合成用于制备位点选择性修饰免疫偶联物的巯基反应性试剂及其生物偶联方法

摘要

在本实验方案中，我们将描述PODS的合成方法。PODS是一种基于苯并恶二唑基甲基砜的试剂，可用于将载荷分子位点选择性地连接到生物分子（尤其是抗体）的巯基上。此外，我们还将描述含PODS的双功能螯合剂的合成与表征，以及其与一种模型抗体的偶联过程。

摘要

多年来，含马来酰亚胺的双功能探针已被用于生物分子（尤其是抗体）中巯基的位点选择性修饰。然而，基于马来酰亚胺的偶联物在体内稳定性有限，因为琥珀酰亚胺硫醚键可能发生逆迈克尔反应。这可能导致放射性载荷的释放，或其与循环中含巯基生物分子的交换。上述两种过程均可导致健康器官中放射性浓度过高，同时靶组织中放射性浓度降低，从而降低成像对比度和治疗比。2018年，我们报道了一种模块化、稳定且易于获取的苯基噁二唑基甲基砜试剂——命名为“PODS”——作为基于巯基的生物偶联平台。我们已明确证实，基于PODS的位点选择性生物偶联可重复且稳健地生成均一、结构明确、高度免疫反应性和高度稳定的放射免疫偶联物。此外，在结直肠癌小鼠模型中的临床前实验表明，这些位点选择性标记的放射免疫偶联物在体内的表现显著优于通过马来酰亚胺偶联法制备的放射标记抗体。在本方案中，我们将描述PODS的四步合成、广泛使用的螯合剂DOTA的含PODS双功能变体（PODS-DOTA）的制备，以及PODS-DOTA与靶向HER2的抗体曲妥珠单抗的偶联过程。

引言

放射性药物化学家长久以来一直利用抗体对疾病生物标志物的选择性和特异性，开展核成像和靶向放射治疗¹。迄今为止，对抗体进行放射性标记最常用的方法是将放射性标记的前体基团或放射性金属螯合剂非特异性地连接到免疫球蛋白结构中的氨基酸（最常见的是赖氨酸）上（图1A）²。尽管该策略确实有效，但其随机、非位点特异性的特点可能引发问题。具体而言，传统的生物偶联方法会产生定义不清且高度异质的免疫偶联物，这些偶联物由成千上万种不同区域异构体的混合物组成，每种异构体都具有独特的生物学和药理学特性³。此外，若偶联物连接在免疫球蛋白的抗原结合域上，随机生物偶联可能损害抗体的免疫反应活性。

多年来，为了解决上述问题，已开发出多种位点特异性与位点选择性生物偶联策略^4,5。其中最常见的方法依赖于含马来酰亚胺的探针与半胱氨酸巯基之间的连接反应（图1B）。IgG1类抗体天然含有4个链间二硫键，这些二硫键可被选择性还原，生成游离的巯基，进而与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应，形成琥珀酰亚胺基硫醚键。使用巯基与马来酰亚胺的偶联方法相比传统技术确实....

方案

1. 4-[5-(甲硫基)-1,3,4-噁二唑-2-基]-苯胺（1）的合成

注意：由于该化合物对光敏感，所有反应均需在用铝箔包裹的容器中进行。

1. 在10 mL圆底烧瓶中，将100 mg（0.517 mmol，1当量）的5-(4-氨基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇溶于3 mL甲醇中。
2. 向该溶液中加入360 μL二异丙基乙胺（DIPEA；2.07 mmol；4当量；无水）和一根小型磁力搅拌子。用橡胶塞密封烧瓶，并在室温下搅拌溶液10分钟。
3. 使用1 mL玻璃注射器，刺穿橡胶塞，迅速向混合物中加入32 μL碘甲烷（0.517 mmol，1当量）。在室温下继续反应45分钟。
   注意：由于碘甲烷可能具有危害性，该反应应在通风橱中进行。
4. 将旋转蒸发仪的水浴温度设定为40 °C，缓慢降低压力以除去溶剂，得到白色固体。
5. 将固体溶于3 mL乙酸乙酯中，使用分液漏斗用5 mL的0.1 M碳酸钠溶液至少洗涤三次。
   注意：定期取水相样品在紫外灯下进行点板检测；当紫外灯下不再观察到物质时，即可停止洗涤。
6. 在分液漏斗中收集有机相，并用水洗涤至水相pH达到6.8–7.0（使用pH试纸检测）。
7. 收集有机相，加入硫酸镁以除去残留的微量水分。
   注意：应使用小刮勺分批加入硫酸镁，随后轻轻旋摇溶液。若干燥剂的细小颗....

