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使用细胞外通量分析仪检测原代培养小鼠新生心肌细胞的耗氧率

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DOI：

10.3791/59052

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2019年2月13日

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

本文内容

摘要

本实验方案的目的是阐述如何利用小鼠新生心肌细胞作为模型系统，研究各种因素对心脏耗氧量的影响。

摘要

线粒体和氧化代谢对于维持心肌功能至关重要。研究表明，线粒体功能障碍是心力衰竭中心脏功能受损的重要促成因素。相反，恢复受损的线粒体功能可能对改善衰竭心脏的心功能具有有益作用。因此，研究线粒体功能的调控机制并鉴定新的调控因子，有助于深入了解并为开发治疗心脏病的新治疗靶点提供依据。本文中，采用一种独特的细胞培养系统来分析心肌细胞的线粒体呼吸。首先，已优化了一种快速分离和培养高活力新生小鼠心肌细胞的方案。随后，使用96孔板式细胞外通量分析仪评估这些心肌细胞的耗氧率。在本方案中，我们优化了细胞接种条件，并证明新生小鼠心肌细胞的耗氧率可方便地通过细胞外通量分析仪进行测定。最后，我们指出，本方案可拓展应用于更大规模的培养以及其他研究，如细胞内信号传导和收缩功能分析。

引言

为了维持持续的心肌收缩功能，心肌细胞必须持续提供以ATP为主要形式的细胞能量1。在心脏中，约95%的ATP由线粒体通过氧化磷酸化过程产生，表明线粒体在心脏功能中发挥关键的生物能量作用2,3。支持这一观点的证据是，线粒体功能失调可导致心肌病和心力衰竭4,5。相反，恢复线粒体功能已被证明可改善衰竭心脏的心功能6,7。因此，研究线粒体生物能量学的机制并鉴定心肌细胞中线粒体功能的新调控因子，不仅有助于揭示心脏能量生成的机制，还可能为开发治疗心脏病的新治疗靶点提供重要线索6,8。

与包含心肌细胞和非心肌细胞混合物的完整心脏相比9，心肌细胞培养物纯度极高，来自心脏的非心肌细胞（如成纤维细胞和内皮细胞）污染极少10。此外，与从成年心脏分离细胞相比，从新生仔鼠中分离心肌细胞可在较短时间内获得大量细胞10,11。最重要的是，原代培养的成年小鼠心肌细胞存活时间较短（例如24小时），在较长时间培养后会发生去分化。而新生小鼠心肌细胞在体外培养中可存活并进行操作长达7天以上，使其成为研究药物化合物和基因操作对心肌细胞线粒体功能影响的理想模型10。当然，成年细胞与新生细胞之间存在显著的生物学差异，但新生细胞更长的可培养时间使其适用于多种不同类型的研究，包括线粒体功能的研究。

迄今为止，原代培养的新生小鼠和大鼠心肌细胞已被用作研究心脏生物能量学的模型12,13。近年来，研究者利用细胞外通量分析仪测量氧消耗率（OCR），以评估新生小鼠和大鼠心肌细胞的氧化能力14,15。与大鼠相比，新生小鼠心肌细胞的细胞活力较低且变异性更大16。然而，由于能够研究基因工程小鼠模型来源的细胞，小鼠细胞模型具有重要意义。鉴于OCR研究对细胞数量和接种密度极为敏感，因此亟需建立一种可重复、可靠且简便的实验方案，以获得稳定且一致的细胞产量和细胞活力。

本文报道了一种经过优化的实验方案，该方案采用培养的小鼠新生心肌细胞结合96孔板式细胞外通量分析仪进行耗氧率（OCR）分析。该方案显著提高了实验的可重复性。此外，该方案不仅提供了一种新颖且可重复的OCR分析方法，还可扩展至更大规模的培养体系，以满足其他实验需求，例如研究肌原纤维功能和细胞内信号通路。

具体而言，本方案描述了一种在96孔细胞培养板中分离和培养新生小鼠心肌细胞的一日操作流程。此外，还介绍了使用细胞外通量分析仪测定氧气消耗量的操作步骤。所有使用的溶液均为无菌或经无菌过滤处理，所有工具均用75%乙醇灭菌。我们为实验各步骤提供了 材料表。在心肌细胞培养过程中，所有操作均在标准细胞培养生物安全柜中进行。本方案适用于从一窝新生小鼠（约8–10只仔鼠）中分离心脏组织，但也可根据需要调整用于多窝仔鼠心肌细胞的分离。

