应用先进的体外培养技术研究人类肠道微生物群

摘要

本文介绍了一种在体外培养结肠肠道微生物群的实验方案, 使用一系列生物反应器模拟胃肠道的生理条件。

摘要

人类肠道微生物群在健康与疾病中均发挥着至关重要的作用。由于其结构复杂，且与哺乳动物各组分存在广泛关联，使用体内模型研究肠道微生物群具有较大难度。本实验方案的目标是在体外培养肠道微生物群，从而可在无需考虑哺乳动物微环境影响的前提下，研究肠道微生物群的动态变化。通过采用体外培养技术，可模拟胃肠道的生理条件，包括pH、温度、厌氧环境以及转运时间等参数。通过添加黏蛋白包被的载体以模拟结肠的肠黏膜表面，形成黏膜相，从而增加模型的复杂性。通过接种人粪便样本引入肠道微生物群。在接种这一复杂的细菌混合物后，特定微生物会在体外模型的不同纵向（升结肠、横结肠和降结肠）及横向（管腔相和黏膜相）环境中被选择性富集。关键步骤是使系统达到稳态，即微生物群落及其代谢产物保持稳定。本文的实验结果展示了接种后的肠道微生物群如何随时间逐步发展为稳定的群落结构。一旦达到稳态，该系统可用于分析细菌间的相互作用与群落功能，或用于检测各类添加剂（如食物、食物成分或药物）对肠道微生物群的影响。

引言

肠道微生物群是定植于人体胃肠道（GIT）中的一群微生物。  该微生物群在结肠中的浓度最高，估计含有 10¹³-10¹⁴ 个细菌，来自 500 至 1,000 个物种，与结肠微环境处于共生状态^1,2。肠道微生物群的组成和功能在胃肠道内沿空间分布发生变化，形成具有区域特异性的微生物群落，其中远端区域的多样性最高^2,3,4,5。在每个解剖区域，管腔内和黏膜层上分别存在独立的微生物群落⁶。管腔中的微生物群可更直接地获取随管腔内容物移动的营养物质作为底物⁷。尽管如此，部分细菌优先定植于黏液层，利用结肠细胞产生的黏蛋白作为能量来源^1,5,8。管腔相与黏膜相之间微环境的差异导致了微生物群落的分化，并促进了相特异性群落的形成。这些微生物群落共同发挥代谢功能，如营养物质代谢和维生素合成，以及免疫功能，例如抑制人类病原体的定植^1,3,9。肠道微生物群在功能上还与人体结肠细胞协同作用³。

作为人体胃肠道（GIT）的重要组成部分，肠道微生物群对宿主的健康和疾病状态具有影响也就不足为奇了^3,9,10,11,12。肠道微生物群落的变化已与多种人类疾病相关，包括肠易激综合征（IBD）和肠易激综合征（IBS）等胃肠道疾病，也包括肥胖、循环系统疾病和自闭症等其他疾病^3,9,10,11,12。  肠道微生物群产生的代谢物具有全身性影响，可作用于远离肠道的部位^12,13。例如，肠-脑轴与焦虑和抑郁等精神障碍相关¹⁴。因此，研究肠道微生物群对多个研究领域都具有重要意义，并可应用于许多疾病，甚至包括那些通常被认为与胃肠道无关的疾病。

尽管研究肠道微生物群的重要性已被广泛认可，但这一研究领域十分复杂。目前可选用多种动物模型，从小型动物如斑马鱼、大鼠和小鼠，到大型动物如猴子和猪^15-19。然而，将这些动物模型应用于人类肠道微生物群的研究并不直接可行，因为这些动物拥有基于其环境和饮食演化而来的独特细菌群落，且在解剖结构上与人类存在差异^20,21。使用人类受试者虽可消除相关性问题，却带来了另一系列挑战。人类研究成本高昂、耗时较长，并受到伦理限制¹¹。此外，人类研究中存在多种混杂因素会影响肠道微生物群，包括年龄或发育阶段、环境、饮食、药物使用以及遗传因素等^2,4,22。  此外，对于可在人体中进行的实验内容、可采集的样本类型以及采样时间点也存在诸多限制⁴。 

