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方法文章

合成用于制备位点选择性修饰免疫偶联物的巯基反应性试剂及其生物偶联方法

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DOI：

10.3791/59063

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2019年3月6日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们将描述PODS的合成方法。PODS是一种基于苯并恶二唑基甲基砜的试剂，可用于将载荷分子位点选择性地连接到生物分子（尤其是抗体）的巯基上。此外，我们还将描述含PODS的双功能螯合剂的合成与表征，以及其与一种模型抗体的偶联过程。

摘要

多年来，含马来酰亚胺的双功能探针已被用于生物分子（尤其是抗体）中巯基的位点选择性修饰。然而，基于马来酰亚胺的偶联物在体内稳定性有限，因为琥珀酰亚胺硫醚键可能发生逆迈克尔反应。这可能导致放射性载荷的释放，或其与循环中含巯基生物分子的交换。上述两种过程均可导致健康器官中放射性浓度过高，同时靶组织中放射性浓度降低，从而降低成像对比度和治疗比。2018年，我们报道了一种模块化、稳定且易于获取的苯基噁二唑基甲基砜试剂——命名为“PODS”——作为基于巯基的生物偶联平台。我们已明确证实，基于PODS的位点选择性生物偶联可重复且稳健地生成均一、结构明确、高度免疫反应性和高度稳定的放射免疫偶联物。此外，在结直肠癌小鼠模型中的临床前实验表明，这些位点选择性标记的放射免疫偶联物在体内的表现显著优于通过马来酰亚胺偶联法制备的放射标记抗体。在本方案中，我们将描述PODS的四步合成、广泛使用的螯合剂DOTA的含PODS双功能变体（PODS-DOTA）的制备，以及PODS-DOTA与靶向HER2的抗体曲妥珠单抗的偶联过程。

引言

放射性药物化学家长久以来一直利用抗体对疾病生物标志物的选择性和特异性，开展核成像和靶向放射治疗1。迄今为止，对抗体进行放射性标记最常用的方法是将放射性标记的前体基团或放射性金属螯合剂非特异性地连接到免疫球蛋白结构中的氨基酸（最常见的是赖氨酸）上（图1A）2。尽管该策略确实有效，但其随机、非位点特异性的特点可能引发问题。具体而言，传统的生物偶联方法会产生定义不清且高度异质的免疫偶联物，这些偶联物由成千上万种不同区域异构体的混合物组成，每种异构体都具有独特的生物学和药理学特性3。此外，若偶联物连接在免疫球蛋白的抗原结合域上，随机生物偶联可能损害抗体的免疫反应活性。

多年来，为了解决上述问题，已开发出多种位点特异性与位点选择性生物偶联策略4,5。其中最常见的方法依赖于含马来酰亚胺的探针与半胱氨酸巯基之间的连接反应（图1B）。IgG1类抗体天然含有4个链间二硫键，这些二硫键可被选择性还原，生成游离的巯基，进而与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应，形成琥珀酰亚胺基硫醚键。使用巯基与马来酰亚胺的偶联方法相比传统技术确实有所改进，目前已有多种含马来酰亚胺的合成子和双功能螯合剂可供使用。然而，必须指出的是，该方法也存在严重局限性。基于马来酰亚胺的免疫偶联物在体内稳定性有限，因为硫醚键可能发生逆迈克尔反应（图2）6,7,8,9,10。这可能导致放射性载荷的释放，或其在循环系统中与含巯基的生物分子（如谷胱甘肽或血清白蛋白）发生交换。上述两种过程均可能增加健康器官中的放射性浓度，同时降低靶组织中的放射性浓度，从而导致成像对比度下降和治疗比降低。为克服这些问题，研究人员已开发出若干替代性的巯基反应性试剂，包括甲苯磺酸酯、溴乙酰基和碘乙酰基化合物以及乙烯基砜11,12,13,14,15,16,17。然而，所有这些方法均存在一定的局限性，限制了其广泛应用。