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方案

进行新生小鼠实验时，请参照所在大学或研究机构的动物护理项目制定的本地指南，并遵守所在机构及其他适用的法规。本方案中描述的所有方法均已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并符合联邦和州的相关法规。

1. 试剂的准备

  1. 准备 25 mL 预消化液：将胰蛋白酶（0.5 mg/mL）加入不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS 中。使用 0.22 µm 滤器过滤灭菌，置于冰上保存直至使用。实验当天配制预消化液。
    注意：必须使用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS，因为 Ca2+ 和 Mg2+ 会导致心肌细胞在分离过程中收缩并继而发生细胞死亡。
  2. 准备 30 mL 胶原酶消化缓冲液：将胶原酶（0.8 mg/mL，约 350 U/mL）溶解于不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS 缓冲液中。使用 0.22 µm 滤器过滤灭菌，置于冰上保存直至使用。实验当天配制胶原酶消化液。
  3. 准备 500 mL 心肌细胞培养基（生长培养基）：混合 375 mL DMEM、125 mL M-199、25 mL 马血清和 12.5 mL 胎牛血清。添加 1% 青霉素和 1% 链霉素溶液。
  4. 准备 线粒体应激测试培养基：配制 200 mL 基于 DMEM 的应激测试培养基（不含 NaHCO3 的 DMEM，参见材料表），并补充 1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM 葡萄糖和 2 mM Hepes。
    注意：使用不含丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、葡萄糖和 Hepes 的 DMEM 配制 1 L 培养基，过滤灭菌后于 4 °C 保存。实验当天通过添加其他试剂配制应激测试培养基。使用不含 NaHCO3 的 DMEM 至关重要。
  5. 使用当天将线粒体应激测试培养基的 pH 调整至 7.4。使用前将培养基预热至 37 °C。
  6. 准备 寡霉素：在 DMSO 中配制 5 mL 的 5 mM 储存液，分装为 250 µL 每份，于 -20 °C 保存。
  7. 准备 FCCP：在 DMSO 中配制 5 mL 的 5 mM 储存液，分装为 250 µL 每份，于 -20 °C 保存。
  8. 准备 抗霉素 A：在 DMSO 中配制 5 mL 的 5 mM 储存液，分装为 250 µL 每份，于 -20 °C 保存。
  9. 准备 鱼藤酮：在 DMSO 中配制 5 mL 的 5 mM 储存液，分装为 250 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    注意：本实验方案中使用的所有试剂和溶液均列于表 1中。

2. 收集并预消化新生小鼠（出生第1天）的心脏

  1. 高压灭菌剪刀、镊子和Moria匙以进行消毒。
  2. 所有步骤均须在细胞培养罩内进行，以保证无菌环境。
  3. 分装 5 mL HBSS（不含 Ca2+，Mg2+将适量溶液加入6孔细胞培养板的每个孔中，置于冰上。取10 mL HBSS分装至10 cm细胞培养皿中。
  4. 在50 mL无菌锥形管中配制20 mL胰蛋白酶预消化液。所有溶液均需置于冰上保存。
  5. 将新生（第0天）小鼠在70%乙醇溶液中快速浸渍以进行消毒。
  6. 使用无菌直剪刀对幼崽进行断头处理（无需麻醉），然后沿胸骨打开胸腔，以暴露胸腔和心脏。图1A)
    注意： 1) 使用出生0天的新生小鼠对于获得高细胞存活率至关重要。2) 根据美国国立卫生研究院（NIH）和美国兽医医学协会（AVMA）指南，该安乐死方法适用于新生动物。 17.
  7. 用精细剪刀从体内取出心脏，并立即转移至含有HBSS（不含Ca）的无菌细胞培养皿中2+，Mg2+) (图1B).
  8. 去除残留的肺组织和较大的血管， 等等。 （如有需要，可保留心房）。用HBSS溶液轻轻振荡洗涤心脏。
  9. 用精细剪刀将每颗心脏剪成8片，并用镊子将所有心肌组织转移至6孔细胞培养板的一个孔中，加入HBSS图1C 和 1D).
  10. 用Moria勺将心脏在盛有HBSS的6孔板各孔之间转移，清洗心脏图1D).
    注意： 将心脏从一个孔转移到另一个孔即可洗去血液。由于血液会干扰酶消化过程，因此用HBSS清洗心脏并去除血液非常重要。
  11. 用Moria勺将心脏转移至含有20 mL胰蛋白酶（0.5 mg/mL）的锥形管中，在4°C下轻轻振荡孵育4 h（图1E).