使用该方法的一个关键缺点是 体内 研究肠道微生物群的一个系统性问题是哺乳动物成分的存在。肠道微生物群与人类细胞之间相互作用，且在这一过程中 体内 在该条件下，无法区分两者。肠道微生物群产生的代谢物会被结肠细胞吸收，因此无法精确计算其含量。因此，任何机制性研究都只能局限于终点测量。¹¹体内研究的另一个主要缺点是无法纵向采集胃肠道不同区域的样本²³这无法评估结肠微环境随时间可能发生的变化¹².  许多 体内 研究（包括人体研究）依赖于粪便样本的分析，以检测肠道微生物群的变化¹²虽然这一方法具有一定的信息量，但它无法提供整个胃肠道中肠道微生物群的数据，也无法区分管腔内微生物群落与黏膜相关微生物群落。^5,6,7,8.

对于肠道微生物群，需要采用体外方法来研究细菌群落的动态变化，从而避免哺乳动物成分的干扰。使用体外方法可严格控制环境条件¹⁰，同时测试多个参数，并能够进行纵向且大体积的取样¹¹。由于体外方法依赖机械装置而非宿主，因此无需考虑年龄、环境、饮食或遗传背景等因素。这些系统可用于测试完整的肠道微生物群落、特定选定的微生物，甚至单一菌株。重要的是，体外实验结果具有可重复性，同时仍保持与体内研究相当的多样性水平^11,22。

根据所研究的假设和期望的结果，i体外 研究可以通过多种方式进行。  它们可以采用单容器系统和简单方法，例如将样品与粪便匀浆液共同孵育。²⁴ 或在24-48小时内进行单批次培养²⁵也可以使用单容器系统和更复杂的方法来实现，例如利用恒化器系统建立稳定的肠道微生物群落¹¹然而，使用单一反应器可能会过度简化微生物群落¹² 因为它仅代表结肠的一个部分，尽管结肠由升结肠、横结肠和降结肠组成。

为了研究结肠不同区域（升结肠、横结肠和降结肠）中形成的肠道微生物群落，可采用一种复杂的多阶段系统。在这些系统中，设置多个反应器以模拟结肠的不同区域，从而分别独立培养升结肠、横结肠和降结肠的肠道微生物群。这些反应器通过泵连接，使底物依次从升结肠区域流向横结肠区域，再流向降结肠区域，模拟营养物质在胃肠道中的流动过程。

本研究的目的是展示如何利用五阶段体外培养系统（见材料表）来培养肠道微生物群落，并展示该群落在稳定性和组成方面的群落动态。在该系统中，一个反应器代表胃，另一个代表小肠。结肠被分为三个区域（升结肠、横结肠、降结肠），每个区域由一个独立的反应器表示²⁶。在本实验设计中，两个完整的系统并行运行，其中1号单元含有黏蛋白载体以模拟黏膜表面，2号单元则不含黏蛋白载体。通过16S rRNA基因测序和短链脂肪酸（SCFA）分析，比较了各区域腔内相和黏膜相中形成的微生物群落随时间的变化，并与粪便接种物进行对比。所呈现的结果展示了此类体外系统能够产生的微生物群落类型，包括其组成和功能特性。

方案

1. 材料与准备

注意：该化学成分明确的培养基以粉末形式购买（参见材料表）。每升培养基的成分为：阿拉伯半乳聚糖（1.2 g）、果胶（2.0 g）、木聚糖（0.5 g）、葡萄糖（0.4 g）、酵母提取物（3.0 g）、特殊蛋白胨（1.0 g）、黏蛋白（2.0 g）、盐酸半胱氨酸（0.2 g）。

