利用一种通用的生化方法鉴定新型CK2激酶底物

摘要

本实验方案的目的是对来自复杂生物样品（如细胞裂解液或组织匀浆）中的蛋白激酶CK2底物进行标记、富集和鉴定。该方法利用了CK2生物学特性的独特之处来实现这一目标。

摘要

研究激酶与其底物之间的关系对于全面理解这些酶在生理和病理状态下的功能及其下游靶点至关重要。CK2是一种在进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，其已知底物数量不断增加，已达数百种，参与多种细胞过程。由于CK2具有多效性，识别并表征一组全面的CK2底物一直极具挑战性，也是当前研究这一重要激酶的主要障碍。为应对这一挑战，我们设计了一种多功能实验策略，可实现对潜在CK2底物的靶向富集与鉴定。该方案利用CK2独特的双重共底物特异性，使其能够在细胞或组织裂解液中特异性地对底物进行硫代磷酸化修饰。随后，这些底物蛋白经过烷基化、免疫沉淀，并通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行鉴定。我们此前已成功应用该方法从黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中鉴定出CK2底物，本文中进一步将该方案拓展至人胶质母细胞瘤细胞，展示了该方法在多种模式生物和实验体系中研究该激酶生物学功能的广泛适用性。

引言

蛋白激酶是信号转导级联反应中的关键组分。这些酶对底物蛋白的磷酸化可引发生物学反应，调控细胞分裂、代谢、分化等重要生命过程。CK2是一种普遍表达的嗜酸性丝氨酸/苏氨酸激酶，在从酵母到人类的物种中均保守，参与多种细胞过程，包括转录调控、细胞周期进程以及凋亡^1,2,3。该酶是由两个催化性α（或α'）亚基和两个调节性β亚基组成的异源四聚体⁴。除了具有高度多效性外，CK2还表现出另外两个异常特性，使其研究变得复杂，即组成型活性⁵和双辅底物特异性⁶。后一特性使CK2能够利用ATP和GTP作为磷酸化底物蛋白的磷酸供体。

在小鼠中敲除CK2的催化亚基或调节亚基会导致胚胎致死，表明其在发育和器官形成过程中发挥着至关重要的作用^7,8。CK2在多种癌症中也存在过表达，因此被视为一个有前景的治疗靶点^9,10,

方案

注意：确保所需材料已准备齐全并经过适当处理（参见材料表）。

1. 准备

1. 机械裂解组织样本（1-2 mg 组织加入 100 µL 裂解缓冲液，表 1）或培养细胞（一个 10 cm 培养皿，汇合度为 80-90%，加入 350 µL 裂解缓冲液），目标是为实验收集总共 900 µL 样本。注意，此体积略高于下述实验所需量。
2. 在 4 °C 条件下，以 17,500 × g 离心 3 分钟，使样品沉淀。离心完成后，将上清液各 270 µL 转移至三个新的 1.7 mL 微量离心管中。每管中约剩余 90 µL。从中取出 40 µL 作为“输入对照”并置于新管中。将所有样品置于冰上。

2. 激酶活性检测：硫代磷酸化与烷基化

1. 将三个各装有 270 µL 液体的离心管分别标记为：“kinase rxn”、“GTPγS only”和“PNBM (p-nitrobezyl mesylate) only”。准备激酶反应。
   1. 向“kinase rxn”管中加入 2.7 µL（相当于 1,350 U）的 CK2，然后加入 2.7 µL 的 2.5 mM GTPγS。
   2. 向“GTPγS only”管中加入 2.7 µL 的 2.5 mM GT....

结果

实验流程的示意图见图1。该技术的基本原理在于CK2具有利用GTP进行磷酸基团转移的特殊能力。向细胞裂解液中加入外源性CK2全酶以及GTP类似物GTPγS，可导致内源性CK2底物发生硫代磷酸化。随后用烷基化试剂p-硝基苄基甲磺酸酯（PNBM）处理裂解液，可在这些特定底物蛋白上生成硫代磷酸酯基团，该基团可通过抗硫代磷酸酯抗体进行免疫沉淀，并最终通过质谱法鉴定。图2展示了将CK2和GTPγS加入T98G（胶质母细胞瘤）细胞裂解液后，再加入PNBM所获得的阳性结果。这些结果表明，CK2依赖性的硫代磷酸化及后续的烷基化反应均成功实现。正如预期，仅在含有完整激酶反应体系的泳道中通过Western blot检测到增强的抗硫代磷酸酯信号，而在仅含GTPγS或仅含PNBM处理的样品中则未检测到该信号。图3显示了使用同型对照IgG或抗硫代磷酸酯抗体对免疫沉淀并洗脱的蛋白进行考马斯亮蓝染色的凝胶图谱.......

讨论

本文介绍了一种相对简单的生物化学方法，用于从复杂的生物样品中鉴定蛋白激酶CK2的底物。该实验方案的关键步骤基于CK2独特的酶学特性，包括利用GTPγS实现CK2依赖性的硫代磷酸化修饰特定底物蛋白，随后进行免疫沉淀及鉴定。我们已在人胶质母细胞瘤细胞和Drosophila卵巢中应用了这一策略，结果证明了该方法的实用性和广泛适用性¹⁸。

已有若干先前发表的研究利用定量磷酸化蛋白质组学方法成功鉴定了新的CK2底物^{19,20,21,22,23}。然而，其中一些策略使用了固定化的底物阵列，而固定化蛋白的构象可能导致潜在的磷酸化位点无法被激酶接触。本文所述技术可在更接近生理或天然的环境中（即细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mg/mL PNBM	Abcam	ab138910	40.5 µL
2.5 mM GTPγS	Sigma-Aldrich	G8634-1MG	5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) 小鼠单克隆抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-373894	Western 印迹检测按 1:1000 稀释
Anti-GAPDH (6C5) 小鼠单克隆抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-32233	Western 印迹检测按 1:1000 稀释
Anti-核仁素 兔多克隆抗体	Abcam	ab22758	Western 印迹检测按 1:1000 稀释
Anti-硫代磷酸酯 [51-8] 兔单克隆抗体	Abcam	ab92570	使用量可变（每样品终浓度为 2.8 µg）
预冷至 4ºC 的离心机	ThermoScientific	Sorvall Legend Micro 21R 货号 75-772-436
cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂	Roche	11836170001
裂解缓冲液	见下方配方	见下方配方	30 mL
正常兔 IgG 抗体（同型对照）	Cell Signaling Technology	2729S	使用量可变（每样品终浓度为 2.8 µg）
PD MiniTrap 柱	GE Healthcare	28-9180-10	3 根柱
Protein A/G Plus 琼脂糖微珠	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003	600 µL
重组人 CK2 全酶	New England Biolabs	P6010S	2.7 µL
旋转混合仪	Labnet: Mini Labroller	Mini Labroller 货号 H5500
T98G 人胶质母细胞瘤细胞	ATCC	CRL-1690
预热至 30ºC 的水浴锅	Shel Lab	H20 Bath 系列 型号 SWB15