Method Article

用于表征复杂天然有机物混合物的单吞吐量互补高分辨率分析技术

DOI:

10.3791/59035

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January 7th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2Department of Soil, Water and Environmental Science, University of Arizona, 3Department of Earth Ocean and Atmospheric Sciences, Florida State University, 4Bruker Daltonics Inc., 5Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了互补分析和组学技术的单一吞吐量, 最终形成了不同生态系统中天然有机物和微生物蛋白质组学的完全配对特征。这种方法可以进行强有力的比较, 以确定代谢途径和转化, 这对于描述温室气体的产生和预测对环境变化的反应十分重要。

Abstract

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天然有机物 (nom) 是由数千种有机化合物组成的高度复杂的混合物, 历史上证明很难表征。然而, 为了了解由 nom 分解而产生的温室气体 (二氧化碳 [co2] 和甲烷 [ch4]) 生产的热力学和动力学控制, 该分子水平的特性与微生物结合在一起蛋白质组分析是必要的。此外, 气候和环境变化预计将扰乱自然生态系统, 有可能破坏复杂的相互作用, 影响有机物质底物的供应和进行转变的微生物。要预测环境变化影响的方向和大小, 就必须对有机物、微生物蛋白质组学以及有机物分解的途径和转化进行详细的分子描述。本文介绍了通过直接注射傅里叶变换离子回旋共振质谱法 (fticr-ms)、气相色谱质谱 (gc-ms) 对单个样品进行综合代谢物表征的方法学吞吐量,核磁共振 (nmr) 光谱、液相色谱质谱 (lc-ms) 和蛋白质组学分析。这种方法产生了一个完全配对的数据集, 提高了推断有机物分解路径、由此产生的 co2 和 ch4 产率及其对环境扰动的反应的统计信心。在此基础上, 我们提出了将该方法应用于从泥炭地采集的 nom 样本的结果;但是, 该协议适用于任何 nom 样品 (例如泥炭、森林土壤、海洋沉积物等)。

Introduction

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在全球范围内, 湿地估计含有 529 pg 的碳 (c), 主要是埋在泥炭矿床1中的有机 c。目前, 这类泥炭地起到了净 c 汇的作用, 仅在北美就有 29 tg c-1。然而, 排水、火灾、干旱和温度升高等环境干扰可以通过增加有机物分解来抵消这种 c 汇,从而通过温室气体 (二氧化碳 [co2] 和甲烷 [ch4]) 生产1,2。如果温度升高或干燥机条件刺激微生物更快地分解 c, 气候变化可能会导致 c 损失。另外, 较高的温度和空气二氧化碳浓度可能会刺激初级生产, 以将更多的 co2 作为有机碳 (oc) 来固存.然后将 oc 分解为 co2 和 ch4 的程度和速度取决于电子供体基板、电子受体的可用性以及介导转型。在许多情况下, 这些机制的特点并不好, 因此它们对环境扰动的反应没有得到很好的限制, 气候变化对泥炭地生态系统碳平衡的净结果仍然不清楚。

天然有机物 (nom) 的复杂性使得即使是识别 nom 混合物中存在的有机化合物也变得困难。最近的进展大大提高了我们对传统上被视为顽抗的腐殖质或....

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Protocol

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1. 从土壤、沉积物或泥炭中顺序提取有机物

  1. 通过取心收集土壤、沉积物或泥炭, 并根据所测试的假设 (例如深度) 划分岩心。将样品存放在聚四氟乙烯涂层容器中, 并在分析前冻结在-80°c 进行储存。
    注: 此协议需要大约25毫克 c。对于泥炭 (通常为 45% c), 需要50毫克的干泥炭。根据 c 含量 (高达5克) 的不同, 矿物或森林高地土壤等低有机样品可能需要更多的样品。由于用有机溶剂萃取任何聚乙二醇 (peg) 会将其拉入提取物中, 这将在步骤2.4 期间对电离产生负面影响, 因此在收集、储存或采集过程中, 必须避免让样品在任何时候接触塑料。提取。
  2. 当准备分析样品时, 将其冷冻干燥到恒定重量, 然后在高速球磨机中使用不锈钢磨球研磨样品, 使其均匀化并分解任何集料。
    注: 此时可以暂停协议, 并且材料存储在-80°c。
  3. 使用乙醇清洗不锈钢器具, 每个干燥样品的脂肪50毫克, 进入单独的2毫升玻璃瓶。这些样品将使用一系列溶剂按顺序提取, 以便从每个样品中连续提取越来越多的非极性代谢物。在每个样品中加入1毫升的蒸馏水 (h2o), 盖上小瓶, 在振动台上摇摇2小时。
  4. 晃动后, 溶液可以在室温 (rt) 下站立 20分钟, 然后在 15, 000 x 克离心 30分钟, 并从每个上清液中保存。
    注: 这些溶液将通过直接注射注入到 fticr-ms 中。
  5. 对现....