3. 准备96孔培养板（第1天）

  1. 配制5 mL包被液：含0.5%明胶（使用前需高压灭菌）和1%纤连蛋白溶液的PBS。（例如，5 mL明胶溶液加入50 µL纤连蛋白溶液）
  2. 将50 µL包被液分装至96孔细胞培养板的每孔中（参见材料表）。如有气泡，可用20 µL移液器吸取去除。
    注意：必须确保包被液完全覆盖每孔的整个表面。
  3. 将培养板置于37 °C细胞培养箱中孵育1小时或更长时间，使基质包被干燥。
  4. 在接种心肌细胞前，吸除残留的包被液。

4. 细胞的酶消化与接种（第1天）

  1. 将胶原酶消化液在 37 °C 水浴中预热。
    注意：此步骤对于实现高效的酶消化至关重要。
  2. 将含有心脏和预消化液的锥形管从 4 °C 转移至细胞培养操作台。（图 1F）
  3. 让心脏沉降至管底，使用 10 mL 血清移液管吸除预消化液（可残留 1 至 2 mL 分离培养基在管中）。
  4. 向管中加入 10 mL HBSS。使用 10 mL 血清移液管用 HBSS 重悬心脏 2–3 次，以洗去胰蛋白酶。吸除 HBSS（可残留 1 至 2 mL 在管中）。
  5. 向含有心脏的管中加入 10 mL 预热的胶原酶消化液。（图 1G）
  6. 将含有心脏的管置于 37 °C 水浴中孵育 10 分钟，期间不进行震荡（第一次消化）。
  7. 第一次消化后，将管转移至细胞培养操作台。使用 10 mL 血清移液管在管内轻柔地重悬心脏 10 次，进行轻柔吹打。此操作可使心脏组织分散，并释放细胞。（图 1H）
    注意：由于心肌细胞较为脆弱，轻柔吹打对维持高细胞活力至关重要。
  8. 让未消化的组织沉降，将富含心肌细胞的消化液（约 9–10 mL）转移至新的锥形管中，并立即加入等体积的细胞培养基以终止胶原酶消化反应。
  9. 向含有剩余未消化心脏组织的管中加入 10 mL 胶原酶消化液。
  10. 将含有心脏组织的管置于 37 °C 水浴中孵育 10 分钟（第二次消化）。
  11. 重复步骤 4.7 和 4.8。
    注意：如果仍有大量未消化组织，可再重复一次消化。但在大多数情况下，两次消化已足以从心脏组织中分散出大部分细胞。
  12. 将无菌细胞筛（100 µm 尼龙滤网）置于新的无菌 50 mL 锥形管上。用 2–3 mL 细胞培养基预润湿细胞筛，并使细胞悬液通过细胞筛过滤。再用 2–3 mL 细胞培养基冲洗细胞筛。（图 1I）
  13. 将含有心肌细胞的锥形管在 180 × g 条件下离心 5 分钟（图 1J）。吸除上清液（图 1K），上清液中含有组织碎片，然后用 10 mL 细胞培养基重悬细胞沉淀（图 1L）。
  14. 轻柔重悬细胞，并将细胞接种至一个 10 cm 细胞培养皿（未包被的普通塑料培养皿）中，在细胞培养箱中孵育 1 小时（第一次预接种）（图 1M）。此预接种步骤可使非心肌细胞（如成纤维细胞和内皮细胞）黏附于未包被的培养皿表面。
    注意：此时心肌细胞通常呈圆形，在显微镜下具有光泽。（图 1N）
  15. 1 小时孵育后，轻柔振荡培养皿，用 10 mL 血清移液管反复吹打培养基，洗下未贴壁的细胞（富含心肌细胞），并将细胞悬液转移至另一个新的 10 cm 细胞培养皿（未包被的普通塑料培养皿）中，在细胞培养箱中继续孵育 1 小时（第二次预接种）。
    注意：贴附在未包被培养皿上的细胞主要为非心肌细胞：成纤维细胞和内皮细胞，可在显微镜下观察到（图 1O）。
  16. 第二次预接种后，轻柔振荡培养皿，洗下未贴壁的细胞（心肌细胞），并将其转移至一个新的 50 mL 锥形管中。