大约五年前，已故的Scripps研究所Carlos Barbas III实验室率先使用苯并恶二唑基甲基砜作为试剂，选择性地与巯基形成高度稳定的连接键（图1C和图3）18,19。作者采用携带苯并恶二唑基甲基砜的荧光素衍生物，对多种经基因工程改造、含有游离半胱氨酸残基的抗体进行修饰，最终获得的免疫偶联物比使用马来酰亚胺类探针构建的类似物具有更高的稳定性。看到这项有前景的工作后，我们感到颇为惊讶：该技术在放射化学领域几乎未被应用，且尚未被用于双功能螯合剂或放射性免疫偶联物的合成20,21。然而，这种应用匮乏的情况很快变得可以理解：我们多次尝试从Sigma-Aldrich采购该试剂，收到的却是复杂的降解产物混合物，其中目标化合物含量<15%。此外，自行合成该报道的试剂也并非现实选择，因为已发表的合成路线较为繁琐，且需要大多数放射化学和分子影像实验室（包括我们实验室）所不具备的复杂有机化学设备。

针对这些障碍，我们着手开发一种易于获取且高度稳定的苯并恶二唑基甲基砜试剂，该试剂可通过一条稳健且相对简便的合成路线获得。今年早些时候，我们报道了开发一种模块化、稳定且易于获取的苯并恶二唑基甲基砜试剂——命名为“PODS”——作为基于巯基的生物偶联平台（图1C 和 图3）22。PODS 与 Barbas 等人报道的试剂之间的关键区别在于，前者在苯并恶二唑基甲基砜结构单元上连接了一个苯胺环，而后者在同一位置则为一个酚环（图4）。这一结构改变使得合成路线更加直接和易于实现，并且——如果我们将市售化合物的经验视为代表性案例——最终试剂也更为稳定。在本研究中，我们还合成了两种携带 PODS 的双功能螯合剂——PODS-DFO 和 PODS-CHX-A''-DTPA——以促进分别用于制备 89Zr 和 177Lu 标记的放射免疫偶联物。正如我们将要讨论的，我们已证明，基于 PODS 的位点选择性生物偶联能够可重复且稳健地生成均一、结构明确、高度免疫反应性且高度稳定的放射免疫偶联物。此外，在结直肠癌小鼠模型中的临床前实验表明，这些通过位点选择性标记制备的放射免疫偶联物在体内的表现优于通过马来酰亚胺偶联方法合成的放射标记抗体。

本研究的总体目标是促进制备结构明确、均一、高度稳定且具有高免疫反应活性的免疫偶联物，以用于体外和体内应用。该合成方法简便，几乎可在任何实验室中进行，且母体PODS试剂可与多种不同的螯合剂、荧光染料或载荷分子进行修饰。在本实验方案及配套视频中，我们将介绍PODS的简单四步合成法（图5）；构建一种携带PODS的DOTA衍生物，DOTA是一种广泛使用的螯合剂，可用于螯合64Cu、68Ga、111In、177Lu和225Ac（图6）；以及将PODS-DOTA与一种模型抗体——靶向HER2的IgG1型曲妥珠单抗（trastuzumab）进行生物偶联（图7）。

