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方法文章

利用一种通用的生化方法鉴定新型CK2激酶底物

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DOI：

10.3791/59037

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2019年2月21日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine

本文内容

摘要

本实验方案的目的是对来自复杂生物样品（如细胞裂解液或组织匀浆）中的蛋白激酶CK2底物进行标记、富集和鉴定。该方法利用了CK2生物学特性的独特之处来实现这一目标。

摘要

研究激酶与其底物之间的关系对于全面理解这些酶在生理和病理状态下的功能及其下游靶点至关重要。CK2是一种在进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，其已知底物数量不断增加，已达数百种，参与多种细胞过程。由于CK2具有多效性，识别并表征一组全面的CK2底物一直极具挑战性，也是当前研究这一重要激酶的主要障碍。为应对这一挑战，我们设计了一种多功能实验策略，可实现对潜在CK2底物的靶向富集与鉴定。该方案利用CK2独特的双重共底物特异性，使其能够在细胞或组织裂解液中特异性地对底物进行硫代磷酸化修饰。随后，这些底物蛋白经过烷基化、免疫沉淀，并通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行鉴定。我们此前已成功应用该方法从黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中鉴定出CK2底物，本文中进一步将该方案拓展至人胶质母细胞瘤细胞，展示了该方法在多种模式生物和实验体系中研究该激酶生物学功能的广泛适用性。

引言

蛋白激酶是信号转导级联反应中的关键组分。这些酶对底物蛋白的磷酸化可引发生物学反应，调控细胞分裂、代谢、分化等重要生命过程。CK2是一种普遍表达的嗜酸性丝氨酸/苏氨酸激酶，在从酵母到人类的物种中均保守，参与多种细胞过程，包括转录调控、细胞周期进程以及凋亡1,2,3。该酶是由两个催化性α（或α'）亚基和两个调节性β亚基组成的异源四聚体4。除了具有高度多效性外，CK2还表现出另外两个异常特性，使其研究变得复杂，即组成型活性5和双辅底物特异性6。后一特性使CK2能够利用ATP和GTP作为磷酸化底物蛋白的磷酸供体。

在小鼠中敲除CK2的催化亚基或调节亚基会导致胚胎致死，表明其在发育和器官形成过程中发挥着至关重要的作用7,8。CK2在多种癌症中也存在过表达，因此被视为一个有前景的治疗靶点9,10,11。事实上，目前已有针对CK2激酶活性的特异性抑制剂正在研究中12,13,14。尽管抑制CK2是一种可行的策略，但考虑到其多效性，另一种或许更为合理的方法是靶向那些介导特定癌症进展的关键CK2底物蛋白。因此，系统性地鉴定和表征CK2底物蛋白将有助于阐明该激酶在特定组织或肿瘤类型中的具体功能。

在此，我们描述一种通用的生化方法，用于从复杂的生物样品（如细胞或组织裂解液）中鉴定CK2底物。该方案利用CK2对双共底物的特异性，使用GTP类似物GTPγS（鸟苷5'-[γ-硫代]三磷酸），而其他内源性激酶无法利用该类似物。这有效地使激酶能够 "标签" 该样品中其底物的后续分离与鉴定。

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方案

注意：确保所需材料已准备齐全并经过适当处理（参见材料表）。

1. 准备

  1. 机械裂解组织样本（1-2 mg 组织加入 100 µL 裂解缓冲液，表 1）或培养细胞（一个 10 cm 培养皿，汇合度为 80-90%，加入 350 µL 裂解缓冲液），目标是为实验收集总共 900 µL 样本。注意，此体积略高于下述实验所需量。
  2. 在 4 °C 条件下，以 17,500 × g 离心 3 分钟，使样品沉淀。离心完成后，将上清液各 270 µL 转移至三个新的 1.7 mL 微量离心管中。每管中约剩余 90 µL。从中取出 40 µL 作为“输入对照”并置于新管中。将所有样品置于冰上。

2. 激酶活性检测：硫代磷酸化与烷基化

  1. 将三个各装有 270 µL 液体的离心管分别标记为：“kinase rxn”、“GTPγS only”和“PNBM (p-nitrobezyl mesylate) only”。准备激酶反应。
    1. 向“kinase rxn”管中加入 2.7 µL（相当于 1,350 U）的 CK2，然后加入 2.7 µL 的 2.5 mM GTPγS。
    2. 向“GTPγS only”管中加入 2.7 µL 的 2.5 mM GTPγS，然后加入 2.7 µL 裂解缓冲液。
    3. 向“PNBM only”管中加入 5.4 µL 裂解缓冲液。轻轻弹击所有离心管以混匀，随后立即置于冰上。
  2. 将三个离心管在 30 °C 水浴中孵育 1 分钟。孵育结束后，向三个管中各加入 13.5 µL 的 12 mg/mL PNBM。颠倒混匀样品。将这些样品在室温下孵育 1 小时。
  3. 在步骤 2.2 开始孵育后，应尽快准备脱盐柱，因为该过程大约需要 45 分钟。