5. 细胞计数及将细胞接种至96孔细胞培养板（第1天）

  1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  2. 用多通道移液器将细胞接种至包被有细胞外基质的96孔细胞培养板中，每孔接种密度为 10–30 × 103 个细胞，终体积为200 µL（图1P）。A1、A12、H1和H12孔用于设置背景对照：向这些孔中加入200 µL培养基（与其他孔相同，不加细胞）。将培养板置于37 °C细胞培养箱中孵育。
    注意：本研究中，采用不同的细胞密度检测耗氧量，例如10 × 103、20 × 103或30 × 103个细胞/孔（图2A）。此外，如前所述，刚分离的心肌细胞通常呈圆形，在显微镜下具有光泽。活细胞在培养16–24小时后会逐渐变平。

6. 使用96孔板式细胞外通量分析仪进行耗氧量检测（第2天）

注意：细胞铺板后一天或更晚即可进行耗氧量检测。采用本方案培养的新生心肌细胞在分离后可存活长达7天。

  1. 在检测前至少将通量分析仪传感器盒（见材料表）水合3小时，理想情况下应水合一整天。向校准板的每个孔中加入200 µL校准液（见材料表），将传感器盒放回校准板上，并在37°C、无CO2和O2补充的培养箱中孵育。
  2. 在检测前一小时将细胞培养基更换为线粒体应激测试培养基。心肌细胞较为脆弱，因此需使用多通道移液器轻柔地吸除原有培养基，并用200 µL预温的线粒体应激测试培养基洗涤细胞两次。第二次洗涤后，加入175 µL预温的线粒体应激测试培养基，并将细胞置于37°C、无CO2和O2补充的培养箱中继续培养。
  3. 配制浓缩的测试化合物。用于线粒体应激测试时，分别在3.0 mL线粒体应激测试培养基中配制16 µM寡霉素、9 µM FCCP，以及20 µM鱼藤酮与20 µM抗霉素A的混合液。
    注意：上述浓度的每种化合物均已通过测试。然而，建议在各自实验室中对每种化合物进行浓度滴定优化。
  4. 使用多通道移液器将每种化合物各25 µL加入传感器盒的加样孔中（图1Q）。各化合物的加样体积及终浓度详见表2。
  5. 设置细胞外通量检测程序。程序参数详见表3。
  6. 启动程序。首先将传感器盒放入仪器中进行校准（图1R）。校准步骤完成后，将校准液更换为检测用培养板。
    注意：使用制造商提供的软件，标明各孔分组以及每种化合物及其对应的加样孔。
  7. 如需后续分析，检测结束后可小心使用多通道移液器弃去全部检测培养基，并将细胞培养微孔板储存于-20 °C，以备后续通过蛋白测定进行细胞归一化处理。
  8. 测定蛋白含量。每孔加入50 µL标准RIPA细胞裂解液（见材料表）。将培养板置于冰上孵育30分钟，以充分裂解细胞。将全部裂解物转移至新的透明平底96孔检测板中。
  9. 根据制造商说明书，采用BCA法测定蛋白浓度。
    注意：由于细胞外基质包被会导致各孔中出现较高的背景蛋白浓度，因此需减去空白孔（无细胞）的蛋白值，以获得实际的细胞蛋白浓度。在96孔培养板中，来源于细胞的蛋白浓度通常较低。此外，由于细胞外基质包被的不均一性，各孔间的蛋白浓度可能存在差异。因此，建议使用细胞数量对氧耗率（OCR）进行归一化处理。