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方案

1. 4-[5-(甲硫基)-1,3,4-噁二唑-2-基]-苯胺（1）的合成

注意：由于该化合物对光敏感，所有反应均需在用铝箔包裹的容器中进行。

  1. 在10 mL圆底烧瓶中，将100 mg（0.517 mmol，1当量）的5-(4-氨基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇溶于3 mL甲醇中。
  2. 向该溶液中加入360 μL二异丙基乙胺（DIPEA；2.07 mmol；4当量；无水）和一根小型磁力搅拌子。用橡胶塞密封烧瓶，并在室温下搅拌溶液10分钟。
  3. 使用1 mL玻璃注射器，刺穿橡胶塞，迅速向混合物中加入32 μL碘甲烷（0.517 mmol，1当量）。在室温下继续反应45分钟。
    注意：由于碘甲烷可能具有危害性，该反应应在通风橱中进行。
  4. 将旋转蒸发仪的水浴温度设定为40 °C，缓慢降低压力以除去溶剂，得到白色固体。
  5. 将固体溶于3 mL乙酸乙酯中，使用分液漏斗用5 mL的0.1 M碳酸钠溶液至少洗涤三次。
    注意：定期取水相样品在紫外灯下进行点板检测；当紫外灯下不再观察到物质时，即可停止洗涤。
  6. 在分液漏斗中收集有机相，并用水洗涤至水相pH达到6.8–7.0（使用pH试纸检测）。
  7. 收集有机相，加入硫酸镁以除去残留的微量水分。
    注意：应使用小刮勺分批加入硫酸镁，随后轻轻旋摇溶液。若干燥剂的细小颗粒仍可见，则表明溶液已干燥；若颗粒迅速结块，则需继续少量添加硫酸镁，直至细小颗粒持续可见。
  8. 使用中等孔径的玻璃砂芯漏斗或滤纸过滤混合物。
  9. 用旋转蒸发仪除去挥发性组分，即可得到目标产物，呈白色针状晶体。

2. 叔丁基[18-({4-[5-(甲硫基)-1,3,4-噁二唑-2-基]苯基}氨基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十八烷基]氨基甲酸酯（2）的合成

注意：由于该化合物对光敏感，所有反应均需在用铝箔包裹的容器中进行。

  1. 在25 mL圆底烧瓶中，将387 mg（0.92 mmol，1.0当量）的NBoc-N′-琥珀酰基-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺溶于10 mL二氯甲烷中。
  2. 向该溶液中加入480 μL（2.76 mmol，3当量）的N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）、264 mg（1.38 mmol，1.5当量）的N-乙基-N′-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和200 mg（0.97 mmol，1.1当量）的1。用玻璃塞密封反应容器，并在室温下搅拌反应5天。
    注意：注意防止二氯甲烷挥发。如有需要，可在一周内适时补充溶剂。
  3. 在分液漏斗中用1 M盐酸溶液（3 × 5 mL）洗涤混合物。
  4. 收集有机相，并继续在分液漏斗中依次用1 M Na2CO3溶液（2 × 5 mL）和水（3 × 5 mL）洗涤。
  5. 收集有机相，加入无水硫酸镁以除去残留水分（参见步骤1.7）。使用中等孔径玻璃砂芯漏斗或滤纸过滤混合物。
  6. 使用旋转蒸发仪在减压条件下除去挥发性溶剂，得到浅黄色至近白色固体。
  7. 将该固体重新溶于10 mL乙酸乙酯中，然后通过逐次缓慢加入（例如每次2 mL）共30 mL环己烷，使产物逐步沉淀析出。
  8. 用滤纸或中等孔径玻璃砂芯漏斗过滤溶液，得到白色粉末状产物。

3. 叔丁基[18-({4-[5-(甲磺酰基)-1,3,4-噁二唑-2-基]苯基}氨基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十八烷基]氨基甲酸酯（3）的合成

注意：由于该化合物对光敏感，所有反应均需在用铝箔包裹的容器中进行。

  1. 在10 mL圆底烧瓶中，将30 mg（0.05 mmol；1当量）的2溶解于4 mL二氯甲烷中。
  2. 向该混合物中缓慢加入49 mg（0.2 mmol；4当量）70%间氯过氧苯甲酸，并用玻璃塞盖住反应容器。室温下搅拌过夜，最终得到黄色混合物。
  3. 在分液漏斗中依次用0.1 M NaOH溶液（3 × 5 mL）和水（3 × 5 mL）洗涤黄色混合物。
  4. 用硫酸镁干燥有机相，并通过中等玻璃砂芯漏斗或滤纸过滤混合物。
  5. 使用旋转蒸发仪在减压条件下除去溶剂，得到淡色固体产物。