1. 配制限定培养基
   1. 取一个 4 L 的烧瓶，加入 2 L 双蒸去离子水。
   2. 向水中加入 29.2 g 限定培养基粉末，搅拌至完全均一。
   3. 放入磁力搅拌子，并将瓶盖轻轻拧上，不要拧紧。
   4. 在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
   5. 冷却后，将配制好的限定培养基置于 4 °C 冰箱中，并持续搅拌（使用磁力搅拌器）保存。
2. 配制胰液
   1. 在装有搅拌子的 5 L 容器中加入 2 L 蒸馏去离子水，在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
   2. 灭菌后，让水冷却至室温。
   3. 加入 12.5 g NaHCO₃、6 g 胆汁和 0.9 g 胰酶，置于磁力搅拌器上混合。
      注意：胰液应每 2–3 天新鲜配制一次，配制后需在冰箱中持续搅拌保存。
3. 磷酸盐缓冲液
   1. 将装有磁力搅拌子的 1 L 烧瓶置于磁力搅拌器上，加入 0.5 L 蒸馏去离子水，并开启搅拌。
   2. 随后加入 6.8 g KH₂PO₄、8.8 g K₂HPO₄ 和 0.1 g 硫代乙醇酸钠，加水定容至 1 L。
   3. 待各组分完全溶解后，用 NaOH 调节 pH 至 7.0。
   4. 将缓冲液倒入带螺口盖的 2 L 容器中，在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。注意瓶盖应轻轻拧上，不可完全密封。
   5. 从高压灭菌器中取出后，让溶液冷却至室温。缓冲液可在室温下保存最多 2 周。
4. 制备黏蛋白琼脂载体
   1. 将塑料黏蛋白载体（见材料表）、镊子、塑料网（管状）和扎带在 131 °C 下高压灭菌 30 分钟。
   2. 将 300 mL 双蒸去离子水在 131 °C 下高压灭菌 30 分钟，灭菌后于室温保存备用。
   3. 在具有层流的生物安全柜中，使用无菌镊子将无菌培养皿中放入塑料黏蛋白载体。
      注意：黏蛋白载体为中空塑料圆环，内部填充黏蛋白琼脂。填充后可盖上盖子，暂存备用。
   4. 配制黏蛋白琼脂时，向 300 mL 灭菌水中加入 3 g 细菌琼脂和 15 g 猪黏蛋白。
   5. 在通风橱中将该溶液煮沸，随后移离热源并冷却 1 分钟。重复煮沸和冷却过程共 3 次。
   6. 当盛有黏蛋白琼脂溶液的玻璃容器冷却至可触碰时，将其转移至具有层流的生物安全柜中。
   7. 在具有层流的生物安全柜中，将液态黏蛋白琼脂倒入已放置塑料黏蛋白载体的培养皿中，确保所有载体均被完全填充。
   8. 将培养皿盖重新盖上，在层流条件下冷却。
   9. 组装黏蛋白载体时，取已灭菌的塑料网，用无菌镊子将培养皿中已凝固的黏蛋白琼脂载体插入网中。
   10. 使用扎带封闭网的两端。这样网袋可将填充了黏蛋白琼脂的载体固定其中。4 °C 保存至使用。