3. 脱盐柱的制备

  1. 首先准备色谱柱（本示例实验使用3根），通过反复倒置每根柱子数次，使Sephadex G-25树脂在保存缓冲液中充分重悬。将每根柱子固定在夹具架上，静置约5分钟，让树脂自然沉降。
  2. Sephadex G-25树脂沉降后，取下柱子顶部和底部的盖帽，使保存缓冲液在重力作用下自然流出，并在柱子底部出口下方放置收集管以接收流出液，随后弃去。
  3. 待保存缓冲液完全流出后，加入约2.7 mL裂解缓冲液以平衡色谱柱。收集流出液并弃去。重复此步骤3次。最后一次平衡完成后，色谱柱即可用于步骤4.1。

4. 去除PNBM

  1. 完成1小时孵育（步骤2.2）和柱子准备（步骤3）后，将样品加入各柱中。将每根柱子标记为：“kinase rxn”、“GTPγS only”和“PNBM only”。将每个样品全部上样至对应的柱子中。收集并弃去穿流液。
  2. 通过向每根柱子中加入420 µL裂解缓冲液来洗涤样品。使裂解缓冲液流经柱子，收集穿流液并弃去。完成此洗涤步骤后，将收集管置于相应位置以准备收集样品。
  3. 通过向每根柱子中加入500 µL裂解缓冲液进行洗脱。收集含有硫代磷酸化和烷基化CK2底物的穿流液。

5. 免疫沉淀：第一部分

  1. 通过从第 4.3 步收集的各次洗脱液（“激酶反应”、“仅 GTPγS”和“仅 PNBM”）中分别取出 80 µL 作为“洗脱上样对照”样本来准备免疫沉淀样品。从每个样品中取出 80 µL 后，每个样品将剩余约 420 µL。
    1. 将每个样品均分至两个含有各 200 µL 的离心管中。将各管分别标记为：“激酶反应 anti-thiophosphate ester”、“激酶反应 IgG”、“GTPγS anti-thiophosphate ester”、“GTPγS IgG”、“PNBM anti-thiophosphate ester”和“PNBM IgG”。
  2. 向每个标注为 anti-thiophosphate ester 的试管中加入 2.8 µg anti-thiophosphate ester 抗体，向每个标注为 IgG 的试管中加入 2.8 µg 同型对照抗体。将试管置于 4 °C 条件下在旋转仪上孵育 2 小时。
  3. 在步骤 5.2 的 2 小时孵育期最后 15 分钟内，开始准备蛋白 A/G 磁珠。

6. 蛋白A/G琼脂糖微珠的制备

  1. 轻轻涡旋混匀储存管，确保磁珠完全重悬。使用干净的刀片切掉P200移液器吸头的末端，以增大孔径。每管免疫沉淀反应中加入100 µL磁珠悬液至新的1.7 mL微量离心管中。本示例中共需6个离心管。
  2. 在4 °C条件下，以17,500 × g 离心1分钟。吸除上清液并弃去。用200 µL裂解缓冲液重悬磁珠，并短暂涡旋混匀。重复离心和洗涤步骤共3次。
  3. 最后一次洗涤后，将磁珠置于冰上，直至步骤5.2的孵育完成。

7. 免疫沉淀：第二部分

  1. 完成步骤5.2中的2小时孵育后，在4 °C条件下以17,500 × g离心3分钟。离心后，将每个样品中的200 µL加入已洗涤的珠子管中。将管子置于4 °C旋转仪上孵育1小时。
  2. 完成1小时孵育后，在4 °C条件下以17,500 × g离心1分钟。随后从每个样品中移除40 µL上清液，作为“耗竭对照”保存（共6管）。弃去剩余上清液，注意不要扰动珠子。
  3. 向样品中加入200 µL裂解缓冲液，短暂涡旋混匀以洗涤样品。然后在4 °C条件下以17,500 × g离心1分钟。移去上清液并弃去。重复洗涤和离心步骤共3次。操作过程中注意不要扰动珠子。
  4. 完成洗涤步骤后，向每个含珠子的样品中加入50 µL 2×上样缓冲液。对于其余所有样品（“上样对照”、“洗脱上样对照”和“耗竭对照”），各加入8 µL 6×上样缓冲液。
  5. 缓冲液加入管中后，用移液器吹打混匀，随后将所有样品在95 °C加热5分钟，然后进行SDS-PAGE分析。