结果

本方案的前四个步骤 — 合成 PODS 的 — 已被设计为具有良好的稳健性和可靠性。5-(4-氨基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇的去质子化及取代反应生成目标硫醚产物，可得到该硫醚 >45 分钟后产率高达 99%。接下来，连接反应在 1 通过标准的多肽偶联反应合成了N-Boc-N'-琥珀酰基-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺，得到目标产物的收集（2) ，产率为55%。随后，进行氧化反应 2 使用广泛采用的氧化剂间氯过氧苯甲酸进行，洗涤步骤之后 3 以约90%的产率得到淡色固体。最后，从叔丁氧羰基保护基团的去除 3 按照标准操作进行，使用二氯甲烷与三氟乙酸以4:1的比例混合。水相经冷冻干燥后，得到目标产物——PODS，为白色粉末，产率为98%。通过薄层色谱监测反应进程，并通过以下方法对各产物的结构进行确认： ¹氢核磁共振（H-NMR）.......

讨论

在本报告中，我们选择不包含任何放射性标记或体内实验的方案。原因如下：就前者而言，基于PODS的免疫偶联物的放射性标记与采用其他生物偶联策略合成的免疫偶联物并无区别，相关程序已在其他文献中得到全面综述²；至于后者，临床前体内实验（即小鼠模型、剂量等）的具体细节会因应用领域以及抗体/抗原系统的不同而存在广泛差异。

我们先前对⁸⁹Zr标记的huA33变体的研究，有力地说明了基于PODS的生物偶联技术的优势。huA33是一种靶向A33抗原的人源化IgG1抗体，A33抗原是一种跨膜糖蛋白，在>95%的结直肠癌中表达^23,24。在我们先前发表的论文中²²，报道了采用PODS法和马来酰亚胺法两种生物偶联策略合成⁸⁹Zr-DFO-huA33放射性免疫偶联物的过程。这两种放射性标记抗体——⁸⁹Zr-DFO-PODS-.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-(4-氨基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇	Sigma-Aldrich	675024
1.5 mL 低吸附微量离心管	Eppendorf	925000090
1.5 mL 微量离心管	Fisherbrand	05-408-129
乙腈	Fisher Scientific	A998-4
Amicon Ultra-2 离心过滤装置	EMD Millipore	EN300000141G
环己烷	Fisher Scientific	C556-4
二氯甲烷	Fisher Scientific	AC383780010
二异丙基乙胺	MP Biomedicals, LLC	150915
二甲基亚砜	Fisher Scientific	31-727-5100ML
乙酸乙酯	Fisher Scientific	E145 4
盐酸	Fisher Scientific	A144-500
碘甲烷	Sigma-Aldrich	289566-100G
硫酸镁	Acros Organics	413485000
间氯过氧苯甲酸	Sigma-Aldrich	273031
甲醇	Fisher Scientific	A412 1
NBoc-N′-琥珀酰-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺	Sigma-Aldrich	671401	于 -80 °C 保存
N-乙基-N′-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐	Sigma-Aldrich	3450
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P5493	10× 浓缩液
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	于 -80 °C 保存
PD-10 脱盐柱中的 Sephadex G-25	GE Healthcare	17085101
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S7795
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318-1
TCEP	ThermoFischer Scientific	20490
三乙胺	Fisher Scientific	AC157911000
三氟乙酸	Fisher Scientific	A116-50