2. 系统的设置、接种与运行

1. 培养系统的建立
   注意： 本研究采用了人类肠道微生物生态系统双模拟器。
   1. 将10个含有搅拌子的生物反应器置于磁力搅拌器上，并开启搅拌。
      注意： 每个单元包含5个生物反应器，因此2个单元需要10个生物反应器。
   2. 使用硅胶管通过蠕动泵将5个生物反应器依次串联连接图1）。使用泵将流体内容物从一个生物反应器转移至下一个生物反应器。
   3. 将生物反应器按以下顺序标记：胃、小肠、升结肠、横结肠、降结肠，以代表胃肠道的顺序。
      注意： 生物反应器可以完全相同，或者胃和小肠生物反应器相较于结肠生物反应器更小，因为其容纳的体积较小。以这种方式设置生物反应器意味着升结肠区域从小肠获得营养物质，横结肠区域从升结肠区域获得营养物质，降结肠区域从横结肠区域获得营养物质。通过这种方式，该系统模拟了营养物质在胃肠道中的顺序性移动。
   4. 将限定培养基和胰液置于4 °C冰箱中，并使用磁力搅拌器持续搅拌。使用硅胶管，通过蠕动泵将限定培养基连接至胃生物反应器，同时通过蠕动泵将胰液连接至小肠。
   5. 向尿液引流袋中加入固化剂。通过蠕动泵将降结肠与尿液引流袋连接。实验过程中将固化的物质作为生物废弃物处理。
   6. 使用硅胶管依次连接每个容器的水套，并将两端连接至循环水浴。向循环水浴中加入蒸馏水（加水量因所用循环水浴的类型而异），并设置温度为 37 °C。
   7. 使用硅胶管，通过蠕动泵将酸液和碱液分别连接到每个容器的盖子上。推荐的浓度为 0.5 M HCl 和 0.5 M NaOH。
   8. 将pH探针通过瓶盖上指定的孔口插入每个容器中。该孔口用于固定pH探针，并可旋紧在瓶盖上图1）。各区域pH设置如下：胃部，pH = 2；小肠，pH = 6.7–6.9；升结肠，pH = 5.6–5.9；横结肠，pH = 6.15–6.4；降结肠，pH = 6.6–6.9。
      注意： 在初始阶段，群落将根据区域pH值的差异进行分化。然而，一旦开始喂养循环，群落将依据营养物质输入的差异进一步成熟。
   9. 使用硅胶管将氮气管路连接至各容器盖上的指定接口。氮气管路的流向应按以下顺序：胃、小肠、升结肠、横结肠、降结肠。确保每个单元具有独立的冲洗系统，以避免交叉污染。
      注意： 使用氮气去除系统中的氧气，并在实验过程中维持厌氧环境。
   10. 通过每个生物反应器盖子上的指定端口插入金属取样管。该金属管向下延伸至生物反应器内部，用于采集液体样品。
   11. 在样品管的顶端连接一小段硅胶管，并接上鲁尔锁接头，以便采样时使用注射器。
2. 系统的接种
   1. 使用以下体积的定义培养基填充结肠各段：升结肠500 mL，横结肠800 mL，降结肠600 mL。
   2. 将黏蛋白琼脂载体按反应器体积比例添加至结肠区域。本实验中，每个反应器使用60个载体。
   3. 使用样品管和注射器移除多余的限定培养基，因为添加载体后会升高生物反应器中的液位。
   4. 打开 pH 探头，通过计算机调节每个反应器中的 pH 值。
   5. 打开氮气冲洗，持续20分钟。
      注意： 用于接种的粪便匀浆购自10%粪便在10%甘油溶液中匀浆的产品（参见 材料表粪便样本从符合以下标准的供体池中随机选取：年龄在21至45岁之间、过去至少一年内未使用抗生素、体重指数（BMI）正常（18.5–24.9）、摄入典型西方饮食（非纯素食或素食）的美国人。本实验方案仅使用单一供体，但可根据实验设计进行调整。
   6. 接种前，按照生产商的说明解冻粪便匀浆。
   7. 通过取样口，使用60 mL注射器（升结肠25 mL，横结肠40 mL，降结肠30 mL）将粪便匀浆按反应器体积的5%加入，对每个结肠反应器进行接种。
   8. 在生物反应器中过夜培养，同时控制pH值。
   9. 过夜培养后，按照下文第3节所述，采集各结肠区域的管腔液体样本。采样完成后，启动计算机程序开始喂养。
3. 每日喂养周期
   注意： 每日喂食周期由计算机自动控制。
   1. 每天三次，向胃生物反应器中泵入 140 mL 定义培养基，并孵育 1 小时。
   2. 孵育1小时后，将胃内容物泵入小肠。同时，将60 mL胰液泵入小肠。
   3. 在小肠中，调节pH至6.7–6.9，使混合物孵育90分钟。孵育期间，对每个系统开启氮气冲洗，每次共10分钟。
   4. 90分钟孵育后，同时启动从小肠到升结肠、升结肠到横结肠、横结肠到降结肠以及降结肠到废液端的泵。
4. 实验时间线
   注意： 这 此处使用的体外系统以连续方式运行，持续时间约为8周。以下为推荐的实验时间表，但可根据实验的具体需求和目标进行调整。
   1. 按照步骤2.1中列出的步骤建立系统。
   2. 根据以下方案收集过夜培养的样品。按照上述方案，开始每日三次的传代培养周期。
   3. 进行实验，总共持续2周，以使细菌达到稳定状态。
      注意： 运行系统意味着维持pH值，每日进行三次喂养循环，并每周更换黏膜载体2-3次。
   4. 稳定后，以对照期进行为期2周的实验。
   5. 对照期结束后，使用该系统测试不同组分或变量，此阶段称为处理期。
   6. 处理期结束后，停止添加任何组分或变量，并将条件恢复至正常状态。此阶段称为洗脱期，用于判断对群落造成的变化是否具有持久性。