8. 结果分析与验证

  1. 验证CK2依赖性硫代磷酸化和烷基化是否成功。
    1. 为确定第2.2步中CK2介导的硫代磷酸化效率，取第5.1步收集的“洗脱上样对照”样品15–20 µL，通过12.5%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。
    2. 使用以下抗体探测膜：抗硫代磷酸酯抗体、抗CK2α抗体以及抗GAPDH抗体（或其他合适的上样对照抗体）。若该步骤成功，则“激酶反应”泳道中的抗硫代磷酸酯信号应明显强于另外两个泳道（图2）。
  2. 观察富集的CK2潜在底物并确定蛋白质身份。
    1. 为评估免疫沉淀步骤是否成功，取第7.4步从磁珠洗脱的样品25–30 µL，在另一块12.5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。确保所有设备清洁，并在整个操作过程中佩戴手套，以尽量减少污染。
    2. 用考马斯亮蓝染色凝胶，以观察实验流程各阶段富集的蛋白质（图3）。使用新的剃刀刀片，仔细切下“激酶反应-抗硫代磷酸酯免疫沉淀”泳道中出现的独特条带，并记录其近似的分子量。
    3. 将这些条带送交进行液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS）以鉴定蛋白质（图4）。若针对所鉴定蛋白质的抗体可用，可通过SDS-PAGE及对实验过程中收集的上样、耗竭和免疫沉淀组分进行免疫印迹分析，验证质谱结果（图4）。

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结果

实验流程的示意图见图1。该技术的基本原理在于CK2具有利用GTP进行磷酸基团转移的特殊能力。向细胞裂解液中加入外源性CK2全酶以及GTP类似物GTPγS，可导致内源性CK2底物发生硫代磷酸化。随后用烷基化试剂p-硝基苄基甲磺酸酯（PNBM）处理裂解液，可在这些特定底物蛋白上生成硫代磷酸酯基团，该基团可通过抗硫代磷酸酯抗体进行免疫沉淀，并最终通过质谱法鉴定。图2展示了将CK2和GTPγS加入T98G（胶质母细胞瘤）细胞裂解液后，再加入PNBM所获得的阳性结果。这些结果表明，CK2依赖性的硫代磷酸化及后续的烷基化反应均成功实现。正如预期，仅在含有完整激酶反应体系的泳道中通过Western blot检测到增强的抗硫代磷酸酯信号，而在仅含GTPγS或仅含PNBM处理的样品中则未检测到该信号。图3显示了使用同型对照IgG或抗硫代磷酸酯抗体对免疫沉淀并洗脱的蛋白进行考马斯亮蓝染色的凝胶图谱...

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讨论

本文介绍了一种相对简单的生物化学方法，用于从复杂的生物样品中鉴定蛋白激酶CK2的底物。该实验方案的关键步骤基于CK2独特的酶学特性，包括利用GTPγS实现CK2依赖性的硫代磷酸化修饰特定底物蛋白，随后进行免疫沉淀及鉴定。我们已在人胶质母细胞瘤细胞和Drosophila卵巢中应用了这一策略，结果证明了该方法的实用性和广泛适用性18。

已有若干先前发表的研究利用定量磷酸化蛋白质组学方法成功鉴定了新的CK2底物19,20,21,22,23。然而，其中一些策略使用了固定化的底物阵列，而固定化蛋白的构象可能导致潜在的磷酸化位点无法被激酶接触。本文所述技术可在更接近生理或天然的环境中（即细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由宾夕法尼亚州卫生部向 T.I.S. 提供的联邦通用研究增强基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 mg/mL PNBMAbcamab13891040.5 µL
2.5 mM GTPγSSigma-AldrichG8634-1MG5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) 小鼠单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-373894Western 印迹检测按 1:1000 稀释
Anti-GAPDH (6C5) 小鼠单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-32233Western 印迹检测按 1:1000 稀释
Anti-核仁素 兔多克隆抗体Abcamab22758Western 印迹检测按 1:1000 稀释
Anti-硫代磷酸酯 [51-8] 兔单克隆抗体Abcamab92570使用量可变（每样品终浓度为 2.8 µg）
预冷至 4ºC 的离心机ThermoScientificSorvall Legend Micro 21R 货号 75-772-436 
cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂Roche11836170001
裂解缓冲液见下方配方见下方配方30 mL
正常兔 IgG 抗体（同型对照）Cell Signaling Technology2729S 使用量可变（每样品终浓度为 2.8 µg）
PD MiniTrap 柱GE Healthcare28-9180-103 根柱
Protein A/G Plus 琼脂糖微珠Santa Cruz Biotechnologysc-2003600 µL
重组人 CK2 全酶New England BiolabsP6010S2.7 µL
旋转混合仪Labnet: Mini LabrollerMini Labroller 货号 H5500
T98G 人胶质母细胞瘤细胞ATCCCRL-1690
预热至 30ºC 的水浴锅Shel LabH20 Bath 系列 型号 SWB15

参考文献

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