4. N1-(3-{2-[2-(3-氨丙氧基)乙氧基]-乙氧基}丙基)-N4-{4-[5-(甲磺酰基)-1,3,4-噁二唑-2-基]苯基}丁二酰胺（PODS）的合成

  1. 在25 mL圆底烧瓶中，将30 mg的3溶于2.0 mL二氯甲烷中。
  2. 加入400 μL三氟乙酸，并用玻璃塞密封烧瓶。
  3. 在室温下搅拌反应混合物3小时。
  4. 使用旋转蒸发仪，在减压条件下于室温除去挥发性物质，得到油状残留物。
  5. 将油状残留物溶于7 mL水中，用分液漏斗以乙酸乙酯（3 × 4 mL）洗涤。保留水相。
  6. 将水相冷冻干燥，得到白色粉末状的PODS。
    注：PODS在280 nm和298 nm处的摩尔吸光系数分别为9,900和12,400 cm-1M-1。

5. PODS-DOTA 的合成

  1. 在1.5 mL微量离心管中，将10 mg PODS溶于300 μL二甲基亚砜（0.018 mmol；1当量），加入26 μL N,N-二异丙基乙胺（0.15 mmol；8当量）。
  2. 将15.2 mg DOTA-Bn-NCS（0.02 mmol；1.2当量）溶于100 μL二甲基亚砜中，并将此溶液与步骤5.1中的溶液混合。密封微量离心管。
  3. 在室温下避光孵育过夜。
  4. 采用反相C18高效液相色谱法纯化产物，以去除未反应的DOTA-Bn-NCS。
    注意：保留时间明显依赖于各实验室的高效液相色谱设备（泵、色谱柱、管路等），因此在纯化前应运行适当的对照。然而，作为示例，若使用30分钟内从5:95 MeCN/H2O（均含0.1%三氟乙酸）线性梯度洗脱至70:30 MeCN/H2O（均含0.1%三氟乙酸）、半制备型19 x 250 mm C18 色谱柱、流速6 mL/min的条件，则PODS、p-SCN-Bn-DOTA和PODS-DOTA的保留时间分别约为14.4、18.8和19.6分钟。三种化合物均可在254 nm处进行检测。

6. PODS-DOTA 与曲妥珠单抗的生物偶联

注意：此步骤中，我们使用浓度为 16.4 mg/mL 的曲妥珠单抗储备液。

  1. 在低蛋白结合型1.5 mL微量离心管中，将61 μL曲妥珠单抗储备液（1 mg；6.67 nmol，1当量）用859 μL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释。
  2. 向该混合物中加入 6.7 μL 新配制的 10 mM TCEP 水溶液2O（66.7 nmol，10 当量）。
  3. 将PODS-DOTA溶于DMSO，配制成1 mg/mL的溶液，取73 μL该PODS-DOTA溶液加入反应体系中（66.67 nmol，10当量）。
  4. 密封微量离心管，并在室温下孵育溶液2小时。
  5. 孵育2小时后，使用预装的一次性尺寸排阻脱盐柱纯化免疫偶联物。
    1. 首先，按照供应商的说明平衡尺寸排阻层析柱，以去除储存过程中柱内可能存在的防腐剂。典型的操作步骤是用与柱体积相当的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤柱5次：每次2.5 mL，共5 × 2.5 mL PBS。
    2. 接下来，将反应混合物加入尺寸排阻层析柱中，并记录反应混合物的体积。
    3. 当反应混合物进入层析柱后，加入适量 PBS，使上样至层析柱的溶液总体积达到 2.5 mL。例如，若偶联反应后总体积为 1.3 mL，则需向层析柱中再加入 1.2 mL PBS。
    4. 最后，使用 2 mL PBS 作为洗脱液收集产物。
  6. 使用截留分子量为50 kDa的离心过滤装置浓缩最终的免疫偶联物。

