方法文章

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

DOI：

10.3791/59035

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2019年1月7日

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1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2Department of Soil, Water and Environmental Science, University of Arizona, 3Department of Earth Ocean and Atmospheric Sciences, Florida State University, 4Bruker Daltonics Inc., 5Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。

摘要

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天然有机质（NOM）由数千种有机化合物组成的高度复杂混合物，历史上难以对其进行表征。然而，为了理解由NOM分解所导致的温室气体（二氧化碳[CO2]和甲烷[CH4]）生成的热力学和动力学控制机制，必须结合分子水平的表征与微生物蛋白质组分析。此外，气候与环境变化预计将扰动自然生态系统，可能破坏影响有机质底物供应以及执行转化过程的微生物之间复杂的相互作用。要预测环境变化影响的方向和程度，必须对有机质进行详细的分子表征，开展微生物蛋白质组学研究，并明确有机质分解的途径与转化过程。本文描述了一种方法流程，可通过直接进样傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）、核磁共振（NMR）波谱、液相色谱-质谱（LC-MS）以及蛋白质组分析，在单个样品中实现全面的代谢物表征。该方法可获得完全配对的数据集，从而提高推断有机质分解路径、相应CO2和CH4生成速率及其对环境扰动响应的统计置信度。本文展示了将该方法应用于从泥炭地采集的NOM样品的结果；但该方案适用于任何NOM样品（e.g., 泥炭、森林土壤、海洋沉积物、etc.）。

引言

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全球范围内，湿地估计含有529 Pg的碳（C），主要以有机碳的形式埋藏于泥炭沉积物中1目前，这类泥炭地作为净碳汇，每年封存29 Tg C-1 仅在北美地区1然而，环境扰动（如排水、火灾、干旱和温度升高）会通过加速有机质分解，导致碳损失增加，从而抵消这一碳汇效应。 通过 温室气体（二氧化碳 [CO2] 和甲烷 [CH4]) 的生成1,2气候变化可能导致碳流失，如果温度升高或气候变干会促进微生物对碳的分解速率。或者，温度升高和大气CO₂浓度增加可能通过增强植物生长而增加碳输入，从而部分抵消碳分解的增加。2 浓度可能促进初级生产，从而固定更多的CO2 为有机碳（OC）。该有机碳被分解为CO的程度和速率如何2 和 CH4 取决于电子供体底物、电子受体的可利用性以及介导转化过程的微生物之间的复杂相互作用。在许多情况下，这些机制尚未被充分表征，因此它们对环境扰动的响应尚不明确，气候变化对泥炭地生态系统碳平衡的最终影响仍不清楚。

天然有机质（NOM）结构复杂，使得历史上即使要鉴定其混合物中存在的有机化合物也极为....

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方案

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1. 从土壤、沉积物或泥炭中连续提取有机质

  1. 采集土壤、沉积物或泥炭 通过 钻取岩芯并根据待检验的假设对岩芯进行分割（例如，深度）。将样品储存于聚四氟乙烯涂层容器中，并于 -80 ℃ 冷冻保存 °分析前于 C 保存。
    注意：本方案需要约 25 mg 碳。对于泥炭（通常含碳 45%），需使用 50 mg 干燥泥炭。对于有机质含量较低的样品（如矿质土或林地高地土壤），根据碳含量不同，可能需要更多样品量（最多达 5 g）。由于有机溶剂提取会将任何聚乙二醇（PEG）带入提取物中，从而在步骤 2.4 中对离子化产生不利影响，因此在样品采集、储存和提取过程中的任何环节都应避免样品接触塑料材料。
  2. 当准备分析样品时，将样品冷冻干燥至恒重，然后使用不锈钢研磨球在高速球磨机中研磨样品，以实现均质化并打破任何聚集体。
    注意：本实验步骤可在此处暂停，材料可于 -80 ℃ 保存 °C.
  3. 使用经乙醇清洗过的不锈钢工具，将每份干燥样品各50 mg分装至各自的2 mL玻璃小瓶中。这些样品将依次使用一系列溶剂进行提取，以从每个样品中连续提取极性逐渐降低的代谢物。加入1 mL蒸馏并脱气的水（H₂O），涡旋振荡10分钟，然后在4 °C、15,000 × g条件下离心15分钟。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，保存于-80 °C，用于后续的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。向剩余的沉淀中加入1 mL甲醇（MeOH），涡旋....

