基于荧光的感染组织细菌基因调控方法

摘要

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌种群中发生的表型多样性提供了资源, 以应对感染过程中的组织环境。

摘要

细菌毒力基因通常在转录水平上受到多种因素的调节, 这些因素对不同的环境信号做出反应。一些因素直接作用于毒力基因;其他人则通过调整下游调节器的表达或影响调节器活动的信号的积累来控制其发病机制。虽然在体外生长过程中对调节进行了广泛的研究, 但对感染期间如何调整基因表达的了解相对较少。当特定的基因产品是治疗干预的候选产品时, 这样的信息很重要。转录方法, 如定量, 实时 rt-pcr 和 rna-seq 是在全球范围内检查基因表达的有力方法, 但也面临许多技术挑战, 包括细菌 rna 的低丰度相比, 和样本由 rnase 降解。使用荧光记者评估调节相对容易, 并且可以使用具有独特光谱特性的荧光蛋白进行多路复用。该方法允许对表现出复杂的三维结构和影响细菌调控网络的物理化学梯度的组织中的基因表达进行单细胞、时空分析。当数据对大宗人口进行平均时, 就会丢失此类信息。在此, 我们描述了一种定量基因表达的方法,在细菌病原体中的原位。该方法基于简单的组织处理和对报告蛋白荧光的直接观察。我们通过检查金黄色葡萄球菌的表达证明了该系统的效用, 其基因产物是免疫逃避和体内完全毒性所必需的。我们发现, 核酸-gfp在肾脏脓肿中表达强烈, 并揭示异质性基因表达的部分原因是明显的空间调节的酶启动子活性与免疫反应。该方法可应用于任何具有可操纵遗传系统和任何感染模型的细菌, 为临床前研究和药物开发提供有价值的信息。

引言

细菌通过不同表达适应和生存所需的基因来应对环境中不断变化的生理条件和营养状态的变化。例如, 机会性病原体在体型相对较低的地方对体表进行殖民, 而且往往是无害的。然而, 一旦细菌已经穿透物理和化学屏障, 它必须与宿主免疫细胞的反防御和限制营养的可用性¹。例如, 金黄色葡萄球菌在大约三分之一的人口中进行了无症状的殖民, 但也是造成破坏性皮肤和软组织感染、骨髓炎、心内膜炎和菌血^{症 2}的原因。金黄色葡萄球菌作为病原体的成功通常归功于其代谢灵活性, 以及一系列与表面相关和分泌的毒力因子, 使细菌能够逃离血液并在外周组织^{中复制3,4,5}。由于葡萄球菌病引起的宿主死亡是进化的死胡同, 限制了对新宿主⁶的传播, 因此必须谨慎控制对毒力因子生产的承诺。

一个复杂的蛋白质调节网络和非编码 rna 响应各种环境刺激, 包括细胞密度、生长阶段、中性粒细胞相关因素和营养物质的供应, 以确保毒力基因在宿主组织内的精确时间和位置^7、8

方案

这里描述的所有方法都得到了乔治敦大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 荧光记者应变的产生

1. 用 ecori 和 smai 限制性酶依次消化基因组整合性 rb4 载体。按照制造商的协议, 在25°c 下使用1μg 的 prb4 建立一个隔夜消化, 然后在37°c 下通过在反应混合物中添加 ecori 进行1h 的第二次消化。在65°c 孵育 20分钟, 使酶失活。
2. pcr 扩增了基因组 dna 感兴趣的调控区域 (在这种情况下, 包含热松糖启动子区域的约 350个碱基对 dna 片段), 包含了一个 5 ' ecri 限制位点和一个 3 ' smai 限制位点。smai 识别序列必须在具有平移起始密码子的框架内。在这项研究中, pcr 是根据制造商的建议使用高保真 dna 聚合酶进行的, 具有正向引物 oRB015 (5 '-atcattcattcattctaatttaatatatatatatatatatatac-3 ') 和反向引物 orb016 (5 '-gggcatactaactcttttttttagt3-3 ')。退火温度为53°c。按照制造商的说明, 使用 pcr 清理工具包纯化生成的片段。
3. 按照步骤1.1 中的规定, 用 ecori 和 smai 消化产生的 pRB4 产物, 并按照制造商的建议, 使用 t4 dna 连接酶将被消化的 dna 片段连接到同样的 prb....