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结果

本方案的前四个步骤 — 合成 PODS 的 — 已被设计为具有良好的稳健性和可靠性。5-(4-氨基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇的去质子化及取代反应生成目标硫醚产物，可得到该硫醚 >45 分钟后产率高达 99%。接下来，连接反应在 1 通过标准的多肽偶联反应合成了N-Boc-N'-琥珀酰基-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺，得到目标产物的收集（2) ，产率为55%。随后，进行氧化反应 2 使用广泛采用的氧化剂间氯过氧苯甲酸进行，洗涤步骤之后 3 以约90%的产率得到淡色固体。最后，从叔丁氧羰基保护基团的去除 3 按照标准操作进行，使用二氯甲烷与三氟乙酸以4:1的比例混合。水相经冷冻干燥后，得到目标产物——PODS，为白色粉末，产率为98%。通过薄层色谱监测反应进程，并通过以下方法对各产物的结构进行确认： 1氢核磁共振（H-NMR）...

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讨论

在本报告中，我们选择不包含任何放射性标记或体内实验的方案。原因如下：就前者而言，基于PODS的免疫偶联物的放射性标记与采用其他生物偶联策略合成的免疫偶联物并无区别，相关程序已在其他文献中得到全面综述2；至于后者，临床前体内实验（即小鼠模型、剂量等）的具体细节会因应用领域以及抗体/抗原系统的不同而存在广泛差异。

我们先前对89Zr标记的huA33变体的研究，有力地说明了基于PODS的生物偶联技术的优势。huA33是一种靶向A33抗原的人源化IgG1抗体，A33抗原是一种跨膜糖蛋白，在>95%的结直肠癌中表达23,24。在我们先前发表的论文中22，报道了采用PODS法和马来酰亚胺法两种生物偶联策略合成89Zr-DFO-huA33放射性免疫偶联物的过程。这两种放射性标记抗体——89Zr-DFO-PODS-...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Sai Kiran Sharma 博士的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-(4-氨基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇Sigma-Aldrich675024
1.5 mL 低吸附微量离心管Eppendorf925000090
1.5 mL 微量离心管Fisherbrand05-408-129
乙腈Fisher ScientificA998-4
Amicon Ultra-2 离心过滤装置EMD MilliporeEN300000141G
环己烷Fisher ScientificC556-4
二氯甲烷Fisher ScientificAC383780010
二异丙基乙胺MP Biomedicals, LLC150915
二甲基亚砜Fisher Scientific31-727-5100ML
乙酸乙酯Fisher ScientificE145 4
盐酸Fisher ScientificA144-500
碘甲烷Sigma-Aldrich289566-100G
硫酸镁Acros Organics413485000
间氯过氧苯甲酸Sigma-Aldrich273031
甲醇Fisher ScientificA412 1
NBoc-N′-琥珀酰-4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺Sigma-Aldrich671401于 -80 °C 保存
N-乙基-N′-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐Sigma-Aldrich3450
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP549310× 浓缩液
p-SCN-Bn-DOTAMacrocyclicsB-205于 -80 °C 保存
PD-10 脱盐柱中的 Sephadex G-25GE Healthcare17085101
碳酸钠Sigma-AldrichS7795
氢氧化钠Fisher ScientificS318-1
TCEPThermoFischer Scientific20490
三乙胺Fisher ScientificAC157911000
三氟乙酸Fisher ScientificA116-50

参考文献

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  3. Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
  4. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
  5. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
  6. Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
  7. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  8. Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
  9. Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
  10. Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
  11. Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
  12. Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
  13. Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
  14. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  15. Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
  16. Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
  17. Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
  18. Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
  19. Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
  20. Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
  21. Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
  22. Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
  23. Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
  24. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
  25. Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  26. Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
  27. Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
  28. Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
  29. Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
  30. Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
  31. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  32. Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  33. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  34. Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
  35. Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
  36. O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
  37. Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
  38. Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).

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