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Results

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我们执行了所述的互补分析协议, 并在美国明尼苏达州的云杉和泥炭地响应 (spring) 现场的 s1 沼泽中进行了泥炭与深度的比较。这些结果与瑞典北部的永久冻土沼泽沼泽和芬的结果进行了比较, 以显示位点在代谢物和酶活性方面的差异。我们在蛋白质组学分析中发现了3312酶。对酶活性的深度分析表明, 在 spring 沼泽中, 酶的数量在15厘米至45厘米之间急剧下降 (图 1)。

虽然蛋白质组学的结果表明哪些蛋白质被表达, 但代谢数据显示哪些反应实际上正在发生。总体而言, 我们从 fticr-ms、nmr、gc-ms 和 lc-ms 分析的组合中, 确定了所有泥炭样品中的 67 040 代谢物 (包括脂质)。其中, 我们能够为 15, 385 种化合物分配分子式 (图 2)。综合代谢数据跨越一系列氧化状态、质量和复合类。

这通常是可视化的通过使用 van kreveen 图, 其中已确定的公式的原子 hc比比绘制.......

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Discussion

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用于表征代谢物和蛋白质组的单吞吐量、全耦合分析流提供了对 c 循环在复杂生态系统中发生的途径的洞察。土壤和泥炭是异质矩阵, 因此, 这种方法的关键步骤之一发生在最早的步骤, 以确保启动泥炭或土壤材料是高度均匀的。最好是研磨样品和聚集体可以降低提取效率。对于 c 含量低、矿物含量高的聚集土壤和土壤来说, 这是一个特别的问题, 可能需要使用不锈钢球磨床进行充分的均质化。由于实验地点内土壤和泥炭的空间异质性可能很高, 因此强烈建议进行生物复制。

这种方法利用三种溶剂: 水、甲醇和氯仿, 它们会影响可能提取的化合物的类型。原则上, 这种顺序萃取方法应将覆盖广泛极性范围的化合物溶解。然而, 这些溶剂并没有优化用于提取有机矿物配合物或高度稳定的配合物。如果这些化合物是感兴趣的, 更苛刻的溶剂, 如强酸和碱是首选, 但更苛刻的提取过程可能会改变样品的化学。在提取序列结束时加入此类溶剂可能会最大限度地减少这种影响。此外, 氯仿还会通过溶解细胞膜脂质来激活临床上重要的土壤和泥炭细菌和病毒病原体, 以及其他致病生物制剂。因此, 将氯仿纳入提取协议将减少对来自世界不同地区的病原体可能感染的样本进行生物学.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们要感谢 j. p. chanton、j. e. kostka 和 m. m. kulton 协助收集泥炭样品。这项工作的一部分是在生物和环境研究办公室赞助的 doe 科学办公室用户设施----环境分子科学实验室进行的。pnnl 由 battelle 根据 de-ac05-76r01830 合同为指定经营实体运营。这项工作得到了美国能源部、科学办公室和生物与环境研究办公室的支持 (赠款: de-ac05-00or22725、de-sc0004632、desc0010580、de-sc0012088 和 de-sc0014416)。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
盐酸甲氧基胺Sigma Aldrich226904衍生剂
5 mm 三共振耐盐冷探头 仪器毛
细管气相色谱柱 HP-5MS 色谱柱（30 m & 次; 0.25 mm & 次; 0.25 &μ;m）AgilentAG19091S-433仪器反
相带电表面杂化柱（3.0 mm & 次;150 mm &次; 1.7 &μ;m 粒径）ThermoFisher仪器
2 mL 玻璃样品瓶VWR International46610-722样品瓶
自动进样器样品瓶VWR International97055-324;9467671样品瓶
氯仿VWR InternationalJT9174-3溶剂
乙醇VWR InternationalBDH67002.400溶剂
甲醇VWR InternationalBDH85681.400
吡啶VWR InternationalBDH67007.400
2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸盐-d6Sigma Aldrich178837标准
C8-C24 脂肪酸 甲酯Sigma AldrichCRM18918标准品
N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺Sigma Aldrich24589-78-4标准
Suwanee River Fulvic Acid 标准品国际腐殖质物质学会2S101F标准
品 三甲基氯硅烷Sigma Aldrich89595标准
品 调谐液安捷伦
FTICR-MS 分析软件BrukerCompass DataAnalysis 4.1
Formularity 软件太平洋西北国家实验室Formularity可从以下网址下载： https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS安捷伦 GC 7890A 与 MSD 5975C
硅基吸附剂Phenomenex （Torrance， CA）Strata C18-E （PN 8E-S001-DAK）
NMR 管 3MM 8 150 CS5VWR InternationalKT897820-0008NMR 管
瓦里安直驱 600 MHz 核磁共振波谱仪 Varian InovaVarian 直驱式 600 MHzNMR 波谱仪
Chenomx NMR Suite 8.3ChenomxChenomx NMR SuiteNMR 软件
超高效液相色谱仪 watersAquity UPLC H 液相色谱仪 
Velos-ETD Orbitrap 质谱仪 ThermoFisherThermo Scientific LTQ Orbitrap Velos质谱仪 
布鲁克溶剂 溶剂 品 品

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone per....

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