3. 从系统中采集样本

注意：在实验过程中，可根据以下指南，在任何时间点从任一区域的管腔相或黏膜相中采集样本。

1. 采集管腔样本
   1. 通过延伸至培养液中部的取样口采集管腔液体样本。首先使用70%乙醇或小型酒精棉片清洁取样口的鲁尔锁接口，并静置使其自然干燥。
   2. 确保30 mL注射器内无空气后，将其连接至取样口。反复抽吸3–5次，以充分混匀反应器内的组分。随后，抽取总共30 mL的培养液。
   3. 根据需要将管腔样本分装至无菌离心管中，并置于冰上保存。取样完成后，立即将样本转移至-80 °C超低温冰箱中保存。
   4. 用于短链脂肪酸（SCFA）分析时，取15 mL管腔样本在4 °C、5,000 × g 条件下离心10分钟。使用PES材质的0.2 μm滤膜对上清液进行注射器过滤。将滤过的上清液于-80 °C保存。
      1. 用于DNA分析时，取1 mL管腔液体在4 °C、5,000 × g 条件下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物于-80 °C保存。
      2. 作为备份，大多数实验建议额外保存10 mL管腔液体于-80 °C。
2. 采集黏膜样本
   注意：每2–3天更换一次黏膜载体。
   1. 从冰箱中取出预先准备好的黏蛋白载体。
   2. 开启氮气冲洗，并迅速打开反应器盖子。取出50%的黏蛋白载体，并替换为新的载体。
   3. 迅速密封盖子，并持续通入氮气冲洗20分钟。
   4. 用于DNA提取时，将0.25–0.5 g琼脂分装至2 mL离心管中，保存于-80 °C直至使用。

4. DNA 提取、测序与分析

注意：采用CTAB DNA提取法并在通风橱中进行物理匀浆来提取DNA²⁹。提取后，使用分光光度计测定每个样本中DNA的含量。

1. 配制CTAB缓冲液
   1. 将4.2 g K₂HPO₄ 和4.09 g NaCl 溶解于200 mL去离子蒸馏水中，然后在121 °C下高压灭菌30分钟。
   2. 让溶液冷却至室温。
   3. 加入10 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），在60 °C下加热并搅拌。
   4. 待CTAB完全溶解后，将溶液从热源移开，并冷却至室温。
2. 配制PEG-6000溶液
   1. 将300 g聚乙二醇6000和93.5 g NaCl溶解于1 L去离子蒸馏水中。
   2. 待所有颗粒完全溶解后，在121 °C下高压灭菌30分钟。
   3. 灭菌后，将溶液冷却至室温后再使用。
3. 进行DNA提取
   1. 向2 mL样品管中加入500 μL CTAB缓冲液和500 μL苯酚-氯仿-异戊醇，涡旋混匀。
   2. 将样品管中的全部内容物转移至0.1 mm物理匀浆管中（见材料表）。
   3. 使用物理匀浆器在最高转速下匀浆20秒，重复两次，中间间隔20秒（见材料表）。
   4. 将匀浆后的管子在3,000 x g下离心5分钟。
   5. 将300 μL上清液转移至一个新的1.7 mL洁净离心管中，并向原管中加入500 μL CTAB缓冲液。
   6. 按照步骤4.3.2–4.3.3的方法再次匀浆该管，并在3,000 x g下离心5分钟。
   7. 离心后，再将300 μL上清液转移至已含有600 μL液体的新管中。
   8. 向含有600 μL上清液的管中加入总共600 μL氯仿-异戊醇。
   9. 颠倒混匀管子，短暂离心，然后将500 μL上层相转移至一个新的1.7 mL洁净离心管中。确保仅吸取上层相。
   10. 接着，向管中加入1000 μL PEG-6000溶液，颠倒混匀，然后在室温下孵育2小时。
   11. 孵育结束后，在18,200 x g、4 °C条件下离心10分钟。
   12. 弃去上清液，并用预冷的70%乙醇清洗沉淀。
   13. 再次在18,200 x g、4 °C条件下离心10分钟，弃去上清液，将沉淀置于生物安全柜的层流条件下干燥。
   14. 沉淀干燥后，向每管中加入75 μL无RNA酶、无DNA酶、无菌的水。
   15. 使用分光光度计对重悬的DNA进行定量，随后送样进行16S rRNA基因测序。

