1,2,3	100 [30]	0 [0]
4,5,6	98 [29.4]	2 [0.6]
7,8,9	96 [28.8]	4 [1.2]
10,11,12	92 [27.6]	8 [2.4]
13,14,15	84 [25.2]	16 [4.8]

表1：皮肤脂质分离的标准洗脱体积。 使用氧化铝（活性III级）时，分别提供大体积（例如，250 mL）和小体积（例如，100 mL）层析柱的溶剂体积及比例。正己烷为载体溶剂，乙醚为流动相。

组分	正己烷 (mL)	乙醚 (mL)	备注
1, 2, 3	30	0	洗脱；不收集
4, 5	28.8	1.2	洗脱；不收集
6, 7, 8	28.8	1.2	分别收集；甲基酮的主要组分将出现在第7组；应对第6组和第8组进行气相色谱-质谱（GC-MS）质量控制检测，以确保酮类化合物的正确洗脱

表2：草蛇甲基酮的改良洗脱方案。 这些体积适用于小容量层析柱以及目前市售品牌的氧化铝。在野外试验中，对野生求偶雄性束带蛇具有强生物活性的洗脱组分呈甲基酮阳性。^1,7为确认目标组分中甲基酮的存在，可将样品稀释至1 mg/mL后进行分析 通过 GC-MS 图3 提供洗脱后阳性与阴性结果的代表性色谱图。

讨论

爬行动物皮肤脂质的提取可应用于活体或死亡个体的皮肤，也可用于蜕下的皮肤，这使得该技术在实验应用中具有较高的灵活性。此外，皮肤脂质的提取可在野外进行，从而使该方法能够动态地应用于广泛的生物学研究领域^2,13。皮肤脂质提取操作简便，因此可根据实验需求或设计轻松扩大提取规模，且操作人员无需具备高深的专业技术即可实施该方法。扩大规模的唯一限制因素是通风橱空间的可用性、足量洁净且可密封的玻璃器皿以及溶剂储存空间。

皮肤脂质提取物的分级分离可根据研究人员的需求进行调整，因此与脂质提取一样具有类似的灵活性。例如，可以洗脱并弃除中性脂质，从而获得目标组分，以纯化感兴趣的化合物或简化生物测定。分级分离可在单个或多个脂质样品中以不同规模进行。例如，可同时运行多个色谱柱以提高处理效率；或者仅将总脂质提取物的一部分在小型色谱柱上进行分级，从而节省试剂和时间。分级分离的主要限制因素在于总脂质提取物的质量以及研究人员所用设备的精确度。例如，若研究人员使用的天平精度为10.0 mg，则将显著甚至完全影响组分质量的测定，进而影响后续GC-MS分析的样品制备准确性。玻璃器皿的情况亦是如此。若研究人员使用大体积色谱柱进行分离，但待分离的总脂质量较少，则化合物的洗脱或分离仍可进行，但会显著浪费溶剂、试剂、时间，并可能损失目标化合物本身。

建议在确定洗脱方案（如表2所示）之前进行质量控制检查，并决定哪些组分可以弃去。为了确认目标脂质的洗脱情况，可进行一次层析实验，分别收集第1至第15组分，然后通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行分析。在图3中，典型的气相色谱图显示，来自麻斑林蛇的甲基酮仅在特定组分中从层析柱中洗脱出来。通过执行此质量控制步骤，可针对特定物种建立优化的洗脱方案，以确保目标化合物的最大得率。材料的任何变化，例如氧化铝的供应商或批次，或乙醚的存放时间，均会显著影响洗脱行为，因此必须通过质量控制实验对这些因素进行校正和控制。

所述技术主要受限于可获取的化学信号物质的化学性质。这些方法基本上仅允许研究人员从爬行动物皮肤中分离和提取长链脂类。许多爬行动物物种利用空气传播和/或蛋白质类物质作为化学信号，而上述方法无法用于分离此类信号物质。此外，非极性溶剂无法从爬行动物体表或信号沉积来源表面提取水溶性信号物质例如、笼具水、粪便、水生基质）等可能含有丰富化学信号的物质。研究人员已有适当的方法来捕获此类化学线索。例如固相微萃取（SPME）用于挥发性信号物质，高效液相色谱（HPLC）用于水溶性信号物质，但与上述方法类似，均存在一定的技术学习曲线。

最重要的是，研究人员应根据最终化学混合物的用途来选择所采用的方法。例如，如果研究人员希望了解一只雄性目标动物是否能够区分由其他雄性个体产生的线索 与 在针对同种雌性的靶向生物测定中，提取是唯一需要的方法^2,3然而，如果目标是鉴定具有性二型性的化合物，则应对提取物进行纯化，以更有把握地将鉴定结果归因于特定分子或分子类别。 通过 化学分析^1,6,9,11然而，即使使用脂质来源进行色谱分析，也需要相当质量的起始提取物，以获得可测量的组分质量；否则可采用样品合并的方法，但并非最佳选择¹⁴.