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结果

采用所述方案，从出生第0天的新生乳鼠中分离心脏。每只乳鼠可获得5 × 105个细胞，并将心肌细胞以每孔10 × 103、20 × 103或30 × 103个细胞的密度接种于96孔板中（图2A）。过夜培养后，心肌细胞已良好贴附于包被的塑料表面，未贴壁细胞极少（未贴壁细胞仍呈圆形且发亮，而健康贴壁细胞则已铺展开）（图2A和B）。此时，可清晰观察到自发性收缩的心肌细胞。接种密度为30 × 103个细胞/孔时，细胞铺展后于接种后一天即达到汇合状态。由于圆形（死亡）细胞数量极低，结果表明该方案可获得高活力的心肌细胞。为验证上述结论，使用抗肌节α-肌动蛋白（α-actinin）抗体对心肌细胞进行免疫染色，该蛋白为心肌细胞特异性标志物18。如

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讨论

本研究建立了一种分离和培养小鼠新生心肌细胞的简易方案。利用这些心肌细胞，我们还优化了使用细胞外通量分析系统测定耗氧率的实验条件。该方案使得研究者能够将小鼠新生心肌细胞作为模型系统，研究各种因素如何改变心脏主要工作细胞的耗氧量，其结果类似于在完整器官中所测得的数据。我们的方案与先前发表的方案16,18有所不同：首先，为了获得较高的细胞存活率，仅使用出生即刻的幼鼠（即P0），而非其他方案中常用的出生后0至3天（P0至P3）的幼鼠16,19；其次，为了缩短实验时间，心脏仅用胰蛋白酶预消化4小时。此外，为了简化操作流程并获得可重复的结果，我们尽可能减少了实验步骤。例如，本方案仅使用两种缓冲液（PBS和HBSS）、一种细胞培养基，并且在胶原酶消化过程中不进行振荡。

为了获得高活力的新生小鼠心肌细胞（这对OCR实验的可重复性至关重要），有几个关键要点。首先，使用...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Ross 实验室和 Murphy 实验室的所有成员。本研究由美国心脏协会（14SDG17790005）资助 Y.C.，美国国立卫生研究院（HL115933、HL127806）和退伍军人事务部杰出奖（BX003260）资助 R.S.R.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗霉素ASIGMAA8674抑制线粒体复合体III
100 μm孔径细胞筛FALCON352360用于捕获未消化的组织
II型胶原酶WorthingtonLS004176用于配制胶原酶消化液
D-葡萄糖SIGMA75351用于配制线粒体应激检测培养基
高糖DMEMLife technologies11965-092用于配制细胞培养基
不含NaHCO3、葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺和HEPES的DMEMSIGMAD5030-10X1L用于配制线粒体应激检测培养基
FCCP（羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙）SIGMAC2920解偶联线粒体呼吸
胎牛血清（FBS）Life technologies26140-079用于配制细胞培养基
牛血浆纤维连接蛋白SIGMAF1141-5MG用于配制组织培养板包被液
精细剪刀Fine Sciences Tools14060-10用于心脏解剖
猪皮明胶SIGMAG-1890用于配制组织培养板包被液
HBSS（Hank's平衡盐溶液，不含Ca2+、Mg2+）Cellgro21-022-CV用于清洗心脏以及配制预消化和胶原酶消化液
HEPES（1 M）Fisher scientific15630080用于配制线粒体应激检测培养基
马血清Life technologies26050-088用于配制细胞培养基
L-谷氨酰胺SIGMAG-3126用于配制线粒体应激检测培养基
M-199Cellgro10-060-CV用于配制细胞培养基
Moria刮匙Fisher scientificNC9190356用于清洗心脏 
寡霉素SIGMA75351-5MG抑制线粒体ATP合酶
RIPA裂解缓冲液Fisher scientific89900用于细胞裂解以进行蛋白检测
鱼藤酮SIGMAR8875抑制线粒体复合体I
Seahorse XFe96 细胞外通量
分析仪		Agilent用于分析耗氧速率的设备
Seahorse XFe96 FluxPak试剂盒Agilent102601-100包含通量分析仪用培养板、传感器微孔板和校准液的套装
丙酮酸钠SIGMAP2256用于配制线粒体应激检测培养基
直剪Fine Sciences Tools91401-12用于心脏解剖
0.2 μm孔径注射器滤器用于消化液的无菌过滤
胰蛋白酶USB Corporation22715 25GM用于配制预消化液

参考文献

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