结果

我们开发了一种从 pmad³²中提取的质粒, 它可以通过双交叉同源重组将任何记者融合结构传递到染色体中 (图 1)。这种结构允许对支持在背景上生产 gfp 蛋白和荧光信号的任何监管区域进行定量分析。质粒赋予安培耐药 (apr),用于大肠杆菌的维持和繁殖, 并赋予金黄色葡萄球菌红霉素耐药性 (em^r) .该结构还具有耐氯霉素 (cm r), 从而可以方便地转移各种突变株之间的综合报告融合, 以便在金黄色葡萄球菌中进行复杂的遗传分析。

作为原理的证明, 我们将其调控区融合到gfp.得共选择了, 因为它的基因产物是完全毒力所必需的, 并且是限制金黄色葡萄球菌引起的脓肿42的巨噬细胞.......

讨论

由于获得抗生素耐药性决定因素⁴⁶, 细菌传染病是全世界日益严重的健康问题。由于适应宿主环境对于感染过程中的生长和生存至关重要, 因此针对提高病原体适应性的基因表达程序的策略可能会被证明是有用的治疗方法。其中一个程序是由 SaeR/S s 双组分系统 (tcs) 控制的一组基因, 以前所显示的在免疫逃避中起着至关重要的作用47。SaeR/S 是由多种因素引起的, 最显著的是与中性粒细胞^{8、20 有关}的因素。在感染过程中,金黄色葡萄球菌引起强烈的炎症反应, 在这种反应中, 中性粒细胞和其他吞噬细胞被招募到感染部位 2。液化坏死和纤维蛋白沉积接踵而至, 形成脓肿, 以防止进一步的组织损伤⁴⁸。在这些免疫特权位点内,金黄色葡萄球菌细胞使用一些依赖于 sae 的基因产物来重新编程脓肿, 以促进细菌繁殖 5<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5% 羊血	Hardy Diagnostics （Santa Maria， CA）	A10
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β;-D-吡喃半乳糖苷 （X-Gal）	ThermoScientific	R0402
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 小鼠	Charles River	NA
氯霉素	Sigma-Aldrich	C-0378
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	NA
低温恒温器切片机	Thermo Scientific	NA
Culture， Cap	VWR International	2005-02512
D+2：25NA 寡核苷酸	整合 DNA 技术（爱荷华州克拉尔维尔）	NA
DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202S
红霉素	Sigma-Aldrich	E5389
流动分析仪	Becton Dickinson	NA
玻璃珠	Sigma	Z273627
Miniprep，质粒	Promega	A1220
轨道振荡水浴	New Brunswick Innova	NA
PCR 纯化	QIagen	28106
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Cellgrow	46-013-CM
酶标仪	Tecan	NA
Precellys 24 匀浆器	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript （Piscataway， NJ）	NA
Q5 Taq DNA 聚合酶	New England Biolabs （Ipswich， MA）	M0491S
限制性内切酶	新England Biolabs （马萨诸塞州伊普斯维奇）	R0150S （PvuI）、R3136S （BamHI）、R0144S （BglII）、R3131S （NheI）、R0101S （EcoRI）、R0141S （SmaI）。
逆转录酶	New England BioLabs	E6300L
Sanger 测序	Genewiz（马里兰州日耳曼敦）	NA
Sub Xero 透明组织冷冻培养基	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Superloop	GE Lifesciences	18111382
注射器，过滤器	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	膜通透性核酸染色
四环素	Sigma-Aldrich	T7660
胰蛋白酶大豆肉汤	VWR	90000-376
紫外可见分光光度计	Beckman Coulter-DU350	NA
Vector Laboratories	H-1500		Vectashield 抗淬灭封片剂