该方案的未来发展方向包括采取措施将其应用于更多爬行动物物种，并对流程进行适应性改进。此外，目前也正在开发其他非侵入性皮肤脂质提取方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无粉氯丁橡胶手套	Microflex	NEC-288	参见 "1.1 脱落细胞提取装置设置" （步骤 1.1.2） "手套")
Ohaus Adventurer 精密天平	Ohaus	AX622	参见 "1.1 脱落细胞提取装置设置" （步骤 1.1.3 "天平")
Freund 容器 球形 16盎司 梅森罐 &和 盖子	球	NC9661590	参见 "1.1 脱落细胞提取装置设置" （步骤 1.1.5 "梅森罐")
己烷，异构体混合物	Sigma-Aldrich	650544	参见 "1.1 脱落物提取装置设置" （步骤 1.1.6 "己烷")
高低温标记温度胶带	电子显微镜科学公司	5029927	参见 "1.1 脱落细胞提取装置设置" （步骤 1.1.8） "胶带")
单颈圆底烧瓶，容量 500 mL	Sigma-Aldrich	Z414514	参见 "2. 提取" （步骤 2.1.2.4 "500 mL")
单颈圆底烧瓶，容量 100 mL	Sigma-Aldrich	Z414492	参见 "3.2 组分分离" （步骤 3.2.4） "100 mL")
锥形瓶支撑环	Sigma-Aldrich	Z512419	参见 "2. 提取" （步骤 2.1.2.1） "软木支撑环")
Accu-jet Pro 移液器控制器	Sigma-Aldrich	Z671533	参见 "2. 提取" （步骤 2.1.1.3 "电动移液器控制器")
一次性独立包装玻璃刻度吸管，10 mL	Pyrex	13-666-7E	参见 "2. 提取" （步骤 2.1.1.3 "10 mL 移液管")
Rotavapor R II	Buchi	2422A0	参见 "2. 提取" （步骤 2.1.2.1 "旋转蒸发仪")
椭圆凸起捕获器	Chemglass生命科学	501215241	参见 "2. 提取" （步骤 2.1.2.1 "碰撞陷阱")
7 mL 小瓶，螺旋盖，透明玻璃	Supelco	27151	参见 "1.1 脱落细胞提取装置设置" （步骤 1.1.11 "7 mL 小瓶")
7 mL 玻璃瓶螺旋盖，实心顶盖，带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫	Supelco	27152	参见 "1.1 脱落物提取装置设置" （步骤 1.1.11 "帽")
22 mL 小瓶，螺旋盖，透明玻璃	Supelco	27173	参见 "1.1 脱落细胞提取装置设置" （步骤 1.1.11 "22 mL 小瓶")
22 mL 小瓶螺旋盖，实心顶部带聚四氟乙烯衬垫	Supelco	27174-U	参见 "1.1 坩埚提取装置设置" （步骤 1.1.11 "帽")
Excellence XS 分析天平	梅特勒-托利多	XS205DU	参见 "2. 提取" （步骤 2.1.2.1 "天平")
5 3/4" 一次性玻璃移液管	Fisherbrand	NC0418555	参见 "1.1 脱落细胞提取装置设置" （步骤 1.1.11 "移液器")
带有聚四氟乙烯活塞组件的层析柱	金布尔-蔡斯	17810-19300	参见 "3.1 准备层析柱" （步骤 3.1.1） "小型玻璃柱")
铸铁L形底座支撑架	菲舍尔布兰德	11474207	参见 "3.1 准备层析柱" （步骤 3.1.1） "支撑架")
三叉双调节镀镍锌夹	特罗姆纳	2300203	参见 "3.1 准备层析柱" （步骤 3.1.1） "钳子")
常规夹具 holder	菲舍尔布兰德	05754Q	参见 "3.1 准备层析柱" （步骤 3.1.1） "夹持器 holder")
砂，经洗涤并干燥	Macron Fine Chemical	MK-7062-212	参见 "3.1 准备层析柱" （步骤 3.1.5） "沙")
氧化铝，中性	Sorbtech	15740-5	参见 "3.1 准备层析柱" （步骤 3.1.7） "氧化铝"）；美国境内唯一已知的生产商
窄颈重型玻璃锥形瓶，1000 mL	Pyrex	4980-1L	参见 "3.1 准备层析柱" （步骤 3.1.6） "锥形瓶")
单颈圆底烧瓶，容量 250 mL	Sigma-Aldrich	Z100684	参见 "3.1 准备层析柱" （步骤 3.2.4） "250 mL 圆底烧瓶")
带溶剂储液罐的校准色谱柱	Sigma-Aldrich	Z560553	参见 "3.2 准备层析柱" （步骤 3.2.1） "大型玻璃柱")
无水乙醚	Fisher Chemical	E138500	参见 "3.2 组分分离" （步骤 3.2.5） "乙醚")
Alconox 清洁剂	Sigma-Aldrich	242985	参见 "4. 清洁" （步骤 4.2） "Alconox")
丙酮（ACS认证）	Fisher Chemical	A18P-4	参见 "4. 清洁" （步骤 4.4） "丙酮")