5. 短链脂肪酸（SCFA）检测与分析

1. 将冷冻样品在40°C下解冻30分钟，并使用乙醚以2:1（v:v）的比例提取短链脂肪酸。
2. 将有机相转移至配备色谱柱（30 m，0.25 mm内径，0.25 µm，参见材料表）的气相色谱-质谱联用仪（GC/MS，参见材料表），进样量为10 µL。
3. 设置进样口温度和初始柱温分别为260 °C和125 °C。保持初始温度1分钟，随后在11.5分钟内升至250 °C，柱流速为1 mL/min。
   注意：质谱离子源温度为220°C，接口温度为250°C。
4. 使用标准曲线并以2-甲基己酸作为内标物，定量各短链脂肪酸（SCFA）的含量。

结果

上述方案描述了用于研究结肠肠道菌群的五阶段体外系统的建立、接种及运行过程。为生成下述数据，在DNA提取后，采用高通量测序技术（如, 费城儿童医院微生物组中心通过 MiSeq Illumina 平台²⁷QIIME（Quantitative Insight into Microbial Ecology）版本 1.9²⁸ 用于处理测序数据，并在 R 统计计算环境中进行统计分析²⁹分类学指派使用Greengenes 16S参考数据库生成^30,31OTU相对丰度值通过将OTU的读数数量除以样本中的总读数数量来计算。SCFA水平采用所述方案进行定量。

体外...

讨论

已开发出体外培养系统用于研究大肠的肠道微生物群。这些系统采用专门设计的装置，模拟胃肠道的生理条件，促进结肠各区域成熟肠道微生物群落的生长³³。尽管这一概念合乎逻辑且易于理解，但实际运行用于研究肠道微生物群的体外培养系统需要精确操作，并充分了解获得可靠结果所必需的条件和预期要求。

体外肠道微生物群实验所需满足的条件是：接种后微生物群落必须达到稳定状态，并且必须维持粪便接种物中的微生物多样性。如果实验操作得当，这两个必要条件能够被快速且可重复地实现。实验方案中影响系统稳定性和多样性的关键步骤包括：定义培养基和胰液的配制必须准确，且这些底物的供给需保持一致；实验过程中必须维持厌氧条件；各肠段的pH值必须在时间进程中精确控制。实验期间若上述三个参数发生改变，可能导致微生物种群波动以及代谢产物生成的不一致。

使用此类多阶段体外系统具有多种优势。值得注意的是，它们能够模拟结肠的不同区域。此外，这些系统还可被设计用于模拟食物在上消化道中的体外消化过程，包括来自唾液的酶组分，以及胰酶和胆汁的添加...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TWINSHIME	Prodigest	NA
定义培养基（含淀粉的成人M-SHIME生长培养基）	Prodigest	NA
Masterflex 软管	cole Parmer	NA
尿液引流袋	Bard	NA
Labsorb	Sigma-Aldrich	NA
粪便样本	Openbiome	NA
注射器	Becton Dickson	NA
定义培养基	Prodigest	NA
牛胆盐（Oxgall Bile）	Becton Dickson	NA
胰酶（Pancreatin）	Sigma-Aldrich	NA
玻璃器皿	Ace Glass	NA
猪黏蛋白（Porcine mucin）	Sigma-Aldrich	NA
细菌学琼脂	Sigma-Aldrich	NA
灭菌袋	VWR	NA
BeadBug	Benchmark Scientific	NA
Triple-Pure 高强度氧化锆珠击打管，0.1 mm	Benchmark Scientific	NA
无RNA酶、无DNA酶、无菌水	Roche	NA
岛津 QP2010 Ultra 气相色谱-质谱联用仪	Shimadzu	NA
Stabilwax-DA 色谱柱，30 m，0.25 mm 内径，0.25 µm	Restek	NA
塑料黏蛋白载体	Prodigest	NA