一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

摘要

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。

摘要

细菌的毒力基因通常在转录水平上受到多种因子的调控，这些因子可响应不同的环境信号。某些因子直接作用于毒力基因；另一些则通过调节下游调控因子的表达或影响调控因子活性的信号分子的积累，从而控制致病过程。尽管在 体外 生长过程中，关于感染期间基因表达如何调节的信息仍十分有限。当特定基因产物被视为潜在治疗干预靶点时，这类信息尤为重要。转录水平的研究方法，如定量实时RT-PCR和RNA-Seq，能够在全基因组范围内检测基因表达，但面临诸多技术挑战，包括细菌RNA丰度远低于宿主RNA，以及样本易被RNase降解等问题。利用荧光报告系统评估基因调控相对简便，并可与具有独特光谱特性的荧光蛋白实现多重检测。该方法能够对具有复杂三维结构及影响细菌调控网络的理化梯度的组织中，进行单细胞水平的时空动态基因表达分析。而基于群体平均数据的传统方法则会丢失此类信息。本文中，我们描述了一种定量检测细菌病原体基因表达的方法 原位该方法基于简单的组织处理及对报告蛋白荧光的直接观察。我们通过检测以下基因的表达，验证了该系统的实用性 Staphylococcus aureus 核酸酶（thermonuclease）nuc），其基因产物在体外和体内均对免疫逃逸及完全毒力至关重要。我们证明 nuc-gfp 在肾脓肿中高表达，并显示出异质性基因表达，部分原因在于明显的空间调控 nuc 在完全激活免疫反应的脓肿中启动子活性。该方法可应用于具有可操作遗传系统的任何细菌及任何感染模型，为临床前研究和药物开发提供有价值的信息。

引言

细菌通过差异性表达适应和生存所需的基因，来响应生理条件的变化以及环境中营养状态的改变。例如，机会性病原菌通常以相对较低的密度定植于宿主体表，且往往无害。然而，一旦细菌突破了物理和化学屏障，就必须应对宿主免疫细胞的防御反应以及营养物质的受限供应¹。以Staphylococcus aureus为例，该菌可无症状地定植于约三分之一的人群中，但同时也是严重的皮肤和软组织感染、骨髓炎、心内膜炎及菌血症的致病原因²。S. aureus作为病原菌的成功之处，通常归因于其代谢灵活性，以及一系列与表面相关或可分泌的毒力因子，这些因子使细菌能够逃逸血液循环并在外周组织中复制^3,4,5。由于金黄色葡萄球菌引发的疾病若导致宿主死亡，将使其自身陷入进化上的死胡同，并限制其向新宿主传播⁶，因此对毒力因子产生的投入必须受到严格调控。

一个由蛋白质和非编码RNA组成的复杂调控网络可响应多种环境刺激，包括细胞密度、生长阶段、中性粒细胞相关因子以及营养物质的可利用性，以确保毒力基因在宿主组织内的特定时间和空间精确表达

方案

本文所述所有方法均已获得乔治城大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 荧光报告菌株的构建

1. 使用EcoRI和SmaI限制性内切酶对基因组整合型pRB4载体进行连续酶切。根据制造商的说明书，先用SmaI在25 °C下对1 µg pRB4进行过夜消化，然后加入EcoRI，在37 °C下继续酶切反应1小时。通过在65 °C孵育20分钟使酶失活。
2. 从基因组DNA中PCR扩增目标调控区（本例中为包含嗜热核酸酶[nuc]启动子区域的约350个碱基对的DNA片段），并在扩增片段的5'端引入EcoRI限制性位点，3'端引入SmaI限制性位点。SmaI识别序列必须与翻译起始密码子保持阅读框一致。本研究中，使用高保真DNA聚合酶，按照制造商推荐条件，以正向引物oRB015（5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3'）和反向引物oRB016（5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'）进行PCR扩增，退火温度为53 °C。使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化所得片段。
3. 将上述PCR产物按照步骤1.1的方法用EcoRI和SmaI进行酶切，并使用T4 DNA连接酶将酶切后的DNA片段连接至pRB4的相应位点，构建整合型重组质粒。将连接产物转化至E. coli中，并验证构建序列的正确性。
4. 如前所....

结果

我们开发了一种源自 pMAD 的质粒³² 可通过双交换同源重组将任意报告基因融合构建体导入染色体图1）。该载体可用于对任何能够支持GFP蛋白表达并产生高于背景水平荧光信号的调控区域进行定量分析。该质粒具有氨苄青霉素抗性（Ap^r用于维持和扩增 E. coli 并赋予红霉素抗性（Em^r) 在 S. aureus 该质粒还赋予氯霉素抗性（Cm^r），从而便于在各种突变菌株之间转移整合的报告基因融合片段，以进行复杂的遗传学分析 S. aureus

作为概念验证，我们将 nuc 调控区到 gfp. nuc 因其基因产物是实现完全毒力所必需的，并且在限制巨噬细胞方面也发挥必要作用 金黄色葡萄球菌-.......

讨论

细菌感染性疾病由于获得抗生素耐药决定子，已成为全球日益严重的健康问题⁴⁶由于病原体在感染过程中适应宿主环境对其生长和存活至关重要，因此靶向调控可增强病原体适应性的基因表达程序可能具有治疗潜力。其中一个关键的基因表达程序是由SaeR/S双组分系统（TCS）调控的一组基因，先前研究已证实该系统在免疫逃逸中发挥着至关重要的作用。⁴⁷SaeR/S 可被多种因素诱导，其中最显著的是与中性粒细胞相关的因素^8,20感染期间 S. aureus 引发强烈的炎症反应，导致中性粒细胞和其他吞噬细胞被募集到感染部位²继发液化性坏死和纤维蛋白沉积，形成脓肿以防止进一步的组织损伤⁴⁸在这些免疫豁免部位内， S. aureus 细胞利用多种依赖Sae的基因产物重编程脓肿，以促进细菌增殖^5<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5% 绵羊血	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal）	ThermoScientific	R0402
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 小鼠	Charles River	NA
氯霉素	Sigma-Aldrich	C-0378
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	NA
冷冻切片机	Thermo Scientific	NA
培养瓶盖	VWR International	2005-02512
D+2:25NA 寡核苷酸	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202S
红霉素	Sigma-Aldrich	E5389
流式分析仪	Becton Dickinson	NA
玻璃珠	Sigma	Z273627
质粒小量提取试剂盒	Promega	A1220
旋转水浴摇床	New Brunswick Innova	NA
PCR 产物纯化试剂盒	QIagen	28106
磷酸盐缓冲液（PBS）	Cellgrow	46-013-CM
酶标仪	Tecan	NA
Precellys 24 匀浆器	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA 聚合酶	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
限制性内切酶	New England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI)
逆转录酶	New England BioLabs	E6300L
Sanger 测序	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero 透明组织冷冻介质	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
带滤器注射器	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	膜通透性核酸染料
四环素	Sigma-Aldrich	T7660
胰蛋白胨大豆肉汤	VWR	90000-376
紫外-可见分光光度计	Beckman Coulter-DU350	NA
含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1500