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结果

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我们执行了所述的互补性分析方案，比较了美国明尼苏达州Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments（SPRUCE）试验点S1泥炭沼泽中不同深度的泥炭特征。这些结果与瑞典北部永久冻土泥炭沼泽和泥炭湿地的数据进行对比，以展示不同地点在代谢物和酶活性方面的差异。在蛋白质组学分析中，我们鉴定了3,312种酶。对酶活性随深度变化的分析显示，在SPRUCE沼泽中，酶的数量在15 cm至45 cm深度之间急剧下降（图1）。

尽管蛋白质组学结果指出了哪些蛋白质被表达，代谢组数据则揭示了实际发生的反应。总体而言，我们通过傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）分析的联合应用，在所有泥炭样品中鉴定出67,040种代谢物（包括脂类）。其中，我们能够为15,385种化合物确定分子式（图2）。整合后的代谢组数据涵盖了广泛的氧化态、分子质量.......

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讨论

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用于表征代谢物和蛋白质组的单一流通、完全偶联分析流程，可揭示复杂生态系统中碳循环发生的途径。土壤和泥炭是具有异质性的基质，因此该方法的关键步骤之一是在最初阶段确保起始的泥炭或土壤材料高度均一。最好充分研磨样品，因为团聚体可能降低提取效率。对于团聚性土壤以及碳含量低、矿物含量高的土壤，这一问题尤为突出，可能需要使用不锈钢球磨机进行充分均质化。由于实验区域内土壤和泥炭的空间异质性可能较高，强烈建议设置生物学重复。

该方法使用三种溶剂：水、甲醇和氯仿，这些溶剂会影响可提取化合物的类型。原则上，这种顺序提取法应能溶解极性范围较广的化合物。然而，这些溶剂并未针对有机-矿物复合物或高度稳定的复合物的提取进行优化。如果需要提取此类化合物，更强烈的溶剂（如强酸和强碱）更为合适，但更剧烈的提取过程可能会改变样品的化学性质。在提取流程的最后阶段引入此类溶剂，可能有助于最小化这种影响。此外，氯仿可通过溶解细胞膜脂质，使临床上重要的土壤和泥炭中的细菌、病毒病原体以及其他致病性生物因子失活。因此，在提取方案中加入氯仿可降低研究可能携带来自世界各地病原体的样本时所涉及的风险。如果对提取后残留的死亡微生物细胞、.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢 J.P. Chanton、J.E. Kostka 和 M.M. Kolton 在采集泥炭样品过程中提供的帮助。本研究的部分工作在美国能源部科学办公室下属的环境分子科学实验室（Environmental Molecular Sciences Laboratory）完成，该实验室由生物与环境研究办公室资助，属于科学办公室用户设施。太平洋西北国家实验室（PNNL）由巴特尔公司（Battelle）根据合同号 DE-AC05-76RL01830 为美国能源部运营。本研究得到了美国能源部科学办公室和生物与环境研究办公室的资助（项目编号：DE-AC05-00OR22725、DE-SC0004632、DESC0010580、DE-SC0012088 和 DE-SC0014416）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸甲氧基胺Sigma Aldrich226904衍生化试剂
5 mm 三共振耐盐低温探头 Bruker仪器设备
毛细管气相色谱柱 HP-5MS 柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）AgilentAG19091S-433仪器设备
反相带电荷表面杂化柱（3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm 粒径）ThermoFisher仪器设备
2 mL 玻璃小瓶VWR International46610-722样品瓶
自动进样瓶VWR International97055-324; 9467671样品瓶
氯仿VWR InternationalJT9174-3溶剂
乙醇VWR InternationalBDH67002.400溶剂
甲醇VWR InternationalBDH85681.400溶剂
吡啶VWR InternationalBDH67007.400溶剂
2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸-d6Sigma Aldrich178837标准品
C8-C24 脂肪酸甲酯Sigma AldrichCRM18918标准品
N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺Sigma Aldrich24589-78-4标准品
苏万尼河富里酸标准品国际腐殖酸学会2S101F标准品
三甲基氯硅烷Sigma Aldrich89595标准品
调谐溶液Agilent
FTICR-MS 分析软件BrukerCompass DataAnalysis 4.1
Formularity 软件太平洋西北国家实验室Formularity可于以下网址下载：https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MSAgilentAgilent GC 7890A 配 MSD 5975C
基于二氧化硅的固相萃取吸附剂Phenomenex (Torrance, CA)Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR 管 3 mm 8 150 CS5VWR InternationalKT897820-0008NMR 管
Varian Direct Drive 600-MHz NMR 波谱仪 Varian InovaVarian Direct Drive 600-MHzNMR 波谱仪
Chenomx NMR Suite 8.3ChenomxChenomx NMR SuiteNMR 软件
超高效液相色谱仪 watersAquity UPLC H 液相色谱仪 
Velos-ETD Orbitrap 质谱仪 ThermoFisherThermo Scientific LTQ Orbitrap Velos质谱仪 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone per....

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FTICR MS GC MS NMR LC MS MPLEx

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